陳 沖，劉 雙，王丹丹，池春玉，2，朱 宏，2，金曉霞，2，丁國華，2

(1.哈爾濱師范大學 生命科學與技術學院，黑龍江 哈爾濱 150025；2.植物生物學黑龍江省高校重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150025)

水楊酸(Salicylic acid，SA)是植物內源性信號分子，參與調節(jié)植物許多生理過程[1-2]。外施SA可以提高植物對鹽[3]、高熱[4]、低溫[5]、干旱[6]、紫外線[7]、重金屬[8]等非生物脅迫的耐受性。

SA在提高植物抗病性方面的作用尤其受到人們的關注[9-10]。SA是植物受到病原菌侵害時發(fā)生超敏反應(Hypersensitive response，HR)以及形成系統獲得性抗性(Systemic acquired resistance，SAR)所需要的內源信號分子[11-12]，阻斷SA的生成或促進SA的分解，都會出現HR的延緩和病斑擴散的現象[13]。有人對辣椒等植物外源施用SA，也有效提高了植株對疾病的抗性和病程相關基因(PR)的表達[14]。

有很多研究證實，SA介導的HR是一個程序性細胞死亡(Programmed cell death，PCD)過程[15-16]。植物發(fā)生HR時，常伴隨著特異性信號分子ROS和SA的積累以及PR的表達，激發(fā)鄰近組織的特異性防御反應和植株的SAR[12]。線粒體在PCD中扮演重要角色[17-18]：有研究表明，線粒體通透性轉運孔(Mitochondria permeability transition pore，MPTP)的開放是PCD中發(fā)生的重要信號之一[19]。MPTP的開放引起線粒體膜電位下降，進一步導致氧化磷酸化作用的解偶聯，膜內外離子濃度趨于平衡，進而導致線粒體外膜被破壞和細胞色素C(Cytochrome C，Cyt C)的釋放，釋放到胞質內的Cyt C可以激活Caspase等下游關鍵酶類，使信號級聯放大而觸發(fā)PCD[20-21]。但近年來人們開始注意葉綠體在PCD中的作用[22]。早在2002年就有報道，氰化物(CN)在光刺激下引發(fā)含葉綠體的豌豆果皮細胞的PCD過程，而不含葉綠體的表皮細胞卻不受影響[22-24]?；钚匝?Reactive oxygen species，ROS)具有信號和觸發(fā)植物PCD的作用，而葉綠體也是ROS的重要來源，因此，葉綠體對植物PCD具有重要作用[25]。

被首先關注的就是ROS的作用。有人發(fā)現，葉綠體通過光合電子傳遞和葉綠素生物合成途徑產生ROS，導致核心天線復合體降解，并激活 Chloroplastic Executer 1、2 蛋白，繼而將信號傳遞到細胞核，激活細胞死亡相關基因的轉錄[26-27]。

盡管植物基因組上沒有找到編碼caspase的基因，但還是找到了一些具有caspase活性的蛋白酶[31-32]，一些定位在葉綠體的蛋白酶和基因開始被關注，其中有的有caspase活性，與PCD關系密切[33-36]。定位在葉綠體膜上的Cid和Lrg蛋白被發(fā)現可以執(zhí)行類caspase活性，在細胞PCD中起作用[37]。

為了獲取更多的與PCD相關的基因信息，植物生物學黑龍江省高校重點實驗室采用數字轉錄表達譜技術獲得了1 759個SA誘導表達的基因[38]，通過基因注釋篩選出15個與葉綠體相關的基因。為了揭示在SA誘導PCD中葉綠體所起的介導作用，本研究在對SA處理前后的黃瓜進行基于活性氧(ROS)原位檢測、臺盼藍(Trypan blue)染色、碘化丙啶(PI)和熒光素二乙酸酯(FDA)染色、轉移酶介導的dUTP缺口末端標記測定法(TUNEL)等PCD鑒定，對15個篩選得到的基因進行RT-PCR、實時熒光定量PCR的表達分析，為研究這些基因的功能和介導PCD中的作用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料培養(yǎng)

