張媚 王富平 魏如男 陳忠敏

摘要： 分析在乙醇處理前后絲素蛋白（SF）與絲素肽（SFP）二級(jí)結(jié)構(gòu)含量變化，及對(duì)細(xì)胞生長的影響。采用醇溶法提取制備SF，由中性蛋白酶酶解得SFP，40%乙醇分別處理SF與SFP，得ET-SF、ET-SFP。將SF、SFP、ET-SF、ET-SFP分別采用過濾除菌處理后再分別在1mg/mL、0.5mg/mL濃度條件下，檢測(cè)其對(duì)人肝癌細(xì)胞（HepG2）、人宮頸癌上皮細(xì)胞（Caski）的生長影響，利用相對(duì)增值率評(píng)價(jià)其毒性，圓二色譜法檢測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)含量。結(jié)果表明：乙醇處理前后SF為非濃度依賴型，對(duì)細(xì)胞生長均有促進(jìn)作用且趨勢(shì)相同;乙醇處理前后SFP為濃度依賴型，對(duì)細(xì)胞均有抑制作用，當(dāng)β-折疊含量增加，SFP對(duì)細(xì)胞毒性作用增加。

關(guān)鍵詞： 絲素蛋白;絲素肽;二級(jí)結(jié)構(gòu);細(xì)胞生長;細(xì)胞毒性

中圖分類號(hào)： TS102.33 ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ? 文章編號(hào)： 1001-7003（2019）05-0014-06 ? 引用頁碼： 051103

Abstract： The changes in secondary structure content of silk fibroin （SF） and silk fibroin peptide （SFP） before and after treatment with ethanol， and the effects of different secondary structures on cell growth were investigated. SF was extracted and prepared by alcohol solution method， and then SFP was gained by neutral protease enzymolysis. SF and SFP were treated with 40% ethanol respectively to get ET-SF and ET-SFP. After filtration sterilization of SF， SFP， ET-SF and ET-SFP respectively， their effects on the growth of human liver cancer cells （HepG2） and human cervical cancer epithelial cells （Caski） were detected at the concentration of 1 mg/ml and 0.5 mg/ml， respectively. The Relative Growth Rate （RGR） was used to evaluate the toxicity. The secondary structure content was detected by Circular Dichroism （CD）. The results showed that SF was non-concentration-dependent before and after ethanol treatment and could promote cell growth， with the same trend. SFP was concentration-dependent before and after ethanol treatment and could inhibit the cell proliferation. In a conclusion， SFP enhanced the cytotoxicity with the increases of β-sheet content.

Key words： silk fibroin; silk fibroin peptide; secondary structure; cell growth; cytotoxicity

絲素蛋白（Silk fibroin， SF）是一種從蠶絲中提取的天然高分子纖維蛋白，具有良好的生物相容性、降解性和力學(xué)性能，被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，如新型載藥系統(tǒng)、細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)、醫(yī)用生物敷料、固定化酶材料、組織工程支架[1-2]。作為組織工程支架時(shí)具有促進(jìn)細(xì)胞在材料表面黏附的能力，當(dāng)其在體內(nèi)生理環(huán)境下發(fā)生降解時(shí)，產(chǎn)物以游離氨基酸和低分子多肽為主，可被細(xì)胞新陳代謝所利用，促進(jìn)細(xì)胞增殖生長[3-5]，即經(jīng)過降解的絲素蛋白帶上了猶如生長因子類的作用，在組織工程支架領(lǐng)域具備了優(yōu)異的特性。

SF是一種纖維狀蛋白，由無定形區(qū)和結(jié)晶區(qū)構(gòu)成，其結(jié)晶度一般在50%～60%，較大側(cè)基的氨基酸主要存在于無定形部分，而極性氨基酸在無定形區(qū)中的含量比在結(jié)晶區(qū)中的含量多[6]。結(jié)晶形態(tài)又可分Silk Ⅰ型和Silk Ⅱ型，Silk Ⅰ型分子鏈主要由α-螺旋和無規(guī)卷曲交替堆積而成，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定;而Silk Ⅱ型主要為β-折疊片層狀結(jié)構(gòu)，且在溫度和溶劑影響下Silk Ⅰ型容易向Silk Ⅱ型轉(zhuǎn)變[7-9]。有研究發(fā)現(xiàn)將乙醇加入絲素蛋白溶液后，溶液中原有的少量β-折疊構(gòu)象將受到破壞，由于乙醇分子與水分子結(jié)合使得絲素蛋白分子之間的相互作用增強(qiáng)，促使鏈段重新排列形成大量的β-折疊構(gòu)象[10-12]。但是目前關(guān)于SF及絲素肽（Silk fibroin peptide，SFP）的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化與細(xì)胞生長作用影響的相關(guān)研究并不多見，因此本文嘗試用40%乙醇處理SF，得到二級(jí)結(jié)構(gòu)含量不同的SF與SFP，再將所制得的SF和SFP與細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，探究其對(duì)細(xì)胞生長的作用。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料、試劑和儀器

