潘士印，安 娜，肖湘華，程 燕，王養(yǎng)正，劉先寧，朱秀萍，吳 潔

0引言

真菌性角膜炎(fungal keratitis，F(xiàn)K)是一種嚴重的致盲性眼病，嚴重者可致角膜溶解穿孔，目前臨床應用的抗真菌藥物眼部通透性差，療效不佳，最終患者甚至喪失眼球。相關統(tǒng)計研究均表明，真菌性角膜炎有逐年增加的趨勢。據(jù)我所微生物檢驗室統(tǒng)計分析自2000年以來，真菌性角膜炎的檢出率也呈上升趨勢。目前臨床常見真菌性角膜炎的致病菌為曲霉菌、鐮刀菌、白色念珠菌等[1-4]。針對真菌性角膜炎，抗真菌藥物往往因穿透性差，療效不佳或無效，甚至影響穿透或板層角膜移植手術治療，是目前真菌性角膜炎治療的難題，相關藥物及治療方法，一直是眼科研究的熱點[5-6]。核黃素-紫外線A角膜膠原交聯(lián)方法(corneal collagen cross-linking，CXL)，是以核黃素作為光敏劑，通過紫外線A引起的光化學反應，產(chǎn)生活性氧，通過賴氨酰氧化通路誘導，產(chǎn)生共價鍵或者基質(zhì)內(nèi)膠原的物理交聯(lián)[7]。CXL作為最新的治療技術，在國內(nèi)外已成功應用于圓錐角膜的治療[8-9]，但在真菌性角膜炎領域，尚處于探索階段。本文通過考察CXL聯(lián)合那他霉素體外及體內(nèi)眼部應用抗真菌效果，擬為該技術在臨床真菌性角膜炎的治療中的應用，提供實驗基礎。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗用真菌標準菌株黃曲霉菌、茄病鐮刀菌、白色念珠菌標準菌株，購于陜西省微生物研究所。接種于沙堡弱培養(yǎng)基在28℃恒溫培養(yǎng)48h后生長良好，用液體沙堡弱培養(yǎng)基制備1.5麥氏濁度的真菌孢子懸液用于實驗。

1.1.2實驗動物8周齡清潔級健康無眼疾新西蘭白兔30只，體質(zhì)量1.5～2.0kg(西安交通大學醫(yī)學院動物中心提供)。實驗動物飼養(yǎng)與使用符合《中華人民共和國標準發(fā)布2001年第10號》標準，并通過陜西省眼科研究所倫理委員會審核。

1.1.3主要儀器與試劑膠原交聯(lián)儀(瑞士IROC AG公司，Version2000型，波長365nm，紫外線光照能量8.81mW/cm2，光圈大小9mm)，德國Heidelberg公司HRT-Ⅲ激光掃描共聚焦顯微鏡，日本日立H-7650透射式電子顯微鏡，Topcon DC-3裂隙燈前節(jié)照相系統(tǒng)。那他霉素滴眼液(華北制藥股份有限公司，批號120401)，1g/L核黃素(德國MedioCROSS公司，批號11050215)，沙堡弱瓊脂及液體培養(yǎng)基(北京奧博星生物技術有限責任公司，批號20100902)。

1.2方法

1.2.1體外抗真菌效果研究

1.2.1.1核黃素與那他霉素比例對抗真菌效果的影響取1.5麥氏濁度白色念珠菌懸液100μL，加入到沙堡弱瓊脂培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)皿上涂布均勻。分別于培養(yǎng)皿中心加入30μL那他霉素-核黃素混合溶液(那他霉素滴眼液∶核黃素溶液=1∶0；1∶3；1∶1；3∶1；0∶1)，10min后用膠原交聯(lián)儀照射10min，再放入培養(yǎng)箱28℃恒溫培養(yǎng)36h后，測量抑菌圈并與未照射對照組比較，進行統(tǒng)計學分析。

1.2.1.2照射時間對抗菌效果的影響取1.5麥氏濁度白色念珠菌懸液100μL，加入到沙堡弱瓊脂培養(yǎng)基上。分別于培養(yǎng)皿中心加入30μL那他霉素-核黃素混合溶液(那他霉素滴眼液∶核黃素溶液=1∶1)，10min后用膠原交聯(lián)儀分別照射10、20min， 28℃恒溫培養(yǎng)36h后，測量抑菌圈并進行統(tǒng)計學分析。