以東農649為試驗材料，在光照培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，設置為10 h黑暗、14 h 66%光照的培養(yǎng)條件，溫度分別為24，28 ℃。

1.2 ROS原位檢測

1.3 Trypan blue染色法

取材方法同上，染色方法采用Stone和Bowling的試驗方法[40-41]。把材料浸到Trypan blue染色液中，100 ℃水浴2～3 min后，室溫(25 ℃)靜置1 h，用2.5 g/mL的水合氯醛溶液將材料煮沸20 min，在此過程中需數次更換水合氯醛，至材料完全褪色為止，取材料至50%甘油(V/V)中貯存和裝片，在體視顯微鏡下觀察。若染色結果為陽性，則材料經處理的部分呈藍色。

1.4 PI和FDA染色

取經處理材料葉片下表皮細胞，清洗材料至SA完全去除，用FDA染液染色材料30 min，用雙蒸水清洗材料，再用PI染色10 min，沖洗后用50%甘油(V/V)裝片進行觀察，熒光素激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為530 nm。PI與FDA的協同使用，分別對死細胞和活細胞染色。

1.5 TUNEL法檢測PCD

采用Roche公司的In Situ Cell Death Detection Kit(11684817910)試劑盒，對SA處理后的黃瓜表皮細胞和黃瓜葉片進行TUNEL顯色法檢測，具體步驟見說明書。

當我們拋開“權能”客觀方面的含義，僅把“權能”看成是一種積極的能動的精神時，我們發(fā)現增能理論的核心觀念“權能”與陸九淵心學的核心觀念“本心”具有極大的相似性。

1.6 黃瓜超敏反應相關基因的RT-PCR和qPCR表達分析

黃瓜幼苗處于四葉期時，在葉片每隔3 cm滴加50 μL 10 mmol/L SA，分別在0，3，12，24 h這4個時間段取材并用液氮冷凍，在-80 ℃冰箱保存。分別進行半定量RT-PCR和實時熒光定量PCR測定，檢測SA處理下，15個超敏反應相關基因在黃瓜葉片中的表達水平。

2 結果與分析

2.1 黃瓜PCD的鑒定

2.1.1 SA處理黃瓜葉片的形態(tài)變化 如圖1-A所示，用10 mmol/L SA處理黃瓜幼苗葉片后，與對照組葉片(0 h)相比，處理組葉片會出現變薄的趨勢，并隨著處理時間的加長，葉片的變薄程度也隨之增加。3 h時處理組葉片出現變薄趨勢，且在6，9，12 h變薄程度明顯，并在24 h達到極值。試驗結果表明，處理3 h時葉片細胞開始發(fā)生PCD，并在24 h達到最大值。

2.1.2 ROS的定位 如圖1-B、C所示：用SA處理黃瓜幼苗葉片后，3 h葉片出現了棕色和藍色，說明在此時已經有ROS的積累。隨著處理時間的增加，處理部位的顏色逐漸變深，ROS增多。24 h與6，9 h相比，顏色進一步加深，在處理部位周圍也出現了棕色和藍色的積累。結果表明，在SA誘導黃瓜幼苗葉片細胞死亡的過程中，伴隨有ROS的暴發(fā)。

2.1.3 Trypan blue染色 如圖1-D所示，與對照組葉片相比，SA處理黃瓜幼苗葉片3 h后，染色區(qū)域出現淺藍色；6 h與3 h相比，染色區(qū)域的大小和顏色的深淺變化不大，但處理9 h后，染色區(qū)域的顏色逐漸變深；處理12，24 h后，染色區(qū)域的顏色加深呈現深藍色，且染色區(qū)域開始向未經SA處理的區(qū)域擴散。試驗結果表明，隨著SA處理黃瓜葉片的時間增加，死亡的細胞也逐漸增多。

0 h.對照；3，6，9，12，24 h.10 mmol/L SA處理時長。A.葉片形態(tài)；B.DAB染色； C.NBT染色；D.Trypan blue染色。

