李天芝，于新友

( 山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600)

非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）為有囊膜的病毒，大小約175 ～215 nm，只有1個血清型。ASFV 為線狀雙鏈DNA病毒，基因組大小約170 ～190 kb，兩端為可變區(qū)， 中間為保守中心， 包 含150 個ORF， 可 編 碼150 ～200 種蛋白[1]，其中結構蛋白28 種。根據(jù)P72 基因序列的差異，可分為24 種不同的基因型，我國流行的主要是基因Ⅱ型。病毒對外界環(huán)境抵抗力強，尤其在濕冷環(huán)境可長期存活。ASFV 宿主范圍較窄，僅能感染豬致其發(fā)生非洲豬瘟(African swine fever，ASF)，臨床表現(xiàn)主要為病豬高熱、厭食以及皮膚和內(nèi)臟器官廣泛出血[2]。世界動物衛(wèi)生組織(OIE) 和我國都高度重視ASF，分別把其作為必須通報的動物疾病和一類動物疫病[3-4]。

自2018 年8 月，ASF 在 我 國首次報道以來，迅速席卷全國[5]，不僅給我國養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失，還造成重大的經(jīng)濟、社會和政治影響[6]。目前尚無有效的商品化疫苗可用，也無有效治療藥物。其所引起的病變與豬瘟及細菌性敗血病等病變類似，因此，僅通過剖檢有時很難做出正確診斷，需借助實驗室方法確診。抗體檢測存在一定的缺陷：一是抗體產(chǎn)生的滯后性；二是抗體檢測不能判定現(xiàn)癥感染，故一般采取病原學方法進行確診。由于方法本身局限性及國家相關政策等原因影響，傳統(tǒng)的病原分離，間接免疫熒光滿足不了臨床樣本檢測的需求，針對ASFV 核酸的分子生物檢測方法是最適宜該病檢測方法。該病防控主要依靠撲殺感染動物、完善的生物安全措施，為滿足現(xiàn)場早期、快速、準確排查ASF 疫情，阻止疫情在國內(nèi)的進一步蔓延的需求，需借助先進、科學、經(jīng)濟的分子生物學檢測方法。筆者綜述了ASFV 的6 種分子生物學檢測方法研究進展情況，希望為ASF 的診斷及防控工作提供參考。

1 核酸探針

核酸探針主要是基于堿基互補配對的原理，修飾后寡核苷酸探針可與待檢核酸單鏈退火形成雙鏈，利用修飾物進行抗原- 抗體反應，以放大信號，達到檢測目標核酸的目的。張鑫宇等[7]等根據(jù)GenBank 公布的22 株不同基因型的ASFV p72 基因比對和分析結果，選取保守基因序列，設計并合成一條寡核苷酸探針，探針5′端和3′端分別用生物素和烷巰基修飾，隨后將探針吸附到納米金顆粒上，制成金標記探針。探針與PCR 擴增的p72 基因保守序列進行雜交后，加入包被有鏈霉素親和素的酶標板進行反應，后用銀染法將信號放大。結果顯示，酶標板中可見黑色沉淀，該法檢測的敏感度為10 fmol/L ASFV 核酸。

2 納米PCR

納米PCR 技術是將納米材料應用PCR 所形成的一門新興技術，納米金粒子的應用可提高酶的活性和穩(wěn)定性，提高反應效率，改善非特異性擴增現(xiàn)象，提高PCR 檢測特異性[8]，縮短PCR 反應時間，使檢測更加具有準確性、可靠性。崔尚金等[9]根據(jù)ASFV 基因保守序列設計引物，建立了檢測ASFV 的納米PCR 檢測方法。結果顯示，該法特異性好，僅對ASFV 擴增出特異的552 bp 目的基因，不與豬常見的多種病原如豬瘟病毒（CSFV）、豬偽狂犬病毒（PRV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬圓環(huán)病毒2 型(PCV2) 等核酸發(fā)生交叉反應，敏感性高，最低可檢測10 個拷貝的質(zhì)粒DNA 量，檢測敏感性是常規(guī)PCR 的1 000 倍。