繭殼（重慶市纖維織品檢驗(yàn)所），酶活力20×104 U/g的中性蛋白酶（南寧龐博生物有限公司），人宮頸癌上皮細(xì)胞Caski、人肝癌細(xì)胞HepG2（上海中喬新舟生物科技有限公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），DMEM培養(yǎng)基、PRMI-1640培養(yǎng)基、HyClone（賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司），氨芐青霉素、硫酸鏈霉素、MTT（北京Solarbio生物科技有限公司），SDS-PAGE凝膠配置試劑盒（Beyotime，碧云天生物技術(shù)公司），超低分子量蛋白電泳試劑盒（Real-Times，中科瑞泰（北京）生物科技有限公司），所用試劑無水乙醇、二甲亞砜（DMSO）等均為分析純（市售）。

FD-1-50真空冷凍干燥機(jī)（上海比郎儀器有限公司），JY300E電泳儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）。

1.2 絲素蛋白制備

按照文獻(xiàn)[13]的方法，將廢蠶繭除雜后，于04% Na2CO3溶液中沸煮兩次，每次1.5h，水浴比為1 ︰ 30，以除去絲素纖維表面的絲膠蛋白。干燥后的絲素蛋白采用鹽溶液溶解，配制CaCl2/C2H5OH/H2O（摩爾比1 ︰ 2 ︰ 8）的混合鹽溶液體系，80℃水浴30min。將鹽溶液經(jīng)過濾、濃縮和冷凍干燥得到絲素蛋白粉末，密封保存?zhèn)溆?，掃描電鏡檢測(cè)其線粒大小為20～50μm，此即為絲素蛋白（SF）。采用中性蛋白酶按照m純絲素液 ︰ m中性蛋白酶=20 ︰ 1在pH6.0～7.0條件下55℃水浴酶解1.5h，制得絲素肽（SFP）。

將SF與SFP分別用40%乙醇溶液處理2h，冷凍干燥得到二級(jí)結(jié)構(gòu)不同的絲素蛋白粉末，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 絲素蛋白相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定

電泳步驟按照碧云天生物技術(shù)公司說明書進(jìn)行，配置15%分離膠與5%濃縮膠，先灌入分離膠，待分離膠聚合后再灌入濃縮膠，插入梳子，待膠聚合好后拔出梳子，上樣，開始電泳。首先在80V條件下電泳1～2h，待指示buffer到達(dá)分離膠上沿時(shí)，將電壓調(diào)至120V，直至buffer到達(dá)分離膠下沿，結(jié)束電泳。電泳結(jié)束后將膠層置于考馬斯亮藍(lán)染液中染色2h，再用脫色液進(jìn)行脫色，得到清晰的蛋白質(zhì)條帶。再以相同步驟按照中科瑞泰（北京）生物技術(shù)有限公司說明書對(duì)SFP進(jìn)行電泳。

1.4 細(xì)胞生長性能檢測(cè)

HepG2細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)、Caski細(xì)胞用PRMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。配制質(zhì)量濃度為4mg/mL的SF溶液，分別為SF溶液、ET-SF（乙醇處理后的絲素蛋白）溶液、SFP溶液、ET-SFP（乙醇處理后的絲素肽）溶液，采用過濾除菌法（微孔濾器，220nm，Millipore，Ireland）處理，在處理后用完全培養(yǎng)基分別稀釋成質(zhì)量濃度為2、1mg/mL。用血球計(jì)數(shù)板分別將三種細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)為3×105個(gè)/mL，以每孔100μL加入到96孔板（Corning，USA）中，過夜待細(xì)胞貼壁后每孔加入100μL制備好的經(jīng)不同處理的培養(yǎng)基（此時(shí)質(zhì)量濃度為1、0.5mg/mL），以只加完全培養(yǎng)基的孔作為空白對(duì)照組，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（FORMA3111，美國Thermo公司）中培養(yǎng)。于5d后采用MTT法檢測(cè)三種細(xì)胞的活性：每孔加入20μL MTT，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h后，棄去96孔板中的液體，每孔加入150μL DMSO，使用酶標(biāo)儀（Multiskan GO，美國Thermo公司）震蕩10min，然后檢測(cè)其在490nm處的吸光值繪制細(xì)胞生長曲線，并按照下式計(jì)算相對(duì)增殖率RGR。

