魏世平，吳萌，李桂龍，江春玉，劉明，陳瑞蕊，李忠佩

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腐殖酸對(duì)低濃度百菌清的緩釋增效作用

魏世平1,2，吳萌1，李桂龍1，江春玉1，劉明1,2，陳瑞蕊1,2，李忠佩1,2

（1中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210008；2中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

【目的】明確腐殖酸對(duì)低濃度（5 mg·L-1）百菌清（chlorothalonil）的緩釋增效作用，為減少農(nóng)藥使用量、延長(zhǎng)農(nóng)藥藥效提供新的科學(xué)思路，為選擇新的農(nóng)藥增效劑提供理論依據(jù)。【方法】將腐殖酸（50 mg·L-1）添加至低濃度百菌清中，進(jìn)行尖鐮孢（）的體外平板及液體培養(yǎng)，通過(guò)菌絲體生長(zhǎng)試驗(yàn)及血球計(jì)數(shù)板、等溫微量熱技術(shù)，測(cè)定相應(yīng)的抑菌率（inhibition rate，IR）、孢子體數(shù)量以及生長(zhǎng)代謝過(guò)程中的熱量排放?！窘Y(jié)果】將對(duì)照抑菌率設(shè)定為0，腐殖酸-百菌清復(fù)配處理較百菌清處理的IR顯著提高了10.29%（＜0.05），相對(duì)增效達(dá)到25.33%。液體搖菌培養(yǎng)過(guò)程中，搖菌培養(yǎng)的第3天，百菌清處理與腐殖酸-百菌清復(fù)配處理的孢子數(shù)無(wú)顯著差異；搖菌培養(yǎng)第7天，百菌清處理的孢子數(shù)極顯著低于其他處理（＜0.01）；搖菌培養(yǎng)的第14天，腐殖酸-百菌清復(fù)配處理的孢子數(shù)顯著低于其他處理（＜0.05），而百菌清處理與對(duì)照之間無(wú)顯著差異，表明腐殖酸延長(zhǎng)了低濃度百菌清對(duì)尖鐮孢孢子數(shù)增加的抑制效應(yīng)。各處理的熱功率-時(shí)間曲線圖顯示，腐殖酸-百菌清復(fù)配處理熱量排放曲線在監(jiān)測(cè)的72 h內(nèi)未檢測(cè)到熱排放峰；而單獨(dú)添加百菌清的處理在試驗(yàn)的后期重新出現(xiàn)熱排放峰；單獨(dú)添加腐殖酸處理的熱排放曲線與對(duì)照曲線接近。對(duì)熱功率-時(shí)間曲線相關(guān)參數(shù)進(jìn)一步分析，結(jié)果顯示百菌清處理的Pmax（最大熱功率）顯著低于對(duì)照和腐殖酸處理（＜0.05），而Tmax（最大熱功率時(shí)間）顯著高于對(duì)照和腐殖酸處理（＜0.05）；腐殖酸-百菌清復(fù)配處理的Pmax、Q（整體發(fā)熱量）、k（生長(zhǎng)速率常數(shù)）均顯著低于其他處理（＜0.05），表明該處理病原菌的生長(zhǎng)代謝活性顯著低于其他處理，即病原菌生長(zhǎng)代謝受到抑制的程度最大；腐殖酸處理與對(duì)照曲線各參數(shù)之間無(wú)顯著差異，表明病原菌的生長(zhǎng)代謝活性沒(méi)有受到抑制，同時(shí)說(shuō)明腐殖酸-百菌清復(fù)配處理中生長(zhǎng)代謝受到的抑制作用與腐殖酸本身無(wú)關(guān)。【結(jié)論】添加腐殖酸可以顯著提高低濃度百菌清對(duì)尖鐮孢菌絲體生長(zhǎng)、孢子體數(shù)量增加以及生長(zhǎng)代謝過(guò)程中能量排放的抑制能力。將腐殖酸作為低濃度百菌清的農(nóng)藥增效劑，是降低百菌清用量及延長(zhǎng)百菌清藥效的有效措施。