1.2.1.3膠原交聯(lián)聯(lián)合那他霉素體外抗真菌效果實驗分組：采用黃曲霉菌、茄病鐮刀菌、白色念珠菌三種常見致病真菌，取1.5麥氏濁度真菌懸液100μL，加入到沙堡弱瓊脂培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)皿上涂布均勻。每種菌分為實驗組和對照組。對照組：于培養(yǎng)皿中心加入30μL那他霉素，28℃培養(yǎng)36h后，測量抑菌圈直徑。實驗組1：交聯(lián)聯(lián)合那他霉素組，于培養(yǎng)皿中心加入30μL那他霉素-核黃素混合溶液(1∶1)，10min后用膠原交聯(lián)儀照射10min，28℃培養(yǎng)36h后，測量抑菌圈直徑并與對照組比較，進行統(tǒng)計學分析。實驗組2：那他霉素聯(lián)合紫外照射組，于培養(yǎng)皿中心加入30μL那他霉素，10min后用膠原交聯(lián)儀進行紫外照射10min，28℃培養(yǎng)36h后，測量抑菌圈直徑并與對照組比較，進行統(tǒng)計學分析。實驗組3：那他霉素聯(lián)合核黃素組，于培養(yǎng)皿中心加入30μL那他霉素-核黃素混合溶液(1∶1)，28℃培養(yǎng)36h后，測量抑菌圈直徑并與對照組比較，進行統(tǒng)計學分析。實驗組4：單獨交聯(lián)組，于培養(yǎng)皿中心加入30μL核黃素溶液，10min后用膠原交聯(lián)儀照射10min，28℃培養(yǎng)36h后，測量抑菌圈直徑并與對照組比較，進行統(tǒng)計學分析。

表1核黃素與那他霉素比例對抗菌效果的影響

實驗分組加入藥量(μL)藥物比例(那他霉素∶交聯(lián)劑)照射時間(min)抑菌圈(x±s,mm)tP1對照組301∶0025.533±0.980實驗組301∶01025.283±0.9850.6230.5402對照組303∶1024.375±1.223實驗組303∶11025.783±0.413-3.7800.0013對照組301∶1025.156±0.941實驗組301∶11026.575±0.941-3.3910.0034對照組301∶3024.611±0.658實驗組301∶31026.122±1.642-2.5620.0215對照組300∶100實驗組300∶1100

1.2.2兔眼部應用抗真菌效果研究

1.2.2.1兔眼真菌性角膜炎模型的制備按隨機數(shù)字表法隨機選取20只兔制備真菌性角膜潰瘍模型。干燥保存的異種脫細胞角膜片復水備用，速眠新0.4mL肌內(nèi)注射麻醉兔，右眼結(jié)膜囊內(nèi)用鹽酸奧布卡因滴眼液點眼2次，間隔5min。鋪無菌洞巾，開瞼器開瞼，直徑7.5mm環(huán)鉆行角膜中央壓痕，刮除中央角膜上皮，無菌針頭在其上劃痕后涂抹1.5麥氏濁度的鐮刀菌孢子懸液(陜西省眼科研究所提供)。復水后的異種脫細胞角膜片修剪為直徑7.5mm的圓片，對位平鋪于兔角膜中央，10-0尼龍線間斷固定縫合角膜片，角膜片下再注射1.5麥氏濁度的鐮刀菌孢子懸液0.1mL，黑絲線縫合眼瞼。3d后拆除眼瞼縫線，行裂隙燈顯微鏡、眼前節(jié)照相和激光掃描共聚焦顯微鏡檢查，觀察角膜鐮刀菌的感染情況。