根據(jù)毒性級(jí)別評(píng)價(jià)國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T16886.5—2003《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第5部分：體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)》，將RGR值轉(zhuǎn)換為細(xì)胞毒性分級(jí)（表1）。

1.5 乙醇處理后絲素蛋白中二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的測(cè)定

采用圓二色光譜儀（英國APL Chiascan）檢測(cè)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，絲素蛋白質(zhì)量濃度為0.1mg/mL，樣品充分溶于水后上機(jī)進(jìn)行測(cè)試。儀器參數(shù)：能帶寬度1nm;響應(yīng)時(shí)長1s;波長190～260nm;掃描速度500nm/min。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，采用OriginPro2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SF與SFP的相對(duì)分子質(zhì)量大小分析

實(shí)驗(yàn)采用SDS-PAGE蛋白質(zhì)凝膠電泳對(duì)SF與SFP的相對(duì)分子質(zhì)量區(qū)間進(jìn)行測(cè)定。圖1（a）結(jié)果顯示，電泳得到SF泳道相對(duì)分子質(zhì)量形成了15～40kD的一個(gè)分布，而SFP泳道則不能看見明顯的相對(duì)分子質(zhì)量條帶，因此再采用低相對(duì)分子質(zhì)量蛋白電泳對(duì)SFP進(jìn)行電泳測(cè)定，觀察到在相對(duì)分子質(zhì)量小于17kD有明顯的條帶形成（圖1（b））。這是由于SFP的相對(duì)分子質(zhì)量太小，因?yàn)橹行缘鞍酌缚纱呋纸怆逆I，將大分子的蛋白質(zhì)降解成為小分子的多肽或氨基酸物質(zhì)[14]。此方法確認(rèn)了制備出的絲素蛋白分別為相對(duì)分子質(zhì)量大小不同的SF與SFP。

2.2 乙醇處理前后SF與SFP對(duì)細(xì)胞生長的影響

SFP是酶解產(chǎn)物，呈水溶性，可溶解分散于細(xì)胞培養(yǎng)基中，由于中性蛋白酶酶切位點(diǎn)無特定性，SFP產(chǎn)物即屬于復(fù)雜的多肽、游離氨基酸混合物。SF溶于水后在水溶液中形成絲素蛋白膠粒[15]，SF由于粒徑較大，會(huì)黏附在細(xì)胞的表面促進(jìn)細(xì)胞增殖，且增值速率隨著其與細(xì)胞貼壁面積的增加而增大;而對(duì)于粒徑較小的SFP，能被細(xì)胞攝入胞內(nèi)并對(duì)細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)代謝產(chǎn)生一定程度的干擾，從而抑制細(xì)胞的生長[16]。

以人的宮頸癌上皮細(xì)胞細(xì)胞（Caski）與肝癌細(xì)胞（HepG2）作為體外模型，分別將SF、ET-SF、SFP、ET-SFP對(duì)細(xì)胞生長的影響進(jìn)行評(píng)估。圖2顯示SF與ET-SF對(duì)Caski和HepG2的生長均有明顯的促進(jìn)作用，且趨勢(shì)相同，質(zhì)量濃度對(duì)其影響較小，與理論相符。可見SF二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化對(duì)細(xì)胞生長的影響不大。