腐殖酸；百菌清；等溫微量熱；緩釋增效作用

0 引言

【研究意義】尖鐮孢（）是引起多種農(nóng)作物根腐病、枯萎病的主要真菌致病菌，嚴(yán)重危害農(nóng)作物的生長(zhǎng)和糧食安全[1-2]。針對(duì)該致病菌的防治技術(shù)包括農(nóng)業(yè)防治、物理防治、化學(xué)防治和生物防治，其中化學(xué)防治仍然是目前主要的防治手段，百菌清（chlorothalonil）、多菌靈（carbendazim）、代森錳鋅（mancozeb）等殺菌劑是農(nóng)業(yè)上常用的化學(xué)防治藥劑[3]。作為一種廣譜高效的保護(hù)性殺菌劑，百菌清被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，但隨著使用年限的增加，防治效果逐年下降；且百菌清在水體、土壤中的累積殘留量給生態(tài)環(huán)境和人類帶來(lái)了新的威脅[3-5]。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中如何提高農(nóng)藥藥效，進(jìn)而減少農(nóng)藥的使用量，成為一種研究趨勢(shì)[6]。農(nóng)藥增效劑是解決這一生態(tài)環(huán)境問(wèn)題的重要途徑[7]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】越來(lái)越多的綠色農(nóng)藥增效劑應(yīng)用到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，如植物油、生物堿、萜烯、茶皂素、腐殖酸等[8-11]。研究證明腐殖酸能夠通過(guò)理化作用與農(nóng)藥形成復(fù)合物，降低農(nóng)藥毒性，減少環(huán)境污染，是一種較好的農(nóng)藥緩釋增效劑。腐殖酸類物質(zhì)在結(jié)構(gòu)單元組成上包含大量的活性基團(tuán)，如羧基、羰基、醇羥基、醌基等，這些活性基團(tuán)使得腐殖酸-農(nóng)藥復(fù)配體系在殺菌、殺蟲等過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用[12]。研究發(fā)現(xiàn)，腐殖酸類物質(zhì)可作為甲基托布津、多菌靈等農(nóng)藥的增效劑[13]。王任明等[14]通過(guò)室外盆栽接蟲和田間小區(qū)試驗(yàn)，得出黃腐酸對(duì)殺蟲脒存在較好的增效作用；金平等[15]用1% NaOH提取出泥炭的腐殖酸，將其與克露復(fù)配噴施黃瓜葉片，從生理機(jī)制上證明了腐殖酸對(duì)克露起到增效作用。【本研究切入點(diǎn)】目前還未見(jiàn)腐殖酸對(duì)百菌清緩釋增效作用的報(bào)道。另外，田間接種和生理指標(biāo)測(cè)定的試驗(yàn)方法存在工作量大、耗時(shí)長(zhǎng)等弊端，因此，探索一種新的試驗(yàn)方法實(shí)現(xiàn)對(duì)農(nóng)藥增效劑的有效篩選意義重大。等溫微量熱技術(shù)在醫(yī)學(xué)上已經(jīng)普遍用于檢測(cè)藥物活性及其定量構(gòu)效關(guān)系的研究（quantitative structure-activity relationship，QSAR）[16-17]，但利用等溫微量熱技術(shù)來(lái)篩選農(nóng)藥增效劑的研究未見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】將腐殖酸與農(nóng)藥百菌清同時(shí)添加至純菌培養(yǎng)基中，通過(guò)測(cè)定病原菌菌絲體的凈生長(zhǎng)量以及孢子體數(shù)量，探索腐殖酸-百菌清復(fù)配體系對(duì)尖鐮孢體外生長(zhǎng)的直接影響，同時(shí)利用等溫微量熱儀監(jiān)測(cè)復(fù)配體系及單獨(dú)添加處理生長(zhǎng)代謝過(guò)程中的熱排放，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)微生物代謝活性的變化，為農(nóng)藥增效劑的選擇提供新的篩選方法以及衡量指標(biāo)，為擴(kuò)大腐殖酸在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)，為我國(guó)煤礦、泥炭等腐殖酸材料來(lái)源的充分利用提供新的途徑。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2017年7月至2018年6月在中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1 腐殖酸材料來(lái)源及提取、純化

供試腐殖酸材料來(lái)源于褐煤，購(gòu)自內(nèi)蒙古自治區(qū)烏海市同升商貿(mào)有限責(zé)任公司，其腐殖酸的提取、純化過(guò)程參考文獻(xiàn)[18-19]。經(jīng)元素分析儀測(cè)定該腐殖酸含碳565.5 g·kg-1，氮15.1 g·kg-1，硫5.1 g·kg-1，氧339.4 g·kg-1。13C固態(tài)核磁光譜顯示，其化學(xué)組成中各碳組分的相對(duì)比例為烷基碳11.6%，甲氧基/酰胺碳0.6%，烷氧碳0.7%，異頭碳3.4%，芳香碳64.8%，芳香族碳氧8.5%，羰基碳10.5%。

