趙金鳳 劉朝貴

（1重慶市渝北區(qū)經(jīng)濟作物技術(shù)推廣站，重慶渝北401120；2西南大學(xué)園藝園林學(xué)院，重慶渝北401120）

茶樹菇（Agrocybe cylindracea），隸屬真菌門（Eumycophyta），擔(dān)子菌綱（Basidomycetes），糞銹傘科（Bolbitiaceae），田菇屬（Agrocybe），又名柱狀田頭菇，楊樹菇，茶薪菇等[1]。目前對茶樹菇的研究主要集中在液體發(fā)酵條件、培養(yǎng)基的篩選和其生物活性上。試驗以茶樹菇為載體，研究了其富硒液體發(fā)酵培養(yǎng)條件，現(xiàn)將試驗結(jié)果總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

茶樹菇菌株由西南大學(xué)蔬菜實驗室提供。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 基礎(chǔ)平板培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基[2]。

1.2.2 液體種子培養(yǎng)基

葡萄糖 20 g，蛋白胨 4 g，KH2PO43 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，VB10.01 g，加水1 L，pH自然。

1.2.3 基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基

葡萄糖20 g，蛋白胨2 g，KH2PO43 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，Na2SeO35 mg，VB10.01 g，水1 L，pH自然。

1.2.3.1 碳源單因素試驗基礎(chǔ)培養(yǎng)基

將基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基里的碳源替換為葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麥芽糖、乳糖。

1.2.3.2 氮源單因素試驗基礎(chǔ)培養(yǎng)基

將基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基里的氮源替換為牛肉膏、黃豆粉、酵母膏、氯化銨、蛋白胨。

1.2.3.3 pH單因素試驗基礎(chǔ)培養(yǎng)基

將基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基的pH設(shè)定為5、6、7、8。

1.2.3.4 維生素單因素試驗基礎(chǔ)培養(yǎng)基

將基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基里的維生素替換為VB1、VB2、VB6

1.2.3.5 液體發(fā)酵正交設(shè)計

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以菌絲生物量（干）（后文菌絲生物量均指干重）、硒含量、富硒率和胞內(nèi)硒多糖的產(chǎn)量為考察指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗對碳源（A）、氮源（B）、pH（C）、維生素（D）4個因素進行優(yōu)化。富硒液體發(fā)酵的正交試驗結(jié)果見表1。

表1 富硒液體發(fā)酵的正交試驗

1.3 試驗方法

1.3.1 母種活化培養(yǎng)

將茶樹菇接種于基礎(chǔ)平板培養(yǎng)基上，（25±1）℃恒溫培養(yǎng)，菌絲長滿平板表面后待用。

1.3.2 種子培養(yǎng)基制作

取直徑8 mm的活化茶樹菇平板菌種8塊接入裝有100 mL已滅菌的液體種子培養(yǎng)基中，于25℃、120 r/min恒溫搖床振蕩培養(yǎng)10 d，得一級液體菌種。

1.3.3 菌絲培養(yǎng)

以10%的接種量將一級液體菌種接入裝有100 mL已滅菌的二級液體培養(yǎng)基中，于25℃、120 r/min，轉(zhuǎn)速恒溫搖床振蕩培養(yǎng)。每種培養(yǎng)基設(shè)3個重復(fù)。8 d后測定不同碳源、氮源、pH、維生素條件下菌絲生物量、硒含量和富硒率。

1.3.4 觀察測定方法

1.3.4.1 茶樹菇菌絲體生物量測定，參照參考文獻[3]。

1.3.4.2 硒標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

參照參考文獻[4]。

1.3.4.3 有機硒含量測定

總硒含量測定參照參考文獻[3]。樣品不經(jīng)消化處理，按上述測定總硒的方法測定無機硒含量。有機硒含量=總硒含量-無機硒含量。

富硒率計算方法：

2 結(jié)果與分析

2.1 硒標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照方法1.4.2，繪制了硒標(biāo)準(zhǔn)曲線，由圖1可知，標(biāo)準(zhǔn)硒溶液的濃度（x，μg/mL）和吸光度（y）在0～30 μg/L成線性關(guān)系?；貧w方程為：y=0.010x+0.008，R2=0.997。

圖1 硒標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 富硒茶樹菇液體培養(yǎng)基的篩選

2.2.1 不同碳源對茶樹菇菌絲生物量、硒含量及富硒率的影響

在碳源單因素試驗中采用了5種不同的碳源（葡萄糖、淀粉、乳糖、蔗糖和麥芽糖）作為茶樹菇液體富硒的碳源，研究這幾種碳源對茶樹菇菌絲干生物量、硒含量及富硒率的影響。由表3可以看出，這五種碳源茶樹菇都能利用，從菌絲生物量、硒含量及富硒率方面看，都以葡萄糖為最好。當(dāng)葡萄糖作為碳源時，菌絲生物量達0.29 g/50 mL，硒含量達49.5 μg/g，富硒率達5.81%。這與單糖更容易吸收，更有利于菌絲體生長的報道一致[6]。通過最小顯著性檢驗（LSD）的結(jié)果可知，葡萄糖為碳源的菌絲生物量達到極顯著性水平，富硒率和乳糖差異不顯著。這五種碳源對含硒量的影響都不顯著。從菌絲生物量、有機硒及富硒率三方面考慮，選用葡萄糖、麥芽糖、乳糖作為茶樹菇富硒正交試驗的碳源。

