李 超 李 紅 劉 娜 黃竹清

（1遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，遼寧沈陽110161；2沈陽恒生生物科技發(fā)展有限公司，遼寧沈陽110500）

雜交育種是目前食用菌育種中應(yīng)用最廣泛、收效最顯著的育種方法。通過遺傳基因重新組合，在雜交后代中篩選出優(yōu)良的新品種，利用雙親性狀的優(yōu)勢互補或借助其中一個親本的優(yōu)點去克服另一親本的缺點，方向性和目的性都比較明確[1]。雜交育種技術(shù)中以單孢雜交方法最精確，故應(yīng)用較多[2]。金針菇（Flammulina velutiper）又名金菇、構(gòu)菌、樸菇、冬菇等，是我國最重要大宗食用菌之一。金針菇是典型的四極性異宗結(jié)合食用菌，有性世代中，成熟的子實體在菌褶上形成無數(shù)的擔(dān)子，每個擔(dān)子上產(chǎn)生四個擔(dān)孢子，利用不同菌株間產(chǎn)生的不同交配型的單核菌絲配對雜交形成雙核菌絲的原理，可以選育出新的雜交菌株。依據(jù)此原理，筆者于2006年以來，一直進行單孢雜交育種，旨在選育出高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的金針菇雜交新菌株?，F(xiàn)將遼白金針菇2號選育報道如下。

1 材料與方法

1.1 雜交親本

白金針菇1號和韓白金針菇菌株均為遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所的保存菌株。

1.2 培養(yǎng)基

單孢子分離培養(yǎng)基：WA培養(yǎng)基。瓊脂20 g，蒸餾水補足1000 mL。將所有培養(yǎng)基進行高壓蒸汽滅菌，然后在超凈工作臺上將15 mL培養(yǎng)基倒入皮氏皿中或6 mL培養(yǎng)基加入試管中。

單核菌絲配對雜交培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基。去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，加水1000 mL，磷酸二氫鉀3 g，硫酸鎂1.5 g，pH自然。

栽培料基質(zhì)：木屑30%，玉米芯30%，棉籽殼20%，麩皮18%，蔗糖1%，石膏1%。料含水量63%。

1.3 單孢子收集與分離

采集菇蓋稍大的金針菇子實體，用無菌水沖洗并陰干，在超凈工作臺上把子實體固定在無菌采集皿中，于22℃培養(yǎng)3～5 d[3]。然后將裝有孢子的培養(yǎng)皿密封好置于4℃冷藏備用。

在超凈工作臺上，用移液槍（10～100 μL）吸取少量無菌水，然后從培養(yǎng)皿中蘸取少量孢子粉注入1號三角瓶中攪拌均勻，從1號三角瓶中吸取5 mL懸液注入2號三角瓶攪拌均勻。依此稀釋至第8號三角瓶，得到一系列孢子懸浮液[4]。

在顯微鏡下分別觀察1～8號三角瓶中的懸浮液，選擇400倍單個視野中含2～3個孢子的懸浮液為最佳接種液。

用移液槍吸取稀釋最佳濃度的懸浮液0.5 mL到平板PDA培養(yǎng)基上，然后均勻涂布，倒置避光培養(yǎng)5～8 d，待孢子萌發(fā)。培養(yǎng)溫度為22℃。

1.4 單核菌絲檢查

新菌落萌發(fā)至直徑為3～4 cm時，鏡檢單孢子萌發(fā)的菌絲，觀察有無鎖狀聯(lián)合，將無鎖狀聯(lián)合的單核菌絲轉(zhuǎn)接到PDA試管斜面上，22℃條件培養(yǎng)，待菌絲長滿培養(yǎng)基后置于4℃條件保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 單孢雜交

將白金針菇1號菌株和韓白金針菇菌株的單核菌絲接種在同一培養(yǎng)基平板上，接種點相距3 cm，22℃培養(yǎng)15～18 d。鏡檢單核菌絲結(jié)合處，如果發(fā)現(xiàn)鎖狀聯(lián)合，說明配對雜交獲得成功。

1.6 雜交新菌株選擇與培養(yǎng)

將有鎖狀聯(lián)合的雜交菌絲接種在PDA平板培養(yǎng)基上，22℃黑暗培養(yǎng)12 d，從雜交組合中選擇菌絲生長速度快且菌絲生長勢強的雜交菌株，取菌落邊緣直徑為0.6 cm的菌塊轉(zhuǎn)接于試管斜面上。觀察菌絲生長勢及色澤。采用十字交叉法測量菌落直徑，計算菌絲生長速度。

圖1 金針菇不同菌株間的拮抗試驗

菌絲生長速度（mm·d-1）=菌落半徑（mm）/生長時間（d）。

1.7 拮抗試驗

在PDA平板內(nèi)，采用三點接種法分別接種親本菌株及雜交新菌株。每兩點間距2 cm，接種后在22℃恒溫箱培養(yǎng)，設(shè)定溫度為22℃。觀察記錄各菌株間的拮抗反應(yīng)。