1.2 病原菌來(lái)源

供試菌種尖鐮孢購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，為花生根腐病致病菌株。

1.3 菌絲體體外平板培養(yǎng)試驗(yàn)

試驗(yàn)設(shè)置4個(gè)處理，分別為PSA（potato sugar agar）培養(yǎng)基對(duì)照、單獨(dú)添加低濃度百菌清處理、單獨(dú)添加腐殖酸處理以及同時(shí)添加腐殖酸和低濃度百菌清的處理。

PSA固體培養(yǎng)基配方：200 g馬鈴薯加蒸餾水煮沸，小火煮20 min，加20 g蔗糖和18 g瓊脂粉，定容至1 L，115℃滅菌，30 min。PSA液體培養(yǎng)基的配制不添加瓊脂粉。

將腐殖酸和百菌清用二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解，并用含有200 μg·mL-1乳化劑的無(wú)菌蒸餾水稀釋至相應(yīng)濃度，腐殖酸添加濃度為50 mg·L-1，百菌清添加濃度為5 mg·L-1。吸取1 mL檢測(cè)液至無(wú)菌培養(yǎng)皿中（直徑9 cm），加入9 mL的PSA固體培養(yǎng)基。菌絲接種環(huán)的直徑約5 mm，將致病真菌接種至各處理培養(yǎng)皿的中間位置，25℃培養(yǎng)72 h，測(cè)量菌絲體的生長(zhǎng)直徑，每處理 3—4個(gè)重復(fù)。

1.4 孢子體計(jì)數(shù)

試驗(yàn)處理同1.3，但固體培養(yǎng)基改為不添加瓊脂的PSA液體培養(yǎng)基。將致病菌從平板上接種至PSA液體培養(yǎng)基中，30℃搖菌培養(yǎng)48 h（搖菌時(shí)間根據(jù)孢子濃度適當(dāng)調(diào)整），吸取一定體積的菌懸液至含有新鮮培養(yǎng)基的不同處理中，接種后孢子初始濃度控制在2.5×105個(gè)/mL[17,20]，將各處理菌懸液置于25℃搖菌，分別于搖菌培養(yǎng)的第3、7、14、33天采樣進(jìn)行孢子數(shù)計(jì)數(shù)。使用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，血球計(jì)數(shù)板規(guī)格為25個(gè)中方格×16個(gè)小方格，選擇左上、左下、右上、右下以及中央的中方格進(jìn)行孢子計(jì)數(shù)，對(duì)于臨界的孢子體需遵循數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右的原則，最后折算為各搖菌瓶中的孢子總數(shù)。

1.5 熱動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)

試驗(yàn)處理同1.4，4 mL的安培瓶?jī)?nèi)最終上機(jī)液體體積為3 mL，其中包含各處理相應(yīng)量的菌懸液、DMSO、腐殖酸、百菌清及PSA液體培養(yǎng)基。菌懸液配制同1.4，最終上機(jī)真菌孢子數(shù)同樣為2.5×105個(gè)孢子/mL。將安培瓶置于TAM III（TA Instruments，Utah，USA）檢測(cè)通道中，設(shè)定油浴溫度為25℃恒溫，代謝反應(yīng)過(guò)程中的功率-時(shí)間曲線被連續(xù)監(jiān)測(cè)72 h（根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可適當(dāng)調(diào)整）。用TAM assistant軟件對(duì)熱排放曲線進(jìn)行處理，匯總各熱排放曲線的相關(guān)參數(shù)，包括最大熱功率（Pmax）、最大熱功率時(shí)間（Tmax）、整體發(fā)熱量（Q）和生長(zhǎng)速率常數(shù)k[21-23]。

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)真菌菌絲體凈生長(zhǎng)量計(jì)算抑菌率（inhibition rate，IR），計(jì)算公式：IR（%）=100×（對(duì)照菌絲體凈生長(zhǎng)量-處理菌絲體凈生長(zhǎng)量）/對(duì)照菌絲體凈生長(zhǎng)量。

