文/王玉堂

上接2019年3期

六、魚類抗菌肽在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用研究

抗菌肽是水生動(dòng)物先天免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分，其在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的應(yīng)用可以提高水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物機(jī)體的免疫能力，增強(qiáng)抗病性，減少抗生素的使用和濫用帶來(lái)的危害，提高養(yǎng)殖動(dòng)物產(chǎn)品品質(zhì)。

（一）作為飼料添加劑的應(yīng)用

大量的研究表明，在魚用配合飼料中添加一定量的抗菌肽可以在一定程度上提高養(yǎng)殖水生動(dòng)物的生長(zhǎng)性能、免疫能力和抗病能力，且不同物種來(lái)源的抗菌肽對(duì)魚類具有交叉免疫作用。如在飼料中添加100mg/kg雞β防御素13（Ga1-13）可顯著提高羅非魚的生長(zhǎng)性能和抗感染能力；離體模擬試驗(yàn)表明，Ga1-13在低濃度下有顯著的抗黏附作用，說(shuō)明Ga1-13的抗黏附作用可能是促進(jìn)羅非魚生長(zhǎng)和抗凡隆氣單胞菌感染的機(jī)制之一。添加150mg/kg和200mg/kg的天蠶素抗菌肽，對(duì)湘云鯽有促進(jìn)生長(zhǎng)效果，可提高湘云鯽的溶菌酶活性；添加200mg/kg和250mg/kg時(shí)，可使湘云鯽血清中超氧化物歧化酶活性顯著提高。但對(duì)于抗菌肽能提高養(yǎng)殖對(duì)象生長(zhǎng)性能的機(jī)理還沒(méi)有確切有確切定論。

目前，有學(xué)者認(rèn)為抗菌肽可以改善動(dòng)物胃黏膜結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)腸道免疫功能，并可殺滅有害微生物，從而有利于動(dòng)物對(duì)飼料營(yíng)養(yǎng)的吸收利用，促進(jìn)生長(zhǎng)。翟少偉等通過(guò)向吉富羅非魚飼料中添加50mg/kg抗菌肽Surfactin，發(fā)現(xiàn)可顯著提高吉富羅非魚的IgM水平、補(bǔ)體C3水平和血清白蛋白質(zhì)水平，并提高血清溶菌酶活性，明顯增強(qiáng)了吉富羅魚的非特異性免疫能力。

有研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽能夠耐受顆粒飼料制粒時(shí)的高溫，在規(guī)?；l(fā)酵生產(chǎn)抗菌時(shí)，通過(guò)高溫濃縮工序，可充分殺滅菌體而不導(dǎo)致抗菌肽失活，產(chǎn)品應(yīng)用后不會(huì)導(dǎo)致環(huán)境生態(tài)問(wèn)題。在飼料中長(zhǎng)期添加抗菌肽，細(xì)菌不易產(chǎn)生耐藥性，無(wú)毒副作用、無(wú)殘留，屬一類環(huán)保型飼料添加劑。目前，國(guó)內(nèi)作為飼料添加劑生產(chǎn)應(yīng)用于抗菌肽主要是蠶抗菌肽AD-酵母制劑，大多數(shù)試驗(yàn)也都是圍繞這種抗菌肽進(jìn)行的。還沒(méi)有魚類抗菌肽商品化的報(bào)道，但在試驗(yàn)過(guò)程中表現(xiàn)出的廣譜性抗菌、抗病毒和抗寄生蟲活性展示了其在養(yǎng)殖生產(chǎn)中應(yīng)用的潛力。Noga等（2009）研究表明，虹鱒魚頭腎表達(dá)的具有cathelicidin關(guān)鍵特征的多肽，對(duì)多種革蘭氏陰性菌的陽(yáng)性菌具有明顯的抑菌活性，其最低抑菌濃度為2μg/mL。因此，尋找各種魚類內(nèi)源性抗菌肽，以現(xiàn)代生物技術(shù)方法工業(yè)化生產(chǎn)這些具有“種屬”專一或特異性的抗菌肽產(chǎn)品，將是“后抗生素時(shí)代”的一條出路。

（二）作為基因工程藥物的應(yīng)用

抗菌肽具有廣譜抗菌效果，且不受傳統(tǒng)抗生素耐藥菌株的影響，與典型的抗生素具有協(xié)同作用。隨著對(duì)魚類抗菌肽結(jié)構(gòu)與功能研究的進(jìn)一步深入，通過(guò)基因工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)抗菌肽的體外批量生產(chǎn)，將有可能是解決魚類養(yǎng)殖主要疾病的新型藥物。Chiou等（2009）將中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（CHO）細(xì)胞株中生物合成的重組對(duì)蝦（Penaeus monodon）抗菌肽chelonianin導(dǎo)入羅非魚體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)chelonianin可以有效地控制感染哈氏弧菌的羅非魚炎癥反應(yīng)，降低了羅非魚死亡率。

