(聊城市動(dòng)物疫病與控制中心，山東 聊城 252000)

腸球菌是一種重要的革蘭氏陽性球菌，也是一種重要的人畜共患病原體，某些腸球菌可以通過感染的畜禽直接傳染給人，甚至可以引起人的發(fā)病死亡。同時(shí)，腸球菌可以污染乳類和肉類等動(dòng)物性食品，人們常常因?yàn)槭秤梦醇訜峄蛑笫斓奈廴拘允称范霈F(xiàn)食物中毒。作為一種典型的機(jī)會性致病病原體，腸球菌具有極強(qiáng)的抵抗力，對多種臨床上常用的抗生藥物產(chǎn)生明顯的耐藥性，特別是近年來抗萬古霉素的腸球菌菌株不斷的增加，加之侵入性治療以及抗菌藥物廣泛應(yīng)用等因素，導(dǎo)致腸球菌耐藥菌感染的病例不斷增多，人們治療腸球菌所引起的感染難度逐漸增大，因此在臨床醫(yī)學(xué)上日漸引起廣泛的關(guān)注，該類細(xì)菌在食品和公共衛(wèi)生方面具有非常重要的意義。

國內(nèi)外對禽類的腸球菌病的研究大部分是關(guān)于細(xì)菌的分離和鑒定以及耐藥性的分析，對該菌的致病性研究微乎其微。本試驗(yàn)通過實(shí)驗(yàn)室保存的一株鴨源糞腸球菌，建立人工感染雛鴨的病理模型，觀察雛鴨的病理變化，研究鴨源糞腸球菌對雛鴨的致病特點(diǎn)，為進(jìn)一步認(rèn)識鴨源糞腸球菌的致病機(jī)理、建立病理學(xué)及臨床診斷方法提供可借鑒的參考資料。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1雛鴨接種實(shí)驗(yàn) 10羽1日齡櫻桃谷雛鴨在飼養(yǎng)7 d之后，隨機(jī)分為試驗(yàn)組和對照組，每組5羽。對試驗(yàn)組5羽雛鴨采取左側(cè)關(guān)節(jié)注射制備好的糞腸球菌懸液(重新復(fù)蘇，菌液濃度稀釋至3.0×108CFU/mL)0.2 mL。對照組5羽雛鴨經(jīng)相同的途徑接種0.2 mL相同條件下振蕩后的TSB培養(yǎng)基，雛鴨接種后常規(guī)飼養(yǎng)管理。

1.2雛鴨發(fā)病情況與臨床癥狀的觀察 接種后每天觀察兩組雛鴨的發(fā)病情況，包括精神、食欲、活動(dòng)情況、體格情況、被毛是否光滑以及糞便和其他分泌物性狀的觀察，每天觀察3-4次，記錄雛鴨最早發(fā)病的時(shí)間和發(fā)病時(shí)的具體病理癥狀，詳細(xì)觀察發(fā)病雛鴨病例癥狀的發(fā)展過程。

1.3雛鴨的病理學(xué)觀察 對死亡的鴨子及時(shí)剖檢，未死亡的鴨子于接種兩周后頸靜脈放血致死，并進(jìn)行剖檢。所有的鴨子在進(jìn)行剖檢之前首先觀察鴨子體表有無炎癥反應(yīng)，用手術(shù)刀劃開趾關(guān)節(jié)腔，觀察腔內(nèi)有無積液。然后按順序打開腹腔，胸腔、口腔和顱腔，觀察肝臟、心臟、肺臟、脾臟、胃、腸管、胰臟、腎臟、法氏囊、胸腺和腦等臟器的大體眼觀病變。采取所有剖檢雛鴨的主要臟器組織，將其放入10%中性福爾馬林溶液中固定。

1.4細(xì)菌學(xué)檢查 無菌條件下取血液、心臟、脾臟組織、關(guān)節(jié)材料，用接種環(huán)深入切口涂抹并劃線接種在含5% BSA的TSA培養(yǎng)基平板上，置于細(xì)菌培養(yǎng)箱37 ℃恒溫培養(yǎng)18-24 h，觀察菌落形態(tài)，從TSA平板中挑取單個(gè)的典型菌落涂片，進(jìn)行革蘭氏染色，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)，若觀察到的細(xì)菌與試驗(yàn)所用的接種菌具有一致的細(xì)菌形態(tài)，則可以認(rèn)為該病料中分離出的細(xì)菌來自于左側(cè)關(guān)節(jié)注射的供試菌液，判斷細(xì)菌分離為陽性。