3 多重PCR 法

多重PCR 是在常規(guī)PCR 基礎發(fā)展起來的一種方法，在同一反應體系內(nèi)加入2 對及以上引物，可實現(xiàn)對多種病原的同時檢測，實現(xiàn)臨床疾病快速篩查。任梅滲等[10]參考PRV、CSFV、ASFV、PRRSV、副豬嗜血桿菌(HPS)、胸膜肺炎放線桿菌(APP) 以及多殺性巴氏桿菌(PM) 標準毒株序列，選擇各病毒和細菌的保守序列分別設計7 對特異性引物進行多重PCR。各項優(yōu)化試驗結果表明，當反應的退火溫度為51 ℃，各條引物濃度均為0.8 μmol/L 時，擴增的目的條帶效果最佳，用敏感性試驗檢測該反應中各病毒的最小檢出量分別為：1.01×102copies / μ L ( P RV )、1.48×103copies /μ L ( C S F V )、1.07 ×104copies/ μL(ASFV)、9.73×103copies/μL(PRRSV)、1.82×103copies / μL ( HPS )、1.65×103copies / μL ( P M ) 和3.64×103copies/μL(APP)。 在 最 優(yōu)化的反應條件下進行特異性試驗，結果未出現(xiàn)交叉反應，能檢出對應病原的多種血清型，陰性對照均無非特異性擴增。冷依伊等[11]根據(jù)公布的病原保守基因序列，建立了同時檢測ASFV、水皰性口炎病毒(VSV)、豬 口 蹄 疫 病 毒(FMDV)、CSFV 和PRV 的多種PCR 檢測方法，結果顯示，該法特異性好，對其他豬病原核酸無擴增反應條帶；該法敏感性好，對ASFV、PRV、FMDV、CSFV和VSV 的最低檢測限度分別為5.71 copies/μL、8.82×103copies/μL、4.32×102copies/μL、6.87×104copies/μL和4.93×104copies/μL，可用于臨床樣本的快速篩查。

4 熒光定量PCR

熒光定量PCR（qPCR）是將傳統(tǒng)PCR 與光譜技術結合發(fā)展的一種檢測技術，具有PCR 的所有優(yōu)點，可直接觀察擴增結果，不需要后續(xù)電泳檢測擴增產(chǎn)物，減少了對環(huán)境氣溶膠污染的可能，避免了假陽性結果，可實現(xiàn)樣品的定性和定量檢測。據(jù)信號基團的不同，qPCR 可以分為染料法和探針法兩種。曾少靈等[12]基于ASFV VP73 基因設計引物和探針，建立了檢測ASFV 的熒光PCR 方法，并與OIE 推薦的方法進行比對。結果顯示，該方法敏感性高，檢測限度 為10 copies/μL， 同OIE 推 薦 方法敏感性一致，是常規(guī)PCR 的10倍，批內(nèi)和批間重復性實驗的CV值均不高于3.14%，具有良好的重復性。王建華等[13]建立了一種基于CP530R 基因檢測ASFV 的TaqMan-MGB 熒光PCR 方法， 結果顯示，以質(zhì)粒標準品做模板，得到的標準曲線方程為y=-3.449x ＋38.10，相關系數(shù)為0.999，該方法不僅特異性好，對豬細小病毒(PPV) 、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬流感病毒(SIV)、PRRSV 和CSFV 等 核 酸 擴增結果均為陰性，最低可檢測61 個拷貝的質(zhì)粒標準對照分子，重復性試驗變異系數(shù)不高于2.0%，方法重復性好。

隨后王建華等分別根據(jù)ASFV、CSFV 和 高 致 病 性PRRSV 的CP530R、5 ′ UTR 和NSP2 基 因序列，設計引物和探針，建立了同時檢測這3 種病毒的多重熒光RTPCR 檢測方法，結果顯示，該方法特異性好， 不與PRV、PCV2、SIV、PPV 和PEDV 等核酸發(fā)生交叉反應，對ASFV 的最低檢測限度為61 copies/μL，對CSFV 的最低檢測限度為11 copies/μL 和對高致病性PRRSV 核酸的最低檢測限度為41 copies/μL。組內(nèi)和組間變異系數(shù)均不高于2.5%，說明方法特異性好[14]。李霆等[15]根據(jù)ASFV E184L基因設計1 對引物及相應探針，建立檢測ASFV 的TaqMan 熒光PCR方法。結果表明，該方法選擇的引物具有高度靈敏性和特異性，以標準品在重組質(zhì)粒為模板建立的標準曲線線性關系良好，相關系數(shù)為0.992，對ASFV 核酸最低檢側限為1.5 拷貝， 且與PRV、PPV、PCV2等多種病原不存在交叉反應。