1.2.2.2實驗分組(1)正常對照組：5只健康兔作為正常對照組。(2)交聯(lián)對照組：另取5只健康兔，1g/L核黃素溶液點眼，5min/次，持續(xù)30min，在裂隙燈顯微鏡的鈷藍光照射下確認核黃素已經(jīng)進入前房。將實驗兔置于兔夾，開瞼，使用膠原交聯(lián)儀照射角膜中央10min。(3)模型對照組：隨機選取5只真菌性角膜炎模型兔，作為模型對照組。(4)交聯(lián)治療組：隨機選取5只真菌性角膜炎模型兔，1g/L核黃素溶液點眼，5min/次，持續(xù)30min，在裂隙燈顯微鏡的鈷藍光照射下確認核黃素已經(jīng)進入前房。將實驗兔置于兔夾，開瞼，使用膠原交聯(lián)儀照射角膜中央10min。(5)那他霉素治療組：隨機選取5只真菌性角膜炎模型兔，那他霉素滴眼液點眼，10min/次，持續(xù)2h，之后4次/d。(6)交聯(lián)聯(lián)合那他霉素治療組：隨機選取5只真菌性角膜炎模型兔，那他霉素滴眼液點眼，10min/次，30min后加點核黃素5min/次，持續(xù)30min，在裂隙燈顯微鏡的鈷藍光照射下確認核黃素已經(jīng)進入前房。將實驗兔置于兔夾，開瞼，使用膠原交聯(lián)儀照射角膜中央10min，之后繼續(xù)使用那他霉素滴眼液點眼，10min/次，共計5次，累計治療時間2h，之后那他霉素滴眼液點眼4次/d。

移動互聯(lián)網(wǎng)環(huán)境下，文化資源的傳播交互方式發(fā)生了變化，圖書館應該制定更為合理的文化治理模式，促進文化知識傳播，讓更多的讀者享受到優(yōu)質(zhì)資源。在未成年人公共文化服務方面，圖書館充分發(fā)揮自身優(yōu)勢，引入多元化文化治理主體，共同建設公共文化服務體系，可以解決大數(shù)據(jù)資源的處理難題，提高圖書館未成年人服務的效益。同時圖書館強化與政府、社會機構(gòu)間的合作，實現(xiàn)不同系統(tǒng)、不同區(qū)域文化服務的協(xié)同發(fā)展，也可以吸引更多人關注未成年人教育問題。如吸引家長、教師等參與到公共文化服務中，向他們提供有針對性的知識與技能，可以強化他們對未成年人教育的認知，形成全新的公共文化服務格局。

1.2.2.3激光掃描共聚焦顯微鏡檢查治療后第3、7、14、21d分別行眼前節(jié)照相和共聚焦顯微鏡檢查，觀察角膜情況。鹽酸奧布卡因滴眼液點眼2次，在顯微鏡探頭表面涂布2g/L卡波姆凝膠，在探頭前套上1個一次性無菌帽，開瞼器開瞼，助手固定兔頭部，通過調(diào)節(jié)主機上的手柄使戴有無菌帽的探頭與兔受檢眼角膜接觸，調(diào)節(jié)成像焦點平面，通過CCD攝像頭取像使角膜各層圖像通過計算機屏幕快速顯示并保存。

1.2.2.4各組角膜膠原纖維的超微結(jié)構(gòu)檢測治療2wk后空氣栓塞法處死所有實驗兔，剪取角膜組織，行掃描電子顯微鏡檢測。透射電鏡樣品制作及鏡下觀察：將角膜組織切成1mm×1mm×3mm的小條，經(jīng)過25g/L戊二醛固定、0.1mol/L磷酸緩沖液浸洗、10g/L四氧化鋨固定液固定、乙醇梯度脫水、環(huán)氧樹脂浸透包埋聚合后切片，切片美蘭染色后進行超薄切片50～70nm，醋酸鈾、檸檬酸鉛染色后，日本日立H-7650透射式電子顯微鏡下觀察、拍照。

2結(jié)果

2.1體外抗真菌效果

2.1.1核黃素與那他霉素比例對抗菌效果的影響通過抑菌圈大小及統(tǒng)計學分析，結(jié)果顯示：CXL單獨應用時對白色念珠菌無效；在不加入交聯(lián)劑，單獨應用紫外照射與那他霉素聯(lián)合應用時，兩組抗菌效果接近，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；CXL與那他霉素聯(lián)合應用時，各實驗組抗白色念珠菌效果優(yōu)于未照射對照組，且差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