1.5雛鴨的組織病理學(xué)檢查 對固定好的各個(gè)組織切取疑似病變的部位進(jìn)行梯度脫水、透明、浸蠟、包埋。制作石蠟切片，常規(guī)H.E染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察各組織的病理變化。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1雛鴨發(fā)病情況與臨床癥狀 實(shí)驗(yàn)組雛鴨5羽雛鴨接種2 d后均開始出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，主要表現(xiàn)為精神沉郁，羽毛蓬松，食欲不振，體型消瘦，喜臥惡動(dòng)，扎堆嗜睡，關(guān)節(jié)明顯腫大充血，腳蹼紅腫，腳蹼下方出現(xiàn)綠豆大小的紅斑，站立不穩(wěn)，跛行明顯。感染5 d后關(guān)節(jié)腫大略微消退，腳蹼彎曲，腳蹼處的紅斑轉(zhuǎn)變?yōu)榘毯劢M織，腳蹼皮膚壞死和脫落。感染一周后，雛鴨關(guān)節(jié)恢復(fù)正常，但腳蹼仍彎曲，跛行。至感染后14 d試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。

對照組5羽雛鴨從接種至試驗(yàn)結(jié)束時(shí)未出現(xiàn)任何臨床癥狀，正常采食飲水，活潑好動(dòng)，羽毛光滑鮮亮，生長速度快，無死亡現(xiàn)象。

2.2雛鴨的病理學(xué)變化

實(shí)驗(yàn)組雛鴨：

心臟：眼觀心包腔內(nèi)有少許液體(3/5)，液體呈淺黃色。

肝臟：眼觀肝臟略微腫大，質(zhì)地較脆(2/5)，顏色鮮紅。

脾臟：眼觀脾臟明顯腫大，邊緣鈍圓，切面濕潤(4/5)。

肺臟：眼觀肺臟表面有輕微的淤血(3/5)。

關(guān)節(jié)：眼觀關(guān)節(jié)明顯腫脹，觸摸有波動(dòng)感，切開后關(guān)節(jié)腔內(nèi)有黃色粘稠的液體(5/5)，關(guān)節(jié)軟骨中央有一棕黃色病灶(2/5)。

腎臟：眼觀腎臟略微腫脹(4/5)。

腳蹼：眼觀腳蹼明顯紅腫，腳蹼皮膚龜裂脫落(5/5)，左側(cè)腳蹼中央有一綠豆樣大小的病灶(2/5)。

卵黃囊：眼觀卵黃吸收不良(2/5)。

法氏囊：眼觀法氏囊輕微水腫(5/5)。

胸腺、胰臟、腎臟、胃、腸管和腦：眼觀均未見明顯的異常。

對照組5羽雛鴨：各器官組織均未見明顯的眼觀病理變化。

2.3細(xì)菌學(xué)檢查

實(shí)驗(yàn)組5羽雛鴨血液樣品細(xì)菌分離均為陰性，心臟樣品細(xì)菌分離均為陰性，脾臟樣品細(xì)菌分離均為陰性，關(guān)節(jié)樣品細(xì)菌分離均為陽性。