（三）抗菌肽轉(zhuǎn)基因功能的應(yīng)用

利用基因工程技術(shù)培育轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是動(dòng)物養(yǎng)殖新品種培育的一種途徑。借鑒已成功的昆蟲抗菌肽轉(zhuǎn)基因工程技術(shù)，把特異性肽基因轉(zhuǎn)入魚類特定細(xì)胞中讓其表達(dá)，從而產(chǎn)生抗病新品種，將為養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展帶來(lái)新契機(jī)。Sarmasik等（2002）將家蠶肽Cecropins基因?qū)肭圄~將中，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因個(gè)體具有比未轉(zhuǎn)導(dǎo)抗菌肽基因?qū)φ战M更高的抗菌活性。雖然研究抗菌肽轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是獲得抗病群體的理想途徑，但也面臨著周期長(zhǎng)和成功率低等諸多問(wèn)題。

七、抗菌肽在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的應(yīng)用前景

（一）研究開發(fā)魚類抗菌肽的迫切性

近年來(lái)，隨著工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展和城市污水的大量排放，全球性水環(huán)境污染日益嚴(yán)重，水環(huán)境中的有機(jī)物和無(wú)機(jī)物富營(yíng)養(yǎng)化、重金屬離子和某些難降解的農(nóng)藥等含量已超出水體的自凈能力。同時(shí)，隨著養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，養(yǎng)殖密度不斷升高，養(yǎng)殖動(dòng)物的排泄物和殘餌等積聚量也日益增加，進(jìn)一步加大了水環(huán)境的污染程度，致使水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物病害頻發(fā)，給我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大損失。為控制水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物疾病的發(fā)生，在防治水生動(dòng)物細(xì)菌性和病毒性疾病過(guò)程中大量使用抗生素類藥物，不僅破壞了水環(huán)境的微平衡，還增強(qiáng)了某些病原微生物的耐藥性，嚴(yán)重制約了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展，養(yǎng)殖水產(chǎn)品的藥物殘留超標(biāo)事件時(shí)有發(fā)生，不僅影響到消費(fèi)者健康，也制約了產(chǎn)品在國(guó)際市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力的提升。

因此，加快對(duì)主要水產(chǎn)養(yǎng)殖品種免疫防御的基礎(chǔ)性研究，調(diào)動(dòng)和開發(fā)養(yǎng)殖水生動(dòng)物自身的免疫能力，是開展健康養(yǎng)殖，實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展的重要戰(zhàn)略之一。水產(chǎn)動(dòng)物抗菌肽的研究加深了人們對(duì)水生動(dòng)物免疫防御機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為科學(xué)有效防治魚病開辟了一條有效途徑。同時(shí)隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，有可能通過(guò)轉(zhuǎn)抗凍基因等獲得抗病新品種。

（二）魚類抗菌肽的應(yīng)用前景

與抗菌素的單一作用位點(diǎn)不同中，抗菌肽是作用于細(xì)菌的整個(gè)細(xì)胞膜，使膜去極化或形成“孔洞”，造成細(xì)胞內(nèi)含物外流或肽分子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，與DNA、RNA等靶標(biāo)作用，進(jìn)而殺死細(xì)菌。除高效殺菌作用外，抗菌肽還具有明顯地殺傷真菌、病毒和原蟲的作用，并能選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞而不破壞正常細(xì)胞，是生物天然免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分。由于抗菌肽本身是來(lái)源于養(yǎng)殖動(dòng)物自身的一種小分子蛋白，動(dòng)物對(duì)其的排斥反應(yīng)很低，而且殺菌作用發(fā)揮到一定程度后，動(dòng)物體內(nèi)的很多蛋白酶就把抗菌肽降解了，檢測(cè)不到殘留物質(zhì)，對(duì)環(huán)境沒(méi)有任何污染，是一種無(wú)毒、無(wú)害、綠色、環(huán)保的產(chǎn)品。另外，抗菌肽還具有分子量小、熱穩(wěn)定性好、水溶性好、作用迅速，不易出現(xiàn)耐藥性突變等特點(diǎn)，它在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用，對(duì)提高魚體免疫力，減少甚至杜絕抗生素類藥物的使用，維持魚體健康，實(shí)現(xiàn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