2.1.2照射時間對抗菌效果的影響根據(jù)2.1.1的實驗結(jié)果，為保證抗菌效果，同時平衡那他霉素與核黃素的用量，因此選用那他霉素∶核黃素=1∶1的混合溶液進行下述實驗。向涂有真菌菌液的培養(yǎng)皿中加入30μL那他霉素-核黃素混合溶液(1∶1)，當使用角膜膠原交聯(lián)儀照射時間為20min時抑菌圈大小(27.340±0.782mm)與照射10min組(27.325±0.857mm)比較，差異無統(tǒng)計學意義(t=0.947,P=0.371)。從實驗結(jié)果可看出，照射時間長并不能增加抗菌效果，參照文獻及實驗結(jié)果，后續(xù)實驗照射時間均為10min。

2.1.3角膜膠原交聯(lián)術聯(lián)合那他霉素體外抗真菌效果針對黃曲霉菌、茄病鐮刀菌、白色念珠菌三種實驗菌，通過測量抑菌圈直徑觀察抗菌效果(表2～4)。實驗組1與對照組相比，抗真菌效果均明顯增強，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；實驗組4對三種菌均無效；當那他霉素與核黃素、那他霉素與紫外線分別聯(lián)合應用時，即實驗組2、3抗菌效果與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖1兔眼茄病鐮刀菌感染模型A：前節(jié)照相照片；B：角膜共焦顯微照片(×800)；C：角膜刮片檢查(×400)；D：內(nèi)皮檢查(×800)。

表2交聯(lián)聯(lián)合那他霉素體外抗黃曲霉菌效果

實驗分組藥物比例照射時間(min)抑菌圈(x±s,mm)P對照組那他霉素019.6±3.5實驗組1那他霉素∶核黃素=1∶11028.0±3.9<0.01實驗組2那他霉素1020.7±0.60.890實驗組3那他霉素∶核黃素=1∶1020.6±2.20.892實驗組4核黃素100

注：P值表示各實驗組與對照組之間抑菌圈大小的統(tǒng)計學分析結(jié)果。

表3交聯(lián)聯(lián)合那他霉素體外抗茄病鐮刀菌效果

實驗分組藥物比例照射時間(min)抑菌圈(x±s,mm)P對照組那他霉素028.3±1.0實驗組1那他霉素∶核黃素=1∶11033.4±1.2<0.01實驗組2那他霉素1030.6±0.60.052實驗組3那他霉素∶核黃素=1∶1029.4±0.90.102實驗組4核黃素100

注：P值表示各實驗組與對照組之間抑菌圈大小的統(tǒng)計學分析結(jié)果。

表4交聯(lián)聯(lián)合那他霉素體外抗白色念珠菌效果

實驗分組藥物比例照射時間(min)抑菌圈(x±s,mm)P對照組那他霉素026.7±1.0實驗組1那他霉素∶核黃素=1∶11027.6±1.10.033實驗組2那他霉素1027.0±0.40.823實驗組3那他霉素∶核黃素=1∶1027.4±1.10.112實驗組4核黃素100

注：P值表示各實驗組與對照組之間抑菌圈大小的統(tǒng)計學分析結(jié)果。

2.2兔眼真菌感染模型抗真菌效果

2.2.1兔眼茄病鐮刀菌感染模型角膜劃痕聯(lián)合異種脫細胞角膜片覆蓋后3d，裂隙燈顯微鏡下可見角膜病灶區(qū)呈灰白色混濁，角膜上皮缺失，熒光素染色(+)，角膜基質(zhì)水腫；激光掃描共聚焦顯微鏡下可見角膜混濁灶呈壞死樣高反光，其間見較多炎性細胞和真菌孢子，局部見短棒樣、豆莢樣菌絲，角膜刮片后顯微鏡下可見真菌菌絲及孢子，角膜后基質(zhì)細胞腫脹、體積增大，呈多邊形蜂窩狀的激活狀態(tài)，角膜內(nèi)皮細胞腫脹失去規(guī)則六邊形形態(tài)、邊界不清，局部見炎性細胞浸潤(圖1)。