而對(duì)于SFP與ET-SFP，其對(duì)Caski和HepG2的生長均存在抑制作用，如圖3所示。當(dāng)SFP與ET-SFP質(zhì)量濃度較低（0.5mg/mL）時(shí)，其對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用隨著時(shí)間的增加顯著增強(qiáng);當(dāng)SFP與ET-SFP質(zhì)量濃度較高（1mg/mL）時(shí)，Caski和HepG2幾乎不生長，說明SFP與ET-SFP對(duì)細(xì)胞增殖的作用具有濃度依賴性。對(duì)比乙醇處理前后SFP對(duì)細(xì)胞的影響，以0.5mg/mL為例，發(fā)現(xiàn)處理前的SFP對(duì)細(xì)胞生長雖有抑制作用，但在第5天時(shí)仍有細(xì)胞生長，而對(duì)于處理后的ET-SFP，其對(duì)細(xì)胞的抑制作用明顯增強(qiáng)，且從第4天開始細(xì)胞趨于全部死亡。根據(jù)樣品毒性級(jí)別評(píng)分對(duì)照表進(jìn)行細(xì)胞毒性級(jí)別評(píng)分，ET-SFP的細(xì)胞毒性等級(jí)相比SFP而言明顯增大，這說明乙醇處理使SFP的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致其對(duì)細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)代謝干擾程度不同，因而導(dǎo)致細(xì)胞的增殖速度有明顯差別，細(xì)胞毒性增大。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SF與SEP對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的生長的影響均大于人宮頸癌細(xì)胞Caski，這可能是由于HepG2細(xì)胞的增殖生長能力強(qiáng)于Caski細(xì)胞[17]，代謝能力強(qiáng)，導(dǎo)致在經(jīng)過SF與SFP處理后，影響效果均較Caski大。

2.3 乙醇處理前后對(duì)SFP中二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的影響

通過上述細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，乙醇處理前后，SF對(duì)細(xì)胞生長的影響變化不大，而SFP變化明顯，因此采用圓二色譜對(duì)SFP進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)分析。圓二色譜是一種被廣泛應(yīng)用于生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能研究的測(cè)定技術(shù)，可以有效檢測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化[18]。圖4為所得圓二色譜，在190～240nm波段為遠(yuǎn)紫外區(qū)掃描范圍，是肽鍵的吸收范圍，反映蛋白質(zhì)分子主鏈的二級(jí)結(jié)構(gòu)比例[19]。采用CONTIN程序和Yang-chen公式對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)成分進(jìn)行分析。

乙醇是一種質(zhì)子型有機(jī)溶劑，且乙醇分子能與絲素蛋白的疏水部分相互結(jié)合[9]，使蛋白質(zhì)介電常數(shù)和表面水合層遭到不同程度的破壞[20]，致使蛋白質(zhì)分子相互接觸形成較大的粒子而從溶液中析出，引起蛋白變性、β化[21]。Yang等[22]認(rèn)為絲素蛋白呈無規(guī)卷曲狀態(tài)的部分在水溶液中會(huì)形成一定的疏水區(qū)域，乙醇的加入將削弱疏水側(cè)鏈之間的相互作用，從而引發(fā)絲素蛋白由無規(guī)卷曲向β-折疊構(gòu)象轉(zhuǎn)變。表2結(jié)果顯示，乙醇處理對(duì)絲素肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化影響明顯，使α-螺旋和無規(guī)卷曲向β-折疊構(gòu)象轉(zhuǎn)變，且β-折疊含量由48.76%升高到55.16%，并且隨之細(xì)胞毒性增強(qiáng)。有研究發(fā)現(xiàn)乳鐵蛋白B能夠殺死小鼠和人腫瘤細(xì)胞系的主要原因，就是由于該肽在水溶液中形成扭曲的β-折疊結(jié)構(gòu)[23]。β-折疊較多時(shí)，原先包裹在蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水基團(tuán)將被暴露在蛋白表面，從而使其能夠插入到細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的疏水區(qū)，進(jìn)而破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致細(xì)胞變形、聚集和破裂[24]。故SFP中β-折疊結(jié)構(gòu)的增加導(dǎo)致細(xì)胞毒性的增強(qiáng)。

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)于絲素蛋白，因其相對(duì)分子質(zhì)量太大，不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，因此對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)改變對(duì)其細(xì)胞毒性影響不大;而對(duì)于相對(duì)分子質(zhì)量較小的絲素肽，其細(xì)胞毒性為濃度依賴型，且乙醇處理后其毒性變化較大，這是由于乙醇處理后，絲素肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，β-折疊含量顯著增加，細(xì)胞毒性增加。

本研究為絲素肽的制備工藝檢測(cè)過程提供了思路，建議在制備絲素肽時(shí)，要格外注意其條件控制，以避免二級(jí)結(jié)構(gòu)中β-折疊含量增多引起的細(xì)胞毒性增加，同時(shí)為進(jìn)一步研究絲素肽對(duì)細(xì)胞作用影響奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]郭濤，禹正楊. 絲素蛋白在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用研究新進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生， 2013， 29（8）： 1189-1191.