（三）抗菌肽的制備方法

一般而言，抗菌肽可以通過(guò)以下3種途徑獲得：一是從生物體內(nèi)直接提取純化；二是化學(xué)人工合成；三是采用基因工程技術(shù)構(gòu)建抗菌肽基因工程株。但由于抗菌肽為體內(nèi)誘導(dǎo)合成，生物體內(nèi)的含量較低，從生物體中直接大量地提取難度較大，對(duì)技術(shù)和成本要求較高，難以規(guī)?；a(chǎn)。而化學(xué)合成的方法同樣存在成本較高的問(wèn)題。一般小于10個(gè)氨基酸殘基的多肽的合成較為經(jīng)濟(jì)，10個(gè)氨基酸殘基以上的多肽合成則很昂貴，限制了應(yīng)用。因此，利用基因工程方法來(lái)生產(chǎn)抗菌肽是一條有效途徑。

有關(guān)抗菌肽基因的表達(dá)研究，最初是在原核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行的，但由于抗菌肽對(duì)原核細(xì)胞有一定的毒性，因此，抗菌肽基因只能以融合蛋白形式在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)。近年來(lái)，以啤酒酵母、畢赤酵母、昆蟲等為基因工程宿主進(jìn)行表達(dá)、分離、純化及應(yīng)用的研究引起了專家學(xué)者的重視，為抗菌肽的開發(fā)與應(yīng)用奠定了良好基礎(chǔ)。

（四）抗菌肽的應(yīng)用效果

近年來(lái)國(guó)內(nèi)外的研究結(jié)果表明，除游離氨基酸外，動(dòng)物必須吸收利用一定數(shù)量的小肽才能達(dá)到最佳生產(chǎn)性能。國(guó)內(nèi)外很多實(shí)驗(yàn)證明，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，餌料中添加適量的小肽可增強(qiáng)魚類的免疫力，提高魚類的養(yǎng)殖成活率，提高飼料中各種礦物質(zhì)元素的利用率，提高魚體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成能力，促進(jìn)魚類的生長(zhǎng)?；钚噪淖鳛橐环N新型的飼料添加劑具有廣闊的前景。但目前由于相關(guān)技術(shù)的局限性，活性肽的研究仍處于初步階段，離規(guī)模化生產(chǎn)還有一定距離。

目前，已有越來(lái)越多的抗菌肽被克隆出來(lái)，品種涉及到鯰魚、鮭魚、羅非魚、比目魚、斑馬魚等多種魚類。從報(bào)道的序列來(lái)分析，它們的組成與結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，且沒(méi)有很高的同源性，但也存在著一些共同特征，如含有較多的精氨酸或賴氨酸而使分子帶正電荷；含有較多的疏水氨基酸，可使分子折疊成疏水或雙親性α螺旋結(jié)構(gòu)等。

體外研究表明，許多抗菌肽對(duì)魚類是特異性的，甚至其他動(dòng)物的病原微生物都具有殺傷活性，其最小抑菌濃度（MIC）多在毫摩爾水平，如鯰魚和泥鰍抗菌肽對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌和真菌的MIC為0.5mmol/L～2mmol/L之間；鱸魚的抗菌肽對(duì)殺鮭氣單胞菌、嗜水氣單胞菌等魚類致病菌的MIC甚至低至1.2mmol/L；此外，虹鱒和鱸魚的抗菌肽對(duì)某些寄生蟲也具有致死效力，但其殺傷作用需要較高的濃度，且其活性主要針對(duì)滋養(yǎng)體時(shí)期。

目前，國(guó)內(nèi)作為飼料添加劑使用的抗菌肽主要是蠶抗菌肽AD—酵母制劑，大多數(shù)試驗(yàn)也是圍繞這種抗菌肽進(jìn)行的。黃永彤等發(fā)現(xiàn)抗菌肽對(duì)雞有促進(jìn)生長(zhǎng)和提高免疫力的作用，與中草藥、抗生素相比，在出欄率、平均個(gè)體重量及飼料利用率等方面均無(wú)顯著差異，在出欄前3天停止投喂，抽檢無(wú)殘留。王廣軍等（2005）研究了抗菌蛋白在南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖中的應(yīng)用效果，結(jié)果表明，在飼料中添加抗菌蛋白，無(wú)論是日生長(zhǎng)率、相對(duì)增重、飼料系數(shù)及成活率、抗病能力方面均有顯著提高。此外，因抗菌肽能有效殺滅霉腐微生物，在機(jī)體內(nèi)還可以被蛋白酶降解，雙重安全保證使得抗菌肽還可以在飼料工業(yè)中作為防腐劑使用。