2.2.2交聯(lián)聯(lián)合那他霉素對兔眼真菌性角膜炎的治療效果那他霉素治療組及交聯(lián)聯(lián)合那他霉素治療組病程約14d，單獨交聯(lián)組病程約21d；經(jīng)治療后，各治療組均已愈合，各組角膜上皮均無缺損，新生血管較多，淺基質(zhì)層均見瘢痕形成，各組深基質(zhì)層均無水腫，角膜內(nèi)無菌絲；前節(jié)照相結(jié)果顯示，交聯(lián)聯(lián)合那他霉素治療組治療結(jié)果優(yōu)于其它各治療組，瘢痕組織較少，角膜愈合較好，病程相對短；模型對照組病程約28d，上皮尚未完全愈合，瘢痕較深，新生血管密集，基質(zhì)局部輕度水腫，角膜內(nèi)無菌絲(圖2、3)。各組兔角膜的超微結(jié)構(gòu)改變：治療后掃描電子顯微鏡檢測結(jié)果顯示：模型對照組未見上皮細胞，膠原纖維間有數(shù)量較多的細胞，成纖維細胞呈扁平狀伸出較長的突起，細胞密度較高，可見發(fā)達的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體；其余各組均見上皮細胞，正常對照組和交聯(lián)對照組少見成纖維細胞；其余各模型治療組有少量成纖維細胞，形狀多不規(guī)則，有突起(圖4，表6)。

3討論

真菌性角膜炎的治療往往比較困難，早期診斷、及時治療對真菌性角膜炎患者具有重要的意義。藥物治療和手術治療往往同時進行，相輔相成合理應用，才能達到提高治愈率的目的。研制理想的抗真菌藥物，尋找更好的治療手段是真菌性角膜炎治療的重要方向。

圖2兔真菌感染模型治療前后前節(jié)照相A：治療前模型對照組；B：治療后模型對照組；C：治療前交聯(lián)治療組；D：治療后交聯(lián)治療組；E：治療前那他霉素治療組；F：治療后那他霉素治療組；G：治療前交聯(lián)聯(lián)合那他霉素治療組；H：治療后交聯(lián)聯(lián)合那他霉素治療組；I：治療前交聯(lián)對照組；J：治療后交聯(lián)對照組。

圖3治療后兔真菌感染模型角膜共焦顯微鏡結(jié)果(×800) A：模型對照組；B：交聯(lián)治療組；C：那他霉素治療組；D：交聯(lián)聯(lián)合那他霉素治療組；E：交聯(lián)對照組。

圖4治療后各組角膜組織掃描電子顯微鏡檢測結(jié)果(×50000) A：正常對照組；B：交聯(lián)對照組；C：模型對照組；D：交聯(lián)治療組；E：那他霉素治療組；F：交聯(lián)聯(lián)合那他霉素治療組。

表6治療后各組角膜組織掃描電子顯微鏡檢測結(jié)果

分組上皮細胞膠原纖維束纖維束直徑(x±s,nm)周期性橫紋成纖維細胞正常對照組可見大量致密,橫縱交錯,排列整齊24.6±1.8明顯少見交聯(lián)對照組可見排列紊亂,橫縱交錯30.7±2.1明顯未見模型對照組未見大量致密,排列整齊,較均勻25.2±1.4明顯較多,扁平狀伸出較長突起交聯(lián)治療組可見大量致密,橫縱交錯,扭曲明顯43.6±6.4a,c明顯少量,體積較小,形狀不規(guī)則那他霉素治療組可見大量致密,橫縱交錯,扭曲明顯32.0±3.0明顯少量,扁平狀,有細長突起交聯(lián)聯(lián)合那他霉素治療組可見大量,排列稍有紊亂46.0±4.6a,c明顯少量,體積較大,梭型,突起較長

