張智剛 魏啟超 范學偉

（1黑龍江省肇東市動物疫病預防控制中心，黑龍江肇東 151100；2哈爾濱中科基因技術有限公司，黑龍江哈爾濱150028；3黑龍江農業(yè)經濟職業(yè)學院，黑龍江牡丹江 157041）

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea,PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的豬的一種急性、高度傳播性的腸道疾病。不同年齡的動物均容易感染PEDV，常引起新生仔豬嘔吐、嚴重水樣腹瀉和脫水，死亡率可達100%。近年來，雖然我國乃至全球許多豬群接種了CV777株相關疫苗，但哺乳仔豬依然感染PEDV，出現高死亡率。多項研究表明，造成PED疫情暴發(fā)流行的病因為高毒力PEDV變異株，與經典CV777株的原型株相比具有顯著遺傳差異。因此，從分子生物學角度對PEDV進行遺傳進化分析顯得越來越重要。

PEDV為有囊膜的單股正鏈RNA病毒，分別由S基因、E基因、M基因和N基因編碼的纖突蛋白（spike protein,S）、小包膜蛋白（envelope protein,E）、膜糖蛋白（membrane protein,M）、核衣殼蛋白（nucleocapsid protein,N）4種結構蛋白，以及3個非結構蛋白（復制酶1a、1b和ORF3）構成。目前研究該病毒遺傳變異多對其S基因、M基因和ORF3基因進行分析比對。M基因編碼M蛋白，其能誘導機體產生針對病毒的中和抗體，其作為膜糖蛋白，參與病毒粒子組裝和出芽，在此過程中發(fā)揮重要作用。M基因PEDV各毒株之間高度保守，經常被研究者用來研究野生毒株的多樣性，并用來對臨床分離毒株之間的遺傳關系進行分析比對，因此對PEDV M基因的檢測分析可以用來判定PEDV流行毒株的流行類型，同時M基因目前還可以作為PEDV分子分群的重要依據。S蛋白是纖突蛋白，也是病毒重要的膜蛋白之一，是PEDV所有蛋白中抗原性最強的，它可以與宿主細胞的受體分子相互作用，從而在病毒的入侵和中和抗體的誘導方面發(fā)揮重要作用。最新研究也表明，S基因是重要的毒力基因，也常被用來對PEDV的遺傳變異進行研究。ORF3蛋白能夠形成離子通道，提高病毒的感染效率。ORF3基因與PEDV細胞適應性和病毒毒力有關，細胞傳代致弱毒的ORF3基因會發(fā)生突變而喪失其離子通道功能，所以該基因除了用于PEDV遺傳變異分析外，也可用于鑒別PEDV強、弱毒株。

有研究者對我國華南地區(qū)PEDV流行株M基因進行測序分析，結果顯示，各流行株間M基因核苷酸序列與國內參考株LJB/03的同源性為96.9%～97.5%，與國內較早分離株CH/S和經典毒株CV777的同源性分別為97.5%～98.1%、97.7%～98.2%，與國內其他地區(qū)參考株的同源性為96.9%～99.7%。結果表明華南PEDV流行株，尤其近年來的廣東PEDV流行株可能形成獨特進化分支，廣東PEDV流行株與部分國外毒株以及華南地區(qū)分離株均屬于II、III群，但是親緣關系較近，處于同一分支；與大部分屬于I群的代表性毒株、疫苗株非同一系，親緣關系較遠[1]。而研究發(fā)現安徽省PEDV分離株M基因除AH1304外均在第13氨基酸位點出現E→Q突變；6個N的核苷酸與氨基酸均未出現片段的增多或者缺失的現象。同源性分析顯示：M基因與參考毒株的核苷酸序列同源性分別為97.5%～100%，氨基酸同源性分別為97.8%～100%，遺傳進化樹分析表明分離株中AH1304株與弱毒株SD-M和attenuated DR13親緣性最近，其余安徽毒株與2013年美國流行毒株IA1和2012年中國流行毒株AH2012親緣關系更近；所有安徽PEDV毒株均與CV777標準毒株、中國LZC毒株親緣關系較遠[2]?？梢姲不帐EDV流行株也為變異株。