腐殖酸-百菌清復(fù)配處理的相對(duì)增效（%）=100×（復(fù)配處理抑菌率-百菌清處理抑菌率）/百菌清處理抑菌率。

熱功率-時(shí)間曲線中生長(zhǎng)速率常數(shù)k是由OriginPro8.0中Exponential進(jìn)行指數(shù)模型擬合得到。各處理抑菌率、孢子數(shù)以及熱排放曲線相關(guān)參數(shù)的單因素方差分析和Tukey B、Duncan多重比較由SPSS 25.0完成。

2 結(jié)果

2.1 腐殖酸對(duì)百菌清抑制病原菌菌絲體生長(zhǎng)的作用

將對(duì)照抑菌率（IR）設(shè)為0，得到各處理對(duì)尖鐮孢的IR（表1）。表1中百菌清、腐殖酸以及腐殖酸-百菌清復(fù)配處理對(duì)尖鐮孢的IR均大于0，即各處理均存在抑制作用。同時(shí)，腐殖酸-百菌清復(fù)配處理的IR較百菌清處理有顯著的提高，相對(duì)增效為25.33%，表明腐殖酸對(duì)低濃度百菌清抑制尖鐮孢菌絲體生長(zhǎng)存在顯著的增效作用。

表1 不同處理對(duì)尖鐮孢的抑菌率

數(shù)據(jù)后不同字母表示Tukey B多重比較差異顯著（＜0.05）

Different letters behind the values indicate significantly different at＜0.05 level by Tukey B multiple comparisons

2.2 腐殖酸對(duì)百菌清抑制病原菌孢子體數(shù)量增加的作用

利用血球計(jì)數(shù)板對(duì)各處理不同培養(yǎng)時(shí)間采樣的真菌孢子體進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖1。搖菌培養(yǎng)的第3天，對(duì)照與腐殖酸處理的孢子數(shù)極顯著大于百菌清處理與腐殖酸-百菌清復(fù)配處理，而百菌清處理與腐殖酸-百菌清復(fù)配處理的孢子數(shù)之間無(wú)顯著差異；搖菌培養(yǎng)第7天，對(duì)照的孢子數(shù)極顯著大于腐殖酸處理及腐殖酸-百菌清復(fù)配處理，而百菌清處理的孢子數(shù)極顯著小于其他處理；搖菌培養(yǎng)第14天，腐殖酸-百菌清復(fù)配處理的孢子數(shù)顯著小于其他處理，而百菌清處理與對(duì)照之間無(wú)顯著差異。以上結(jié)果表明腐殖酸對(duì)低濃度百菌清抑制尖鐮孢孢子數(shù)增加的效應(yīng)存在顯著的延長(zhǎng)作用。

圖中同一培養(yǎng)時(shí)間下處理間不同字母為Duncan多重比較結(jié)果。*：差異顯著（P＜0.05）；**：差異極顯著（P＜0.01）

2.3 腐殖酸對(duì)百菌清抑制病原菌生長(zhǎng)代謝的作用

各處理尖鐮孢熱功率-時(shí)間曲線見(jiàn)圖2。熱功率-時(shí)間曲線圖顯示腐殖酸處理與對(duì)照的熱排放曲線接近，表明兩個(gè)處理中病原菌的生長(zhǎng)代謝過(guò)程相近，即腐殖酸對(duì)病原菌在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中的熱量排放未檢測(cè)到抑制作用。而百菌清處理與對(duì)照、腐殖酸處理差異較大，在監(jiān)測(cè)初期熱量排放曲線接近直線，百菌清對(duì)病原菌的生長(zhǎng)起到了很好的抑制作用，這一過(guò)程主要來(lái)自百菌清殺滅病原菌的作用，隨著監(jiān)測(cè)時(shí)間的延長(zhǎng)，熱排放峰又重新出現(xiàn)，表明百菌清對(duì)病原菌的藥效減弱，病原菌重新開(kāi)始生長(zhǎng)產(chǎn)生代謝熱。腐殖酸-百菌清復(fù)配處理從監(jiān)測(cè)初期開(kāi)始熱排放一直呈現(xiàn)直線狀態(tài)，表明代謝熱的排放始終受到抑制。從圖3也可以看出，4個(gè)處理經(jīng)微量熱儀72 h、25℃恒溫監(jiān)測(cè)培養(yǎng)后，只有腐殖酸-百菌清復(fù)配處理的安培瓶中未見(jiàn)明顯的菌絲，這與熱功率-排放曲線的結(jié)果一致。