2.1.4 PI和FDA染色結果 如圖2所示，對照組表皮細胞在熒光顯微鏡下，無紅色熒光出現，說明對照組表皮細胞并未被PI染色，即對照組表皮細胞并沒有死亡細胞的出現；FDA染色可見巨量的亮綠色熒光(圖2-A)，此時的細胞都是活細胞。而經過 SA處理1，3，5 h后，熒光顯微鏡下的紅色熒光逐漸增多，綠色熒光逐漸減少(圖2-B-D)。結果表明，隨著SA處理時間的延長，黃瓜葉片表皮細胞的死亡比例呈現一個逐漸上升的趨勢。

A. 未處理的黃瓜表皮細胞；B. SA處理1 h的黃瓜表皮細胞；C. SA處理3 h的黃瓜表皮細胞；D. SA處理5 h的黃瓜表皮細胞。

2.1.5 TUNEL法鑒定PCD 如圖3所示，對照組細胞A0沒有顏色出現，用蘇木精復染(B0)后，細胞核多呈現卵形或球形，說明此時沒有細胞死亡；使用SA處理3 h(A3)后，有少量的細胞核的顏色發(fā)生變化，細胞核變形，這是細胞程序性死亡前期細胞核的典型表現；隨著SA處理時間的增加(A6、A9、A12)，細胞核顏色變化明顯，出現密集的陽性斑點，經過蘇木精復染(B6、B9、B12)的細胞核形狀發(fā)生明顯的改變和邊緣化，這是細胞程序性死亡加劇的表現。

A. DAB染色；B. 蘇木精復染；0 h.對照；3，6，9，12 h分別是SA處理黃瓜葉片的時間。

表1 SA誘導黃瓜葉片差異基因中葉綠體相關基因Tab.1 SA induces chloroplast related genes in cucumber leaf differential genes

2.2 SA誘導黃瓜PCD相關基因的篩選

分析Illumina高通量測序技術獲得的差異表達基因片段[38]，從1 759個差異表達基因DEGs中，用PCR驗證的方法篩選出15個注釋中帶有chloroplast的基因進行表達分析(表1)。

2.3 SA誘導黃瓜葉綠體PCD相關DEGs的表達分析

圖4是用qRT-PCR的方法檢測15個基因在SA處理下不同時間段的表達量變化。有12個基因都表現先上調后下調(A4、A5、A6、B3、C3、D1、E3、E4、E6、E7、E8和G3)，其中A4、A5、B3、C3、E4和E7在SA處理3 h時表達量最高，之后下降；A6、D1、E3、E6、E8和G3在SA處理12 h時表達量最高之后下降。D6和A2屬于表達逐步下調的基因。F7的表達在處理第12 h降至最低，至24 h表達又恢復至對照水平。

圖4 SA處理15個基因的qRT-PCR表達分析Fig.4 Real time quantitative RT-PCR expression analysis of fifteen genes under SA treatment

按相對表達量進行分析，與處理前相比，表達量上調不足2倍的只有A5、C3和E4等基因，其他基因都對SA有強烈的表達響應，其中A6、D1、E6的最高表達量比處理前分別高出9，6，10倍。所有基因的上調表達在最高表達量上都不持續(xù)，之后的測定都顯示表達量已下調直至接近處理前水平，甚至低于處理前(A6、G3)。

基因F7的表達是先下降后上升，其最低表達量與處理前相比差2.5倍，即受SA的誘導作用不很明顯。2個下調表達的基因A2和D6受SA影響比較明顯，與處理前相比下調程度都達到5倍。

3 討論

植物細胞程序性死亡(PCD)在植物系統生長、器官形成和對抗逆境中都有重要意義[42]。而ROS和SA作為植物PCD的重要內源信號分子，植物在響應脅迫時常伴隨著ROS的積累和爆發(fā)[43]。