PEDV的S基因可分為S1基因和S2基因，其中S1基因更具遺傳變異性，通過分析PEDV分離株S1基因的遺傳變異性可以部分了解該毒株的變異情況，用于PEDV毒株變異和親緣關系等研究。對華北地區(qū)PEDV分離株的S1基因序列進行擴增與分析發(fā)現，PEDV分離株S1基因序列大小一致，其核苷酸和氨基酸序列同源性分別為97.3%～99.6%和91.4%～92.7%，但與CV777疫苗株同源性較低，而與國內PEDV流行株的同源性較高，這與國內多個研究報道基本一致。遺傳進化分析結果顯示，華北地區(qū)分離株位于G2b亞群，與中國流行的PEDV分離株相距較近，與疫苗株所屬分支相隔較遠，說明這些地區(qū)流行的PEDV毒株為變異株，可以部分解釋PEDV CV777弱毒疫苗對該地區(qū)流行的PEDV毒株防控效果較差的原因[3,4]。2015年黑龍江省分離株S1基因的核苷酸同源性分析發(fā)現其同源性為96.6%～100%，其中HLJ2015／DPI-1毒株與經典毒株CV777相比，S1基因在1 130～1 141bp處有12個核苷酸的缺失；S1基因系統(tǒng)進化樹分析顯示，PEDV S1基因分為GⅠ群和GⅡ群，此次試驗鑒定的PEDV毒株屬于GⅡ群的nonS—INDEL型毒株[5]。對云南6株PEDV分離株S基因分析顯示，2018和2013年云南分離株親緣關系都較遠，2013年的分離株主要為G2b亞群，而2018年的分離株主要為G2a和G2c亞群，并且在216位氨基酸上預測的N-糖基化位點出現NSSI→NSSF突變，尤其是中和抗原表位COE結構域中的絲氨酸取代而導致其可預測磷酸化，這些變異很可能會影響其抗原性和疫苗效果，導致PEDV控制效果不好[6]。這些研究結果將有利于相應地區(qū)PED科學防控措施的制定與實施，從而保障生豬養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。

ORF3基因也被用于對PEDV的遺傳進化分析。王恩雨等[5]利用RT-PCR方法對2015年在黑龍江省采集的35份PEDV陽性病料進行檢測，結果顯示ORF3基因核苷酸同源性為98.8%～100%，結合S1基因檢測分析發(fā)現該試驗鑒定的PEDV毒株屬于GⅡ群的nonSINDEL型毒株。南文金等[7]2015年對粵北地區(qū)新生仔豬腹瀉樣品中分離的5株PEDV流行毒株ORF3基因進行測序分析顯示，5個流行毒株ORF3基因全長均為675 bp，相互間核苷酸同源性為98.7%～100.0%，與參考序列同源性為94.5%～100.0%，多個核苷酸位點發(fā)生了共同突變。系統(tǒng)進化樹分析結果表明，PEDV可分為2個基因群，粵北地區(qū)流行的PEDV與2013—2015年間在中國部分地區(qū)、東南亞、北美洲和歐洲流行的PEDV遺傳關系較近，位于基因1群中的同一個亞群，而2011—2012年中國流行的PEDV主要毒株及疫苗毒株則歸類于另外2個基因亞群。結果表明，粵北地區(qū)新生仔豬腹瀉主要是由PEDV感染引起的，PEDV基因隨著時間推移呈現不斷進化和變異趨勢。有研究者對6株安徽PEDV毒株的ORF3進行測序分析，結果顯示其全長675 bp，編碼224個氨基酸，均比attenuated DR13弱毒株多17個氨基酸；與CV777標準株相比，有2個ORF3分別出現了1個新變異氨基酸；同源性分析顯示ORF3與參考毒株的核苷酸序列同源性為98.8%～100%，結合其他基因遺傳變異分析這些分離株為變異株[2]。另外，現有的PEDV弱毒疫苗株均為ORF3基因缺失毒株，而能引起自然感染發(fā)病的毒株ORF3基因沒有缺失，基于ORF3基因鑒別疫苗免疫和野毒感染的檢測方法對于該病的診斷具有明顯優(yōu)勢。

目前常見研究人員在對PEDV分析時把S1、M和ORF3基因序列測定后，結合起來進行遺傳進化分析，這樣更加準確。國內很多研究已證實國內各地流行株與經典毒株和疫苗株相比，其M基因和ORF3基因發(fā)生了變異，且臨床出現或與疫苗株相似或與變異株相似的流行毒株，這也許是我國近年來PEDV免疫失敗或保護率不佳的主要原因。所以從分子生物學角度對PEDV進行遺傳進化分析，對該病的防治、疫苗研制以及流行病學研究都有極其重要的意義。