注：aP<0.05vs正常對照組；cP<0.05vs模型對照組。

核黃素-紫外線A膠原交聯(lián)術除了在圓錐角膜領域廣泛應用以外，近年來在眼部其它疾病治療方面的應用研究也越來越多，如Fuch角膜營養(yǎng)不良[10]、大皰性角膜病變及細菌感染性角膜炎等[11-14]。針對真菌性角膜炎，Anwar等[15]、Hao等[16]報道了角膜膠原交聯(lián)術聯(lián)合兩性霉素B治療曲霉菌感染的角膜炎，聯(lián)合應用后，病程縮短，上皮缺損面積減小，角膜浸潤面積減小，避免了角膜穿孔的危險。但在Martins等[17]關于角膜膠原交聯(lián)術抗體外細菌和真菌的效果研究中發(fā)現(xiàn)，膠原交聯(lián)術對體外培養(yǎng)的白色念珠菌沒有明顯的抗菌效果，但與兩性霉素B聯(lián)合應用，則可顯著提高其抗菌效果。Sauer等[18]進一步的研究報道稱，膠原交聯(lián)術聯(lián)合兩性霉素B體外抗白色念珠菌、鐮刀菌、曲霉菌，與單獨應用兩性霉素B相比，抑菌效果具有顯著的差異。

本文針對黃曲霉菌、茄病鐮刀菌、白色念珠菌三種實驗真菌，實驗結(jié)果顯示，單獨應用CXL無效；但CXL可增強那他霉素的抗真菌效果，二者具有相加作用。實驗結(jié)果顯示，相比單獨應用那他霉素，核黃素-紫外線A聯(lián)合那他霉素應用后，抗真菌效果顯著增強，但是單獨應用核黃素-紫外線A，則無任何抗菌作用，從而考慮其機制為：多烯類抗真菌藥物在真菌微膜上形成微孔，從而促進核黃素進入真菌細胞內(nèi)，在紫外作用下影響真菌DNA的合成，從而產(chǎn)生協(xié)同抗菌作用，加強抗菌效果。如果單獨應用核黃素與紫外照射，核黃素無法進入真菌細胞內(nèi)對DNA產(chǎn)生影響，則無抗菌作用。那他霉素是通過在真菌胞漿膜上形成一個水溶性的孔道，同時改變胞漿膜的通透性，引起菌體細胞內(nèi)容物外滲、導致真菌停止生長，最終死亡。文獻報道[19]，核黃素在紫外線的作用下，可以對細菌、病毒及白細胞的DNA產(chǎn)生影響。說明核黃素除了可進行膠原交聯(lián)反應之外，還可以干擾DNA的合成。

采用角膜劃痕聯(lián)合異種脫細胞角膜片覆蓋法制備真菌感染動物模型，裂隙燈顯微鏡、激光掃描共聚焦顯微鏡及角膜刮片等檢查，均顯示真菌感染動物模型成功，相比傳統(tǒng)劃痕法、角膜基質(zhì)層間注射法等模型動物制備方法，成功率高，癥狀明顯。那他霉素治療組及交聯(lián)聯(lián)合那他霉素治療組病程約14d，單獨交聯(lián)組病程約21d，模型對照組病程約28d；經(jīng)治療后，實驗組愈合較好，可見，交聯(lián)聯(lián)合那他霉素體內(nèi)治療兔真菌性角膜炎，可促進角膜愈合，縮短病程，增強抗真菌效果，減少藥物的使用周期。文獻報道：在體治療時，核黃素-紫外線A膠原交聯(lián)術可通過提高膠原的物理交聯(lián)，抑制角膜溶解，提高基質(zhì)強度，在阻止真菌向組織內(nèi)部生長的過程中，同時阻止了多烯類抗真菌藥物的垂直擴散，提高了多烯類抗真菌藥物的表層藥物濃度，在聯(lián)合殺菌的基礎上進一步提升了抗菌效果[16]。

綜上所述，角膜膠原交聯(lián)聯(lián)合那他霉素的治療方法，在抗菌機制上，具有相加作用，那他霉素改變胞漿膜的通透性，核黃素從而更好地進入體內(nèi)，在紫外線的作用下，聯(lián)合產(chǎn)生更好的抗菌作用；在聯(lián)合治療真菌性角膜炎時，通過交聯(lián)的作用，角膜膠原增大，基質(zhì)強度增強，阻止了真菌向組織內(nèi)部擴散，提高表層藥物濃度。因此，從抗菌機制及物理改變方面，角膜膠原交聯(lián)聯(lián)合那他霉素共同治療真菌性角膜炎，可促進角膜愈合，縮短病程，增強抗真菌效果，減少藥物的使用周期，具有更好的應用前景。