5 微滴數(shù)字PCR

微滴數(shù)字PCR (Droplet digital PCR，ddPCR) 是近年來新出現(xiàn)的新型PCR 方法，主要通過油包水的技術原理，將配置的PCR 反應體系，分割成多個納米微滴，使得每個微滴不含或僅含少量待檢的核酸分子，每個微滴均為獨立擴增系統(tǒng)[16]，依據(jù)泊松原理得出起始模板絕對含量[17]，不依賴Ct 值或內(nèi)參基因，即可最低定量檢測單拷貝的核酸分子，精確性更高。鄔旭龍等[18] 根 據(jù)ASFV 保 守 的K205R 基因，設計并合成1 對引物及Taq Man探針， 同時建立了檢測ASFV 的qPCR 和ddPCR 方法，并對這兩種方法從線性關系、敏感性、特異性和重復性等多方面進行評估。結果顯示，兩種檢測方法線性關系較好(R2≥0.998)， 但ddPCR 檢 測 敏 感性是qPCR 的10 倍，最低檢測限度為10 拷貝/ 反應，而qPCR 的最低檢測限度為102拷貝/ 反應，所建ddPCR 檢測ASFV 方法特異性好，與PRRSV、CSFV、JEV、PCV2、PRV、FMDV 等核酸無交叉反應，重復性結果顯示，該法組內(nèi)變異系數(shù)在2.84% ～5.16% 之間、組間變異系數(shù)在3.68% ～5.14% 之間，說明方法重復性好。

6 環(huán)介導等溫擴增技術

環(huán)介導等溫擴增(LAMP) 方法由日本學者Notomi 等發(fā)明，是一種核酸恒溫擴增技術，可用于臨床病原分子檢測，只需水浴鍋或恒溫箱等簡單設備即能開展實驗，通過在反應體系中加入特殊物質(zhì)使得反應結果肉眼可見，具有靈敏度高、操作簡單、反應時間短、臨床使用不需要特殊的儀器等優(yōu)點，特別適合在現(xiàn)場和基層部門應用。王華等[19]建立了檢測ASFV 的LAMP 檢測方法，結果顯示，該法可在62 ℃恒溫條件完成檢測反應，所用時間為60 min， 對核酸檢測敏感性為10 copies/μL， 是 常 規(guī)PCR 的100倍，特異性好，不與PCV2、PPV、PRV 等豬常見病原核酸發(fā)生交叉反應。田純見等[20]根據(jù)ASFV 高度保守的非結構DNA 聚合酶G1211R 基因設計引物，建立了ASFV 實時熒光LAMP 方法，并與熒光PCR 檢測結果進行比對，結果顯示，該法檢測靈敏度達21 pg，優(yōu)于熒光定量PCR 方法。 重復性試驗LAMP 檢測批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于5%。該法特異性良好，與PCV2、PRV、CSDFV、PRRSV 及昆蟲核酸無交叉反應。王學慶等[21]根據(jù)ASFV 保守基因序列，設計特異性引物，建立一種檢測ASFV 的LAMP 擴增方法。該方法能在58 ℃恒溫條件下50 min 內(nèi)完成檢測反應，敏感性實驗表明，最低可檢出5 copies/μL的ASFV 核酸，該法與健康豬樣本、PRRSV 和PPV 核酸樣本不發(fā)生交叉反應，特異性強。所建立的檢測方法反應結束后，無需開蓋，可避免氣溶膠造成的污染。通過肉眼觀察反應液顏色變化判讀結果，若反應液呈黃色，結果判為陽性；若反應液呈橙紅色，結果判為陰性。