熱功率-時(shí)間曲線的Pmax、Tmax、Q和k是用于評(píng)估微生物代謝活性的相關(guān)參數(shù)，其中Pmax、Q和k與代謝活性成正相關(guān)，而Tmax與代謝活性成負(fù)相關(guān)。各處理熱功率-時(shí)間曲線的相關(guān)參數(shù)（圖4）經(jīng)進(jìn)一步的統(tǒng)計(jì)分析得到，百菌清處理的Pmax顯著低于對(duì)照和腐殖酸處理，而Tmax顯著高于對(duì)照和腐殖酸處理，表明病原菌生長(zhǎng)代謝活性受到百菌清的顯著抑制。腐殖酸-百菌清復(fù)配處理的Pmax、Q、k均顯著低于其他處理，表明該處理病原菌的生長(zhǎng)代謝活性顯著低于其他處理，即病原菌生長(zhǎng)代謝受到抑制的程度最大。腐殖酸處理與對(duì)照各參數(shù)之間無(wú)顯著差異，表明病原菌的生長(zhǎng)代謝活性沒(méi)有受到抑制，同時(shí)說(shuō)明腐殖酸-百菌清復(fù)配處理中生長(zhǎng)代謝受到的抑制作用與腐殖酸本身無(wú)關(guān)。由于腐殖酸-百菌清復(fù)配處理的熱排放曲線接近直線，故Tmax在初始時(shí)最大。綜上，腐殖酸對(duì)百菌清殺滅尖鐮孢存在顯著的緩釋增效作用。

圖2 不同處理尖鐮孢的熱功率-時(shí)間曲線

1：對(duì)照control；2：百菌清處理chlorothalonil treatment；3：腐殖酸處理humic acid treatment；4：腐殖酸和百菌清復(fù)配處理humic acid-chlorothalonil combined treatment

3 討論

通過(guò)尖鐮孢體外培養(yǎng)和熱動(dòng)力學(xué)技術(shù)，本研究證實(shí)了腐殖酸對(duì)低濃度百菌清的緩釋增效作用，增效作用提高的抑菌率與前人總結(jié)的10%—20%的增效范圍相符[12]。目前在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上，腐殖酸的主要應(yīng)用包括作為土壤調(diào)節(jié)劑來(lái)改善土壤屬性，以及作為植物刺激素來(lái)促進(jìn)植物生長(zhǎng)和增加作物產(chǎn)量[24-26]。而本研究的結(jié)果為拓展腐殖酸的應(yīng)用范圍提供了理論依據(jù)，即將腐殖酸作為農(nóng)藥增效劑來(lái)增加和延長(zhǎng)百菌清的藥效。早期的研究中，李善祥[12]就指出腐殖酸作為一種高效、無(wú)公害、低成本、多功能的農(nóng)藥增效劑有著廣闊的發(fā)展前景，并且將腐殖酸的增效機(jī)理概括為：（1）腐殖酸與農(nóng)藥之間的化學(xué)作用，使得農(nóng)藥的化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化從而導(dǎo)致其活性結(jié)構(gòu)的改善；（2）腐殖酸沒(méi)有明顯影響農(nóng)藥的化學(xué)結(jié)構(gòu)，但增加了農(nóng)藥的表面活性、膜透性、生理生化作用以及吸附作用等。金平等[15]研究證實(shí)了腐殖酸對(duì)克露的增效作用，其生理機(jī)制主要是因?yàn)楦乘?克露復(fù)配處理降低了黃瓜葉片脯氨酸、丙二醛的含量以及質(zhì)膜透性、黃瓜霜霉病的病情指數(shù)，從而促進(jìn)了黃瓜的生長(zhǎng)，提高了黃瓜的產(chǎn)量及谷胱甘肽的含量；于宏偉等[9]認(rèn)為黃腐酸是一種膠體物質(zhì)，同時(shí)具有表面活性劑的作用，對(duì)有機(jī)農(nóng)藥具有強(qiáng)烈的吸附作用，并且使難溶于水相的農(nóng)藥更好地分散，以此來(lái)增加殺菌劑的殺菌效果；Abdel- Monaim等[27]利用可溶性腐殖酸鉀顆粒與苯并噻二唑（benzothiadiazole，BTH）浸泡大豆種子，在大田種植條件下，腐殖酸鉀-苯并噻二唑復(fù)配體系浸泡后的處理能夠有效地抵抗尖鐮孢對(duì)大豆植株的危害；復(fù)配處理植株的過(guò)氧化物酶（PO）、多酚氧化酶（PPO）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）3種酶活性和酚含量最高。腐殖酸鉀增效的機(jī)理為增加的PO和PPO活性可以產(chǎn)生氧化形式的醌，這可能有助于增加防御能力，因?yàn)檠趸问降孽梢詼缁畈≡a(chǎn)生的果膠酶。PAL是一種苯丙類化合物的關(guān)鍵酶，它會(huì)導(dǎo)致各種與防御有關(guān)的植物次生代謝物的產(chǎn)生，如水楊酸、植物抗毒素和類木質(zhì)素聚合物等。

