賀國強 魏金康 鄧德江* 胡曉艷 吳尚軍 張國慶

（1北京市農業(yè)技術推廣站，北京100029；2北京農學院，北京102206）

羊肚菌（Morchella）是一種珍稀且美味的食藥兼用菌，于1818年被發(fā)現(xiàn)，在分類上隸屬于子囊菌門、子囊菌綱、盤菌目、羊肚菌科、羊肚菌屬。全球范圍內羊肚菌被視為珍貴的食用菌，是我國重要的出口食用菌產(chǎn)品之一。

羊肚菌分布范圍較為廣泛，世界上記載的羊肚菌共有28個種[1]，分布于亞洲、歐洲、北美洲及大洋洲的一些地區(qū)。其中我國記載羊肚菌屬有11個種[2]，分別為：黑脈羊肚菌（Morchella angusticeps）、肋脈羊肚菌（Morchella costata）、粗腿羊肚菌（Morchella crassipes）、小羊肚菌（Morchella deliciosa）、高羊肚菌（Morchella elata）、高羊肚菌紫褐變種（Morchella elata var.purpurascens）、羊肚菌（Morchella esculenta）Pers.））、羊肚菌堅挺變種（Morchella esculenta var.rigida）、羊肚菌褐赭色變種（Morchella esculenta var.umbrina）、薄棱羊肚菌（Morchella miyabeana）、普通羊肚菌（Morchella vulgaris）。

羊肚菌的馴化栽培最早始于法國，距今已有130余年的歷史[3]。1982年美國的Ron Ower等首次獲得了室內栽培形成的羊肚菌子實體[4]，隨后美國利用工廠進行了數(shù)年的羊肚菌產(chǎn)業(yè)化栽培，但由于某些原因以失敗告終。本世紀初我國也成功實現(xiàn)了人工栽培羊肚菌，并開創(chuàng)了羊肚菌大田栽培模式，對于羊肚菌產(chǎn)業(yè)化有重要意義。

根據(jù)菌蓋近中部與菌柄是否分離、菌蓋邊緣是否明顯向外伸展、菌蓋的形狀和顏色、蓋表棱紋排列和凹坑的深淺等特征，羊肚菌屬分為3個大類：黑色羊肚菌類、黃色羊肚菌類和半開羊肚菌類。目前我國可以人工栽培的羊肚菌基本均屬于黑色羊肚菌類，例如尖頂羊肚菌、羊肚菌[5，6]等。杜習慧等研究表明，由于環(huán)境和氣候等外界條件的變化會導致羊肚菌子囊果的形狀、大小、顏色的改變，甚至同一物種不同發(fā)育階段，其形態(tài)特征都有較大變化，例如梯紋羊肚菌不同發(fā)育階段的形態(tài)存在較大差異[7]。加之不同環(huán)境條件下，水分、空氣濕度、光線強弱等均會對羊肚菌的形態(tài)產(chǎn)生不同的影響，造成同一品種菇形差異較大。因此僅從形態(tài)特征上難以準確鑒定羊肚菌的種類，還需以分子標記加以輔助。Du通過對我國羊肚菌系統(tǒng)發(fā)育研究，發(fā)現(xiàn)中國有30種羊肚菌，其中有20個為本地種，9個種在歐洲也有分布，4個種可能是火燒適應種[8]。王波和鮮靈對四川地區(qū)人工栽培的羊肚菌進行了形態(tài)特征描述和ITS rDNA序列分析，表明該地人工栽培羊肚菌均為梯紋羊肚菌（Morchella importuna）[9]。

筆者對北京地區(qū)栽培的羊肚菌進行了采集和分析，以期確定北京栽培羊肚菌的種類。

1 材料與方法

1.1 菌株分離、培養(yǎng)與保存

羊肚菌新鮮子實體分別采集自北京懷柔、昌平等地人工栽培的新鮮菌子囊果，商品菌株編號分別為2022、黑脈、羊朱164。菌株純培養(yǎng)的分離采用組織分離法，三個商品菌株分別對應YD1701、YD1702和YD1703。菌株于25℃培養(yǎng)，4℃保存。

1.2 形態(tài)特征鑒定方法

對羊肚菌子實體進行了子實體的外觀形態(tài)和顯微形態(tài)特征觀察，記錄形態(tài)特征。

1.3 基于ITS序列分析的分類學鑒定

1.3.1 基因組DNA提取方法

圖1 人工栽培的3個品種羊肚菌子囊果的形態(tài)特征（從左至右為羊朱164、2022、黑脈羊肚菌）

以PDA平板上生長的新鮮菌絲體為材料，無菌條件下刮取，以DNA提取試劑盒（天根生化科技北京有限公司）提取基因組DNA。

1.3.2 ITS序列分析

ITS部分序列PCR擴增以真菌ITS通用引物ITS1和 ITS4，PCR 反應體系 50 μL。反應體系為50 μL，該體系包括2×PCR Master Mix 25 μL，Primer（0.2 μmol/L）各1.5 μL；模板DNA 1 μL，加ddH2O 補齊至50 μL。在BioRad My Cycle型PCR儀上擴增，PCR程序設定 94℃，3 min（預變性）；94℃變性1 min，54℃下退火1 min72℃，延伸2 min；共計30個循環(huán)；循環(huán)結束后在72℃延伸8 min。