對照組5羽雛鴨血液樣品、心臟樣品、脾臟樣品、關(guān)節(jié)樣品細(xì)菌分離均為陰性。

2.4組織病理學(xué)變化

實(shí)驗(yàn)組：

心臟：有輕微的心包炎。

肝臟：肝細(xì)胞出現(xiàn)脂肪變性，中央靜脈周圍有大量淋巴細(xì)胞和異嗜性粒細(xì)胞浸潤。

脾臟：脾臟淋巴小結(jié)減少，可見大量橢球樣的結(jié)構(gòu)。

肺臟：肺臟淤血明顯，小葉間隔間質(zhì)增寬，三級支氣管內(nèi)有許多漿液性的滲出。

腎臟：腎小葉邊緣有大量異嗜性粒細(xì)胞浸潤，腎小管上皮細(xì)胞變性腫脹。

法氏囊：淋巴小結(jié)間隙增寬，淋巴小結(jié)皮質(zhì)區(qū)變薄、髓質(zhì)區(qū)淋巴細(xì)胞減少。

關(guān)節(jié)：關(guān)節(jié)囊滑膜層有大量異嗜性粒細(xì)胞浸潤。

對照組：各器官組織未見明顯的組織病理變化。

3 討論

雛鴨感染腸球菌后，根據(jù)雛鴨的臨床癥狀，分為急性和亞急性或慢性兩種病型。本實(shí)驗(yàn)通過左側(cè)關(guān)節(jié)接種7日齡的雛鴨，感染2 d后就出現(xiàn)了明顯的臨床病理癥狀，感染5 d后病情已經(jīng)開始好轉(zhuǎn)，感染一周后雛鴨幾乎完全恢復(fù)正常，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)未出現(xiàn)死亡病例。受感染的雛鴨發(fā)病急但是病程短，且未出現(xiàn)死亡，病理學(xué)觀察到的病鴨的病理變化特點(diǎn)與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的慢性感染病例的病變特征大致相同[1]，因此判斷本試驗(yàn)鴨源糞腸球菌的感染屬于亞急性感染。

根據(jù)細(xì)菌學(xué)檢查的結(jié)果，從所有病鴨的血液、心臟和脾臟中并未分離到原試驗(yàn)細(xì)菌，而從所有病鴨的關(guān)節(jié)內(nèi)都可以分離到原試驗(yàn)細(xì)菌；同時(shí)根據(jù)臨床癥狀的觀察，腳蹼出現(xiàn)了明顯的病理變化，表明病癥可以蔓延，也就是說試驗(yàn)過程中試驗(yàn)組雛鴨出現(xiàn)了菌血癥癥狀。從此分析得出兩種可能，一是雛鴨接種病原菌后，出現(xiàn)菌血癥，但菌血癥并不持續(xù)存在，隨著疾病的發(fā)展，菌血癥經(jīng)過一段時(shí)間后消失；二是菌血癥持續(xù)存在于受感染的病鴨體內(nèi)，但是在疾病的后期，病鴨接近康復(fù)，各組織器官功能逐漸恢復(fù)，對疾病的抵抗力增加，病鴨體內(nèi)的細(xì)菌含量很少，大部分殘留在關(guān)節(jié)部位，以致從其他樣品中難以分離到原試驗(yàn)細(xì)菌。

本實(shí)驗(yàn)中致病菌經(jīng)左側(cè)關(guān)節(jié)接種雛鴨，主要引起關(guān)節(jié)和腳蹼的炎癥反應(yīng)。在感染初期，關(guān)節(jié)明顯腫脹，觸之有波動(dòng)感，關(guān)節(jié)囊有許多漿液性的滲出，關(guān)節(jié)軟骨也出現(xiàn)了壞死現(xiàn)象，腳蹼紅腫，并有壞死；在感染中后期，組織器官的功能不斷恢復(fù)，機(jī)體抵抗力增加，關(guān)節(jié)和腳蹼腫脹消退，腳蹼上的壞死組織也轉(zhuǎn)變?yōu)榘毯劢M織。亞急性感染的病禽病理變化隨感染部位的不同而不同，可見關(guān)節(jié)腫大，關(guān)節(jié)囊內(nèi)有大量纖維素性滲出物蓄積，腳蹼腫脹和壞死[2]。分析認(rèn)為，在疾病的發(fā)展過程中，出現(xiàn)菌血癥，病原菌或毒素隨著血液循環(huán)侵害機(jī)體，炎癥主要蔓延到腳蹼組織。到疾病后期，隨著菌血癥減弱或消失，炎癥反應(yīng)逐漸減弱，病癥也隨之恢復(fù)。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)論

鴨源糞腸球菌經(jīng)關(guān)節(jié)注射雛鴨后表現(xiàn)出明顯的致病性，主要為亞急性的感染，引起關(guān)節(jié)發(fā)炎、腫大；腳蹼炎癥、腫脹和壞死；并附有輕微的漿液性心包炎；但不引起雛鴨死亡。