GUO Tao， YU Zhengyang. New progress in the application of silk fibroin protein in biomedicine [J]. Journal of Modern Medicine & Health， 2013， 29（8）： 1189-1191.

[2]吳惠英. 再生絲素蛋白纖維及其在生物醫(yī)用材料中的研究進(jìn)展[J]. 絲綢， 2017， 54（3）： 6-12.

WU Huiying. Research progress in regenerated silk fibroin fiber and its application in biomedical materials [J]. Journal of Silk， 2017， 54（3）： 6-12.

[3]王富平，龐亞妮，陳忠敏.絲素降解生成的低分子多肽對(duì)細(xì)胞生長性能的影響[J].絲綢，2017，54（4）：1-4.

WANG Fuping， PANG Yani， CHEN Zhongmin. Effect of low-molecular-weight silk fibroin peptides on cell growth property[J]. Journal of Silk，2017，54（4）：1-4.

[4]TEIMOURI Abbas， AZADI Mohammad， EMADI Rahmatollah. Preparation， characterization， degradation and biocompatibility of different silk fibroin based composite scaffolds prepared by freeze-drying method for tissue engineering application [J]. Polymer Degradation and Stability， 2015， 121： 18-29.

[5]WAN Ying， ZHANG Jun， LUO Ying. Preparation and degradation of chitosan-poly （p-dioxanone）/silk fibroin porous conduits [J]. Polymer Degradation and Stability， 2015， 119：46-55.

[6]陳鵬. 蠶絲素蛋白肽/聚乙二醇復(fù)合物的制備與生物相容性研究[D]. 重慶： 重慶理工大學(xué)， 2011.

CHEN Peng. Preparation of Silk Fibroin Peptide/ Polyethylene Glycol Compound and Study of Its Biocompatibility [D]. Chongqing： Chongqing University of Technology， 2011.

[7]汝玲， 黃毅萍， 陳萍， 等. 蠶絲素蛋白最新研究進(jìn)展[J]. 化學(xué)推進(jìn)劑與高分子材料， 2007， 5（4）： 26-29.

RU Ling， HUANG Yiping， CHEN Ping， et al. The newest research progress of silk protein [J]. Chemical Propellants & Polymeric Materials， 2007， 5（4）： 26-29.

[8]楊珊珊， 沙金， 趙海利， 等. 氧化石墨烯摻雜絲素蛋白復(fù)合材料的結(jié)晶和力學(xué)特性[J]. 高分子材料科學(xué)與工程， 2016， 32（1）： 46-51.

YANG Shanshan， SHA Jin， ZHAO Haili， et al. Crystallinity and mechanical property of silk fibroin/graphene oxide composites [J]. Polymer Materials Science & Engineering， 2016， 32（1）： 46-51.

[9]徐亞梅， 李明忠. 蠶絲絲素蛋白材料的生物降解性能研究進(jìn)展[J]. 絲綢， 2011， 48（5）： 19-22.

XU Yamei， LI Mingzhong. Research progress of biodegradation properties of silkworm silk fibroin materials [J]. Journal of Silk， 2011， 48（5）： 19-22.

[10]董文秀， 李軍生， 閻柳娟， 等. 乙醇對(duì)絲素蛋白結(jié)構(gòu)及功能特性的影響[J]. 現(xiàn)代食品科技， 2015，31（2）： 106-112.

DONG Wenxiu， LI Junsheng， YAN Liujuan， et al. Effect of ethanol on the structural and functional properties of silk fibroin [J]. Modern Food Science and Technology， 2015，31（2）： 106-112.

[11]魏如男，王富平，張媚，等.絲素肽絡(luò)合Ca2+含量影響細(xì)胞生長的研究[J].絲綢，2019，56（3）：7-11.

WEI Runan， WANG Fuping， ZHANG Mei， et al. Study on the effect of silk fibroin peptide complex Ca2+ content on cell growth[J]. Journal of Silk，2019，56（3）：7-11.

[12]王心如， 鄒盛之， 馮文慶， 等. 乙醇誘導(dǎo)的柞蠶絲素蛋白多孔材料的研究[J]. 絲綢， 2018， 55（10）： 1-8.

WANG Xinru， ZOU Shengzhi， FENG Wenqing， et al. Studies on Antheraea pernyi silk fibroin porous materials induced by ethanol [J]. Journal of Silk， 2018， 55（10）： 1-8.