1.3.3 測序

將ITS-PCR產(chǎn)物進行純化，操作方法依試劑盒的操作手冊進行，純化后的PCR擴增產(chǎn)物和引物直接測序，測序由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。

1.3.4 ITS序列分析

測序結果利用BLAST在線比對工具進行序列分析，并根據(jù)文獻報道，從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載羊肚菌屬多個種的ITS序列，使用Mega 6.0軟件中NJ法構建系統(tǒng)發(fā)育關系樹，分析同源關系，分析分類學地位。

2 結果與分析

2.1 子實體形態(tài)特征

對采集自北京懷柔區(qū)和昌平區(qū)的人工栽培的羊肚菌進行了形態(tài)特征描述，采集的3個羊肚菌樣品在子實體形態(tài)特征上無明顯區(qū)別（圖1）。羊肚菌子實體菌蓋為灰黑色、錐形，縱棱排列較規(guī)則，橫棱不規(guī)則，縱棱和橫棱交接形成似梯子狀的橫隔，凹坑深。菌蓋長8～10 cm，直徑2.3～2.8 cm；菌蓋與菌柄離生，菌蓋中空，菌柄柱狀，基部稍膨大，中空，白色；菌柄長度3.5～4.0 cm，直徑1.0～1.3 cm。子囊棒狀，無色，每個子囊內有8個子囊孢子，縱向或重疊排列，大小為（160～200）μm×（16～20）μm；側絲棒狀，頂端膨大，大小為（80～110）μm×（7～10）μm；子囊孢子橢圓形，無色，大小為（10～16）μm×（7～12）μm。

2.2 ITS擴增

對3個羊肚菌種樣品進行基因組DNA提取后，通過ITS1、ITS4引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物進行電泳檢驗，產(chǎn)物測序獲得YD1701、YD1702和YD1703菌株部分ITS序列，長度分別為720 bp、717 bp和716 bp。

2.3 羊肚菌屬的系統(tǒng)發(fā)育分析

采用Neighbor-Joining法構建3個羊肚菌和GenBank中下載的21個羊肚菌屬種的基于ITS系列的系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖（圖2）。待鑒定的羊肚菌3個樣品與Morchella importuna在同一個分枝上，其序列系相似性為99%，除Morchella sextelata外，與其它羊肚菌屬的6個種在不同分枝上。當序列相似性≥99%時，為相同物種，因此，待鑒定的3個人工栽培羊肚菌應為梯紋羊肚菌Morchella importuna。

圖2 3個羊肚菌樣品的ITS電泳圖譜

3 討論與結論

圖3 基于羊肚菌ITS rDNA序列的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹

近幾年，羊肚菌人工栽培已取得成功，并且在四川、重慶、湖北等地大面積栽培。2016年全國人工栽培羊肚菌突破1533.3 hm2，發(fā)展較為迅猛。由于早期缺乏分子標記的證據(jù)，不同條件下人工栽培的羊肚菌子囊果個體間差異較大，難以根據(jù)系統(tǒng)特性加以鑒定，最早利用仿生栽培的羊肚菌被認為是尖頂羊肚菌[5，10]。筆者將北京大面積栽培的羊肚菌ITS rDNA序列與GenBank中羊肚菌序列進行分析，發(fā)現(xiàn)北京人工栽培的羊肚菌為梯紋羊肚菌M.importuna。這與王波、杜習慧的報道一致[7，9]。而何培新等的研究表明，目前我國大面積種植的羊肚菌分別為梯紋羊肚菌、六妹羊肚菌和七妹羊肚菌[11]。

北京人工栽培的羊肚菌物種鑒定為梯紋羊肚菌，可能由于引種的原因，來源于四川，也可能由本地的野生羊肚菌馴化而來。目前，可以栽培的羊肚菌并不局限于梯紋羊肚菌。如在美國分布并實現(xiàn)人工栽培的變紅羊肚菌M.rufobrunnea。在我國云南等地尖頂羊肚菌也被用于仿生栽培獲得，但未見按照大田栽培模式的報道。因此，科研人員可以擴大羊肚菌種質資源的收集，加大野生羊肚菌的馴化栽培，或許可以篩選出可栽培的羊肚菌新種類。

研究結果表明，相對于其他主產(chǎn)區(qū)，北京地區(qū)目前大面積栽培的羊肚菌種類比較單一，為梯紋羊肚菌M.importuna。