2.2.2 不同氮源對茶樹菇菌絲干生物量、硒含量及富硒率的影響

在氮源單因素試驗中也采用了5種不同的氮源（牛肉膏、黃豆粉、酵母膏、氯化銨、蛋白胨）作為茶樹菇液體富硒培養(yǎng)的氮源，研究這幾種氮源對茶樹菇菌絲生物量、有機硒及富硒率的影響。從表4可以看出，不同的氮源對茶樹菇菌絲生長有不同程度的作用，就菌絲生物量而言，有機氮的利用較無機氮好，這是因為食用菌能利用有機氮而不能利用無機氮。就含硒量而言氯化銨最好，這可能是因為菌絲生長緩慢在搖瓶過程中不斷吸附亞硒酸鈉，形成硒絡(luò)合物，從而轉(zhuǎn)化為有機硒。富硒率則以牛肉膏、黃豆粉、蛋白胨最好，與酵母膏和氯化銨差異顯著。從菌絲生物量、有機硒及富硒率三方面考慮，選用肉膏、黃豆粉和蛋白胨作為茶樹菇富硒正交試驗的氮源。

2.2.3 不同pH對茶樹菇菌絲生物量、硒含量及富硒率的影響

pH的大小會影響食用菌菌絲生長過程中酶的活性，pH過高或過低都會對某些酶的活性起到抑制作用，從而使菌絲的代謝減緩，影響菌絲生長。一般認為pH對酶活性的影響是通過細胞內(nèi)H+或OH-影響酶蛋白的電荷及解離度，而改變酶的結(jié)構(gòu)和功能來實現(xiàn)的。由表5可以看出，當(dāng)pH為7時，菌絲生物量達到0.38 g/50 mL，與pH為5、6、8相比，菌絲生物量差異達到顯著水平。當(dāng)pH為5、8時，與pH為6、7相比，硒含量達到顯著水平。pH為7、8時，與pH為5、6相比，富硒率達到極顯著水平。綜合菌絲生物量、有機硒及富硒率三方面考慮，試驗選用pH為5、7、8作為茶樹菇富硒正交試驗的pH。

表3 不同碳源對茶樹菇菌絲生物量、硒含量及富硒率的影響

表4 不同氮源對茶樹菇菌絲生物量、硒含量及富硒率的影響

表5 不同pH對茶樹菇菌絲生物量、硒含量及富硒率的影響

表6 不同維生素對茶樹菇菌絲生物量、硒含量及富硒率的影響

2.2.4 不同維生素對茶樹菇菌絲生物量、硒含量及富硒率的影響

采用了三種不同的維生素，且每種維生素設(shè)了兩個不同的質(zhì)量。從表6可以看出，維生素對菌絲生物量的影響較小，菌絲生物量之間沒有顯著性差異。維生素對硒含量的影響較大，當(dāng)VB1為0.01 g時，硒含量達到49.50 μg/g，富硒率達到5.81%，硒含量和富硒率都達到極顯著水平。綜合菌絲生物量、有機硒及富硒率三方面考慮，試驗選用VB10.01 g、VB10.005 g、VB20.005 g作為茶樹菇富硒正交試驗的維生素。

2.2.5 茶樹菇富硒液體發(fā)酵正交實驗優(yōu)化

單因素試驗初步篩選了適合茶樹菇菌絲生長，具有較高硒含量和富硒率的較佳因子，為了考察這些因子的協(xié)同作用，按表1進行了正交試驗，結(jié)果如表7所示。根據(jù)表7的極差分析比較，4種因素對茶樹菇菌絲生物量影響大小依次為A＞B＞D＞C，碳源對菌絲生物量的影響最大。4種因素對茶樹菇菌絲硒含量影響大小依次為B＞D＞A＞C，氮源對菌絲干生物量的影響最大。4種因素對茶樹菇菌絲富硒率影響大小依次為A＞B＞D＞C，碳源對菌絲生物量的影響最大。綜合考慮菌絲生物量、有機硒及富硒率，實際最優(yōu)處理為：A3B3C2D1。由于三個指標(biāo)的最優(yōu)水平組合不一致，根據(jù)三個指標(biāo)的主次關(guān)系，硒含量和富硒率才是試驗最重要的指標(biāo)，所以根據(jù)硒含量和富硒率極差優(yōu)水平組合，提出預(yù)測優(yōu)處理為：A3B3C1D1，按此組合進行最優(yōu)驗證試驗。試驗結(jié)果：茶樹菇菌絲生物量為 0.23 g/50 mL，硒含量為58 μg/g，富硒率為5.34%。因此可以確定茶樹菇富硒液體發(fā)酵的最優(yōu)培養(yǎng)基為：乳糖 20 g，蛋白胨 2 g，KH2PO43 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，VB10.01 g，pH5，水1 L。

表7 富硒液體發(fā)酵的正交試驗結(jié)果和極差分析

3 小結(jié)

通過單因子試驗和正交試驗篩選了茶樹菇富硒及產(chǎn)胞內(nèi)硒多糖的最佳培養(yǎng)基。但是本試驗僅對液體發(fā)酵的碳源、氮源、pH和維生素進行了篩選，沒有對碳氮比、無機鹽等進行優(yōu)化，這些問題還有待于進一步研究。