7 重組聚合酶擴增技術

重組聚合酶擴增(recombinase polymerise amplification，RPA) 技術是的一種核酸檢測新技術[22]，它是由英國TwistDx Inc 公司于2006年成功研發(fā)。該技術主要利用3 種酶，重組酶、具有聚合鏈置換功能的DNA 聚合酶和單鏈結合蛋白，代替了傳統(tǒng)PCR 的熱循環(huán)解鏈過程實現(xiàn)核酸快速大量擴增[23]，25 ～42 ℃等溫條件下，30 min 內(nèi)實現(xiàn)對靶基因的指數(shù)級擴增，不需要昂貴的儀器設備，產(chǎn)物的檢測可通過凝膠電泳、熒光檢測儀、側向流試紙條(LFD)、生物芯片等多種不同方法，具有靈敏度高、特異性強、檢測時間短、結果讀取多元化、操作簡便等優(yōu)點。能滿足疫病快速現(xiàn)場檢測的需求。王建昌等[24]根據(jù)ASFV 保守性強的p72 基因序列，設計RPA 引物，建立了檢測ASFV 的RPA 檢測方法。 結果顯示，該方法可在38 ℃恒溫條件下30 min 內(nèi)完成檢測反應，該方法檢測敏感性高，與OIE 推薦測熒光PCR 檢測方法一致，對含p72 基因重組質(zhì)粒的最低檢測限度為100 拷貝，特異性檢測表明該法特異性好，不與口蹄疫病毒(FMDV)、CSFV、PRRSV、PRV 和PCV2 等核酸發(fā)生交叉反應。哈登楚日亞等[25]設計了3 對針對ASFV p72 基因的引物和探針，優(yōu)化反應條件后，選取最佳的1 對引物和相應探針，建立了ASFV 的RPA 檢測方法。結果顯示，該法20 min 內(nèi)完成檢測反應，全程反應溫度維持39 ℃恒溫，特異性好，與CSFV、PCV2、PPV、PRV 等核酸均無交叉反應，最低檢測限度為10 拷貝。吳映彤等根據(jù)ASFV 多基因家族成員MGF360-12L 基因序列，設計引物， 建立了ASFV RPA 等溫檢測方法。結果表明，所建立的RPA 方法于35 ℃恒溫反應30 min，即可實現(xiàn)對目的片段的穩(wěn)定擴增，以含有MGF360-12L 基因的重組質(zhì)粒為模板，RPA 反應的檢測限達到103個拷貝，同普通PCR 方法檢測限一致。此外，該法特異性好，僅對ASFV 核酸有陽性擴增結果，對PEDV、FMDV、CSFV、PRRSV、PRV 和PCV2 核酸均無擴增。

林彥星等根據(jù)ASFV 基因組中序列保守穩(wěn)定的B646L 基因設計特異性引物和探針，建立了ASFV 核酸RPA 快速檢測法。結果顯示， 該法特異性強， 能準確 檢 測ASFV 核 酸， 與CSFV、PRRSV、PCV2、FMDV、豬A 型塞內(nèi)卡病毒(SVA) 等滅活病毒核酸無交叉反應，敏感性高，最低可檢測到2×101copies/μL， 檢測時間短，15 min 即可完成反應，且具有很好的重復性?？姲l(fā)明等[26]建立了一種簡便、快捷的現(xiàn)地檢測ASFV 的方法， 該法聯(lián) 合RPA 和LFD 技術，針對ASFV P72 基因保守區(qū)域，設計兩條引物和一條nfo探針，下游引物5′端標記生物素，nfo 探針5′端異硫氰酸熒光素或6-羧基熒光素，3′端帶有阻斷物，序列內(nèi)部標記THF 分子，通過引物濃度、RPA 反應時間和溫度等條件的優(yōu)化建立了一種可以用于ASFV 現(xiàn)地檢測的RPA-LFD 方法。該檢測方法在38 ～46 ℃恒溫反應10 min即可實現(xiàn)對ASF 目的基因的有效擴增，與CSFV、PCV2、豬乙型腦炎 病 毒（JEV）、PEDV、PRRSV、PRV 等均無交叉反應。RPA 擴增產(chǎn)物直接用LFD 肉眼觀察，最低檢測限為102拷貝/ 反應，靈敏度與TaqMan 熒光定量PCR 相當。

8 小結

非洲豬瘟是國際公認對養(yǎng)豬業(yè)危害最嚴重的疾病，世界各國均高度重視，豬場一旦發(fā)病，按國家政策應全部撲殺。目前該病在我國全國均有流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成毀滅性打擊，使養(yǎng)豬人喪失養(yǎng)豬信心。我國是以散戶為主的養(yǎng)殖模式，居民普遍喜食熱鮮肉，由此產(chǎn)生大規(guī)模生豬調(diào)運，注定非洲豬瘟的防控工作必將是一場持久戰(zhàn)。雖然該病已流行近百年，但對其致病機理尚不明確，因病原獨特性質(zhì)，疫苗研究未取得突破性進展，甚至其消毒劑及診斷制品的研究還不完善，還有大量工作要做。該病雖然在全國范圍多點散發(fā)，但傳播速度非常慢，早期診斷后，通過相應的消毒及生物安全防控措施可將豬場損失降低。為開展非洲豬瘟分子流行病學調(diào)查，了解病毒傳播途徑，掌握疾病流行動態(tài)，防止疫情擴散和蔓延，需依靠大量快速、敏感、成本低、操作簡單的高質(zhì)量檢測試劑。