柱上不同字母表示Tukey B多重比較差異顯著（P＜0.05）

本研究中，百菌清處理的熱功率-時(shí)間曲線從生長(zhǎng)代謝方面較好地體現(xiàn)了百菌清的重要?dú)⒕鷻C(jī)理，即通過(guò)對(duì)病原菌糖酵解過(guò)程產(chǎn)生影響而起到殺滅致病菌的作用。糖酵解過(guò)程中，3-磷酸甘油醛在磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）的催化下，轉(zhuǎn)變?yōu)?,3-二磷酸甘油酸，同時(shí)將氧化過(guò)程產(chǎn)生的能量貯存到三磷酸腺苷（ATP）分子中。而百菌清分子中的活性氯能夠與磷酸甘油醛脫氫酶上的-SH結(jié)合，生成一種復(fù)合物，從而使酶的活性喪失，中斷糖酵解過(guò)程中3-磷酸甘油醛的脫氫氧化，影響ATP的產(chǎn)生[28-29]。等溫培養(yǎng)初期百菌清抑制了病原菌的糖酵解過(guò)程，沒(méi)有熱量排放，故熱排放曲線接近直線，后期隨著百菌清藥效的降低，病原菌糖酵解過(guò)程恢復(fù)，重新出現(xiàn)熱排放峰。腐殖酸-百菌清復(fù)配處理，其熱功率-時(shí)間曲線始終為近似直線排放，筆者推斷在腐殖酸存在的條件下，百菌清對(duì)病原菌糖酵解過(guò)程的影響增大，且對(duì)能量產(chǎn)生的抑制作用更持久，從而無(wú)法出現(xiàn)熱排放峰。這與張國(guó)生等[7]總結(jié)的農(nóng)藥增效劑主要作用機(jī)理相一致，即農(nóng)藥增效劑是通過(guò)抑制或弱化靶標(biāo)（害蟲、雜草、病菌等）對(duì)農(nóng)藥活性的解毒作用，延緩藥劑在防治對(duì)象內(nèi)的代謝速度，從而增加防治效果。后續(xù)還需對(duì)腐殖酸的結(jié)構(gòu)以及對(duì)腐殖酸-百菌清復(fù)配體系中的相關(guān)酶活性、谷胱甘肽含量等進(jìn)行研究測(cè)定，從而對(duì)作用機(jī)理有更深入的了解。同時(shí)，為了更好地詮釋腐殖酸緩釋增效作用的機(jī)理，下一步還需要涉及更多不同來(lái)源、結(jié)構(gòu)組成的腐殖酸。

本研究中等溫微量熱技術(shù)與病原菌離體培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果的一致性表明等溫微量熱技術(shù)應(yīng)用于農(nóng)藥增效劑篩選具有可行性。在應(yīng)用生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，等溫微熱技術(shù)的非標(biāo)記和被動(dòng)屬性可以對(duì)復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行測(cè)量（如微觀組織），以此來(lái)代替破壞性的常規(guī)分析（如DNA或蛋白質(zhì)的量化）[30]。在土壤學(xué)領(lǐng)域，微量熱技術(shù)與高效氣液相色譜、高通量測(cè)序等技術(shù)的結(jié)合，有望在土壤微生物活性與結(jié)構(gòu)的地理屬性、氣候變化、土壤質(zhì)量的空間大尺度比較和外源污染物的生物毒性評(píng)價(jià)等方面發(fā)揮其重要作用[31]。Tafin等[17]在純培養(yǎng)條件下，利用等溫微量熱技術(shù)估算兩性霉素B、卡泊芬凈等組合對(duì)兩株曲霉（和）的抑制活性，研究證實(shí)微量熱技術(shù)具有實(shí)時(shí)評(píng)估藥物組合抑真菌活性的潛力。等溫微量熱技術(shù)同時(shí)還具備操作方便、檢測(cè)靈敏、材料消耗少且重現(xiàn)性好等優(yōu)勢(shì)，具有很好的應(yīng)用前景。