對選定的15個黃瓜基因進行熒光定量PCR表達分析，響應SA誘導作用表現出上調表達的基因有：類囊體加工肽酶1基因(B3)、6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶基因(D1)、果糖1,6-二磷酸醛縮酶3基因(E3)、α-葡聚糖-水二激酶1基因(E6)和丙二烯氧化物環(huán)化酶4基因(E8)；下調表達的基因有：甜菜堿脫氫酶1基因(A2)、鈣敏感受體基因(A4)、脫鎂葉綠酸a單加氧酶基因(A5)、葉綠素還原酶1基因(A6)、σ因子結合蛋白1基因(C3)、NADPH-原葉綠酸酯還原酶基因(D6)、2-琥珀苯甲酸-輔酶A連接酶基因(F7)、ATP依賴的鋅金屬蛋白酶基因(E7)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸轉運子基因(E4)、胱硫醚β合成酶(CBS)蛋白基因(G3)。

查閱文獻并根據相對表達量的變化，推測了15個基因的功能并分為以下6類：葉綠素合成降解相關基因(PaO、NYC1、NPR)；植物抗逆性相關基因(6-PGDH、FtsH1、NDT1)；調控SA和JA誘導的植物防衛(wèi)反應相關基因(AOC4、SIB1)；提高植物脅迫耐受性相關基因(BADH1)；植物光合作用相關基因(MenE、FBA3)；調節(jié)植物發(fā)育相關基因(CBSX1、GWD1、TPP1、CAS)[46]。

SIB1屬核編碼的植物特有的抗病原體相關基因，Narusaka等[47]發(fā)現擬南芥基因SA的誘導，且在SIBI超表達株系中發(fā)現與ROS積累相關的基因轉錄水平提高，本試驗中SIB1表達呈先上升后下降的趨勢，印證了該基因參與SA誘導提高植物免疫力的信號途徑[47]，推測其可能連接葉綠體功能并參與植物防御系統[48]。

FtsH1在SA處理3 h先表達上調，12 h后表達量恢復正常并有所下降，這個結果與煙草受病毒侵染后FtsH1表達下調加速超敏反應是一致的[49]。FtsH1在擬南芥中參與類囊體蛋白的降解，控制蛋白質的質量平衡[50]，降解光系統Ⅱ(PS Ⅱ)修復中光損傷反應中心D1蛋白[51]和一些組裝PS Ⅱ剩余的蛋白亞基[52]。

PaO在本試驗中表達量呈應激性升高，并在之后的時間呈下降的趨勢，認為PaO在處理早期時發(fā)生應激反應，加速了光合作用，隨后下調使光合作用后續(xù)產物脫鎂葉綠酸a積累，終止光合作用，執(zhí)行使細胞加速死亡的功能；NYC1的表達量在本試驗中呈先上升后下降的趨勢，認為NYC1通過誘導LHCⅡ的降解來增加葉綠素a的合成，參與植物光合作用進程，進而參與調控SA誘導PCD的進程。PaO基因受SA誘導下調表達，促進HR，其原因是缺失該酶導致光毒性的脫鎂葉綠酸a積累引起光依賴的PCD[53-54]。Horie等[55]研究表明，擬南芥缺失該基因后，會在植物發(fā)育期間表現出滯綠表型。光系統Ⅱ的捕光葉綠素a/b蛋白復合物(LHCⅡ)是色素蛋白復合物，結合葉綠素a和葉綠素b并參與調節(jié)PS Ⅰ 和PSⅡ能量的分配。葉綠素b是LHCⅡ的主要色素，在NYC1突變體株系衰老期間，葉綠素b的降解被抑制導致LHCⅡ選擇性的保留，這表明葉綠素b還原酶參與LHCⅡ降解起始進程。

AOC4是茉莉酸(JA)合成的關鍵酶，SA處理后，蘋果AOC1基因的表達量上升，JA含量也隨之增加[56]。喜樹AOC基因在細菌中表達后，提高了細菌對鹽的耐受性[51]。本試驗中AOC4上調表達的結果與提高抗性相一致。NDT1在煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NDA)的運輸過程中起重要作用，植物受到病原體侵染時，NAD調控某些次生代謝產物來產生抗性誘導植物發(fā)生超敏反應[43]。本試驗中NDT1上調，認為NDT1參與了SA提高植物抗性的信號途徑。