當前ASFV 分子生物學檢測方法有多種，但各有利弊，探針檢測法雖然可實現(xiàn)高通量檢測，一次可檢測大量樣本，但操作較復雜。納米PCR 方法雖然檢測速度快、敏感性高、特異性強，但不能實現(xiàn)對病原的定量檢測，且納米材料不易獲得。多重PCR 方法，雖然可實現(xiàn)對多種疾病的快速篩查，但因所用引物眾多，反應條件很難兼顧，致檢測敏感性不高，易導致漏檢。熒光PCR 檢測方法較成熟，檢測速度快，可實現(xiàn)病原定量檢測，但染料法特異性不好，很難篩選到好的引物，探針法探針合成價格較貴，且需要價格昂貴的儀器設備，很難在基層大面積推廣應用。LAMP 方法雖然簡單、方便，適合基層進行推廣應用，但引物設計復雜，且靈敏度太高，易出現(xiàn)假陽性結果，對非特異性擴增也很難鑒別。微滴數(shù)字PCR探針的設計同熒光PCR，原理復雜，操作過程對人員要求高，無需標準曲線，最低可檢測單拷貝核酸分子，可實現(xiàn)待檢靶樣品核酸絕對定量，目前普及程度不如熒光PCR，同樣不適合基層檢測。重組聚合酶擴增技術所用試劑價格昂貴，檢測成本高，引物設計規(guī)則不明。

當前，對ASF 無有效疫苗和治療藥物可用，只能靠嚴格的生物安全措施防控，制定嚴格標準，并嚴格執(zhí)行，規(guī)范引種與賣豬流程，進出車輛嚴格消毒。人員按規(guī)定隔離、消毒和換洗衣物。加強豬飼養(yǎng)管理，提供適宜溫度、濕度，降低豬只飼養(yǎng)密度，豬舍分割成小單元飼養(yǎng)，減少豬群應激。進出豬場飼料、藥品、疫苗、物資等嚴格熏蒸消毒，豬舍定期清理糞尿，做好滅蚊蠅及滅鼠工作。選擇質(zhì)量有保證的廠家對ASFV 有確定效果的消毒劑，如過硫酸鉀復合物、戊二醛等，消毒劑配制濃度要合理，保證消毒時間，并注意外界環(huán)境溫度，部分消毒劑在低溫環(huán)境無效。

因我國流行的ASFV 為強毒株，豬群常在抗體還未產(chǎn)生或抗體滴度不高時豬只已死亡，全球?qū)Ψ侵挢i瘟都是撲殺政策，所以當前檢測抗體的意義并不大，主要針對抗原檢測。隨著疾病的流行，ASFV 可能會變?yōu)槿醵局?，豬只出現(xiàn)隱性帶毒情況，到時檢測抗體可能更有意義。雖然針對ASFV 病原檢測方法有多種，但當前國家推薦的檢測方法是熒光PCR，國家農(nóng)業(yè)農(nóng)村部組織了比對，推薦了一些質(zhì)量符合要求的廠家。檢測時可選取全血、血清、唾液、糞便、扁桃體、淋巴結、脾臟等樣本，通常唾液中最早出現(xiàn)病毒，適合疾病早期篩查，一定要把握檢測時間，早發(fā)現(xiàn)、早剔除，減少豬舍中病原載量，否則可能就沒有意義。另外對檢測的唾液樣品最好不離心、不凍融，盡早檢測，以提高檢出率，否則可能會因核酸降解及病毒量減少造成漏檢。活體檢測排查針對病原可采集血樣，采樣時一定要防止豬只間交叉污染，全血的檢出率要高于血清。

雖然公認病豬脾臟為檢測的最佳組織，但一般不建議對疑似發(fā)病豬只解剖，以免造成大的污染面，可在腹股溝淋巴結切開一小口，取少量淋巴結檢測。如果條件允許的話不要選擇免核酸提取試劑盒，免核酸提取試劑盒雖然對病毒含量高的樣本擴增無影響，但對環(huán)境采樣或?qū)Σ《竞康偷臉颖?，少了核酸的富集和純化過程，必然會減少樣本陽性檢出率。核酸手提法操作繁瑣，時間長，對人員和儀器設備要求高，商品化核酸提取試劑盒分為柱式提取法和磁珠提取法兩種，磁珠法更適合大量樣本用核酸自動提取儀提取，不同廠家柱式法試劑提取效率不同。便攜式熒光檢測試劑及適合常溫保存和運輸?shù)脑噭┰诨鶎蛹膊〉脑\斷中必將發(fā)揮巨大的作用。相信，隨著技術的不斷進步，科研工作者一定會開發(fā)出更多價廉、質(zhì)優(yōu)的檢測試劑，以滿足基層豬場及實驗室檢測需求，從而更好地防控非洲豬瘟，減少豬場損失，保障我國養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。