4 結(jié)論

腐殖酸對(duì)低濃度百菌清存在顯著的緩釋增效作用。在低濃度百菌清體系中添加腐殖酸，可以顯著增加低濃度百菌清對(duì)尖鐮孢的抑菌率，抑制尖鐮孢孢子體數(shù)量的增加和生長(zhǎng)代謝過(guò)程。將腐殖酸作為百菌清的農(nóng)藥增效劑具有生產(chǎn)和商業(yè)應(yīng)用潛力。等溫微量熱技術(shù)作為篩選農(nóng)藥增效劑新的方法及衡量指標(biāo)具有可行性。

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Slow-release synergistic effect of humic acidon low concentration chlorothalonil

WEI ShiPing1, 2, WU Meng1, LI GuiLong1, JIANG ChunYu1, LIU Ming1, 2, CHEN RuiRui1,2, LI ZhongPei1,2

(1State Key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008;2University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049)

【Objective】The objective of this study is to clarify the slow-release synergistic effect of humic acid on low concentration (5 mg·L-1) of chlorothalonil, provide a new scientific idea for reducing pesticide use and prolonging pesticide efficacy, and to provide a theoretical basis for selecting new fungicide synergists. 【Method】was culturedsolid and liquid medium including low concentrations of chlorothalonil with or without 50 mg·L-1humic acid addition. The inhibition rate (IR) and spore number were determined through mycelium growth test and blood counting chamber. The heat released during the growth and metabolism process ofwas measured by isothermal microcalorimetry technology. 【Result】The IR of humic acid-chlorothalonil combined treatment significantly increased by 10.29% (＜0.05) when IR of control was set to 0. The relative synergism was 25.33%. During liquid shake culture, there was no significant difference in spore number between the chlorothalonil treatment and humic acid-chlorothalonil combined treatment on the 3rd cultured day. On the 7th cultured day, the spore number of chlorothalonil treatment was significantly lower than that of other treatments (＜0.01). On the 14th cultured day, the spore number of humic acid-chlorothalonil combined treatment was significantly lower than other treatments (＜0.05), while there was no significant difference in spore number between chlorothalonil treatment and control. It showed that humic acid extended the inhibitory effect of low concentration chlorothalonil on the increase of spore number. The heat flow-time curve of each treatment showed that no heat release peak was detected in the humic acid-chlorothalonil combined treatment within 72 hours of monitoring, while that in the chlorothalonil treatment was found in later monitoring, and the heat flow-time curve of humic acid treatment was close to the control. Pmax(peak power) of the chlorothalonil treatment was significantly lower than that of the control and humic acid treatment (＜0.05), while the Tmax(peak power time) was significantly higher than that of the control and humic acid treatment (＜0.05). Pmax, Q (total heat evolution), and k (microbial growth rate constant) of the humic acid-chlorothalonil combined treatment were all significantly lower than other treatments (＜0.05), which indicated that the pathogen metabolic activity of the combinated treatment was significantly lower than that in other treatments. That is, the growth and metabolism ofwere most inhibited. There was no significant difference in Pmax, Tmax, Q, and k between the humic acid treatment and control, that is, the inhibition effect of humic acid treatment on pathogen was not monitored, and which could verify that the inhibition effect of combined treatment was irrelevant to humic acid itself.【Conclusion】The addition of humic acid can significantly enhance the ability of low concentration chlorothalonil to inhibit the growth of mycelia, increase of spore number and heat emission during growth and metabolism process of. Using humic acid as a fungicide synergist of chlorothalonil is an effective measure to reduce the amount of chlorothalonil and extend the efficacy.

humic acid; chlorothalonil; isothermal microcalorimetry; slow-release synergistic effect

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.01.007

2018-07-10；

2018-08-17

國(guó)家自然科學(xué)基金（41430859）、江蘇省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（BK20181510）、南京土壤研究所“一三五”計(jì)劃和領(lǐng)域前沿項(xiàng)目（ISSASIP1642）

魏世平，Tel：025-86881313；E-mail：spwei@issas.ac.cn。吳萌，E-mail：mwu@issas.ac.cn。魏世平和吳萌為同等貢獻(xiàn)作者。通信作者李忠佩，Tel：025-86881505；E-mail：zhpli@issas.ac.cn

（責(zé)任編輯 岳梅）