1.8 酯酶同工酶電泳試驗

取親本及雜交菌株菌絲體，加入酶提取液在冰浴中研磨后，離心取上清液備用。采用聚丙烯酰胺垂直板凝膠電泳，將電泳后的凝膠浸入染色液中，觀察兩個親本菌株及雜交新菌株的酯酶同工酶電泳圖譜。

1.9 栽培對比試驗

采用17 cm×35 cm×0.004 cm聚丙烯塑料袋，每袋裝料折干250 g。接種后置于22～24℃培養(yǎng)室培養(yǎng)，菌絲滿袋后進行搔菌，再移入出菇室進行出菇管理。每個菌株設(shè)3次重復(fù)，每個重復(fù)200袋。測定金針菇子實體的菌柄直徑、菌柄長度、菌蓋直徑，總產(chǎn)量，以此計算金針菇生物學(xué)效率。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗試驗結(jié)果

雜交新菌株與白金針菇1號和韓白金針菇兩個親本菌株間的拮抗試驗如圖1所示。圖1結(jié)果充分表明，三個菌株間的任意兩個菌株均有非常明顯的拮抗線。

2.2 金針菇親本與雜交菌株酯酶同工酶電泳分析結(jié)果

白金針菇1號菌株、韓白金針菇菌株與金針菇雜交新菌株酯酶同工酶酶譜如圖2所示。白金針菇1號菌株和韓白金針菇菌株與金針菇雜交新菌株均有一條共同酶帶，Rf為0.312，圖2中箭頭1為親本白金針菇1號特異酶帶，Rf分別為0.165和0.395，箭頭2為親本韓白金針菇特異酶帶，Rf為0.728；金針菇雜交新菌株既含有兩條親本白金針1號特異酶帶，又含有一條親本韓白金針菇特異酶帶，只是酶帶寬窄、濃淡略有不同。從蛋白質(zhì)水平上證明金針菇雜交新菌株為親本白金針菇1號和親本韓白金針菇真正的雜交子。

圖2 金針菇不同菌株間酯酶同工酶酶譜

2.3 金針菇雜交菌株菌絲生長性狀測定結(jié)果

菌絲生長性狀測定是一種對菌株活力和生長速度判定的非常簡便有效快速的方法，在實際生產(chǎn)中經(jīng)常采用，可初步地判斷菌株的質(zhì)量。由表1結(jié)果可看出，雜交菌株長勢很好，粉孢子少，氣生菌絲少，均一度較好，這些都是優(yōu)良菌株的特征，符合優(yōu)良栽培菌株的特性。

表1 金針菇親本與雜交菌株菌絲生長速度及生長勢比較

表2 金針菇親本與雜交菌株農(nóng)藝性狀比較

表3 金針菇親本與雜交菌株的子實體產(chǎn)量、生物學(xué)效率

2.4 親本菌株與雜交菌株主要農(nóng)藝性狀比較

由表2和圖3可知，金針菇雜交菌株具有菌蓋小且不易開傘，菌柄長且較細的優(yōu)良性狀，而且菌柄基部無絨毛（大部分的白色金針菇菌株菌柄基部都有絨毛），可見，該菌株適合工廠化栽培。

2.5 金針菇雜交菌株子實體產(chǎn)量

從表3可以看出，金針菇雜交新菌株的子實體產(chǎn)量最高，平均生物學(xué)效率達到150.2%，比親本白金針菇1號菌株高12.7%，比親本韓白金針菇菌株高21.7%。

圖3 金針菇親本與雜交菌株的子實體形態(tài)特征

3 討論

食用菌雜交育種是一種遺傳物質(zhì)在細胞水平上的重組過程[5]。金針菇單孢雜交育種，必須分離到單孢子或剛由單孢子萌發(fā)的單核菌絲，因此鑒別單核菌絲非常重要。

雜交新品種的鑒別是金針菇雜交育種的重要工作。試驗從以下幾個方面對金針菇雜交新菌株進行規(guī)范性鑒別：一是觀察雜交菌株是否存在鎖狀聯(lián)合；二是進行與親本間是否存在拮抗現(xiàn)象的試驗；三是進行酯酶同工酶試驗，觀察雜種與親本的親緣關(guān)系；四是進行出菇試驗，觀察雜種能否結(jié)實及子實體的生長狀況。這些鑒別指標(biāo)是目前食用菌育種專家的共識[5-6]。

試驗選育出的金針菇雜交新菌株，在沈陽恒生農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司的中試試驗中，各項農(nóng)藝性狀指標(biāo)（生物學(xué)效率及形態(tài)特征等）均表現(xiàn)較好，但在工廠化生產(chǎn)的長期使用中，優(yōu)良性狀是否具有持續(xù)性，實際效果尚需進一步的栽培驗證。