[13]陳忠敏， 郝雪菲. 一種納米蠶絲絲素蛋白粉的制備方法： ZL2007100929696[P]. 2011-07-13.

CHEN Zhongmin， HAO Xuefei. Method for preparing nano silk fibroin protein powder： ZL2007100929696 [P]. 2011-07-13.

[14]尉曉宇. 食用菌酶學(xué)的應(yīng)用研究[J]. 中國食用菌， 1990（4）： 15-16.

WEI Xiaoyu. Study on the application of edible mushroom enzymology [J]. Edible Fungi of China， 1990（4）： 15-16.

[15]于成龍， 關(guān)國平， 余劭婷， 等. 絲素蛋白分子的構(gòu)象轉(zhuǎn)變及自組裝行為[J]. 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)進(jìn)展， 2017，38（3）： 159-163.

YU Chenglong， GUAN Guoping， YU Shaoting， et al. Conformation transition and self-assembly of silk fibroin [J]. Progress in Biomedical Engineering， 2017，38（3）： 159-163.

[16]施美景. 絲素蛋白熒光微/納米顆粒的制備及其與細(xì)胞的相互作用[D]. 蘇州： 蘇州大學(xué)， 2016.

SHI Meijing. Preparation of Fluorescent Silk Fibroin Micro/Nano Particles and Their Interaction with Cells [D]. Suzhou： Soochow University， 2016.

[17]李波， 闕祥勇， 李意， 等. cdc2基因在多種人類腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)及意義[J]. 廣東醫(yī)學(xué)， 2012， 33（14）： 2035-2037.

LI Bo， QUE Xiangyong， LI Yi， et al. Expression and significance of cdc2 gene in cancer cells [J]. Guangdong Medical Journal， 2012， 33（14）： 2035-2037.

[18]劉振佳， 司伊康， 陳曉光. 圓二色譜測(cè)定技術(shù)在小分子化合物與DNA相互作用研究中的應(yīng)用[J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào)， 2010（12）： 1478-1484.

LIU Zhenjia， SI Yikang， CHEN Xiaoguang. Application of circular dichroism to the study of interactions between small molecular compounds and DNA [J]. Acta Pharmaceutica Sinica， 2010（12）： 1478-1484.

[19]史新昌， 饒春明， 畢華， 等. 重組人干擾素-γ與參考品圓二色譜圖對(duì)比分析[J]. 藥物分析雜志， 2007（4）： 481-485.

SHI Xinchang， RAO Chunming， BI Hua， et al. Contrastive analysis on reference substance circular dichroism spectra graph with recombinant human interferon gamma [J]. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis， 2007（4）： 481-485.

[20]吳少輝， 羅廷順， 張成桂， 等. pH、無機(jī)鹽和有機(jī)溶劑對(duì)美洲大蠊醇提取物中蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響[J]. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志， 2012， 18（21）： 74-77.

WU Shaohui， LUO Tingshun， ZHANG Chenggui， et al. Stability of protein of ethanol extract from periplaneta americana with pH， inorganic salt and organic solvent [J]. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae， 2012， 18（21）： 74-77.

[21]閔思佳， 寺本彰. 有機(jī)溶劑對(duì)絲素蛋白質(zhì)溶液的影響[J]. 浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 1996，22（4）： 399-403.

MIN Sijia， TERAMOTO Akira. The effect of solution of fibroin protein on organic solute [J]. Journal of Zhejiang Agricultural University， 1996，22（4）： 399-403.

[22]YANG Y， SHAO Z， CHEN X， et al. Optical spectroscopy to investigate the structure of regenerated bombyx mori silk fibroin in solution [J]. Biomacromolecules， 2004， 5（3）： 773-779.

[23]MADER J S， HOSKIN D W. Cationic antimicrobial peptides as novel cytotoxic agents for cancer treatment [J]. Expert Opinion on Investigational Drugs， 2006， 15（8）： 933-946.

[24]何鳳群， 曾成鳴. 牛血清白蛋白淀粉樣纖維化及其細(xì)胞毒性[EB/OL].（2010-02-11）[2018-11-09]. http：//www.paper.edu.cn/releasepaper/content/201002-445.

HE Fengqun， ZENG Chenmin. Amyloid fibrillation of bovine serum albumin and the fibrillary cytotoxicity [EB/OL]. （2010-02-11）[2018-11-09]. http： //www. paper. edu. cn/ releasepaper/content/201002-445.