譚 克 趙福順 姜奇峰 張 倩 金玉忠 王宇微

（吉林省蔬菜花卉科學(xué)研究院 吉林·長(zhǎng)春 130033）

植物的低溫危害包括冷害和凍害。植物組織在冰點(diǎn)以上所受到的低溫傷害稱(chēng)之為冷害（chilling injury）[1]。冷害是低溫對(duì)機(jī)體的生理?yè)p傷。除低溫外，對(duì)植物體的損傷程度取決于低溫維持時(shí)間的長(zhǎng)短。所以，選育抗寒品種是抵御低溫危害的有效途徑，提高耐寒性也成為目前保護(hù)地栽培品種選育的研究重點(diǎn)。隨著生物技術(shù)在作物育種領(lǐng)域的應(yīng)用，借助基因工程來(lái)獲得抗寒種質(zhì)資源已成為重要的育種途徑。本文利用現(xiàn)有文獻(xiàn)資料，對(duì)國(guó)內(nèi)外植物抗寒基因工程研究進(jìn)展做一番簡(jiǎn)要的綜述。

1 植物冷誘導(dǎo)基因及其轉(zhuǎn)錄因子

植物冷誘導(dǎo)基因（cor）是一種誘導(dǎo)基因，COR基因僅在某些條件(例如低溫、短日等)下被激活以產(chǎn)生冷調(diào)節(jié)蛋白。從而提高了植物的耐冷性。1970年Weiser提出低溫鍛煉可引起基因表達(dá)的改變[2]。后來(lái)發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)植物在低溫鍛煉過(guò)程中都含有調(diào)寒物質(zhì)。當(dāng)分析相應(yīng)蛋白的物理和化學(xué)性質(zhì)時(shí)，發(fā)現(xiàn)它們與植物的抗寒性密切相關(guān)，從而這些蛋白被稱(chēng)為冷調(diào)節(jié)蛋白（cold regulated proteins，CORPs） 和 冷 馴 化 蛋 白 （cold acclimation proteins，CAIPs)。為了實(shí)現(xiàn)概念上的統(tǒng)一，馬建忠將該類(lèi)型基因統(tǒng)稱(chēng)為冷誘導(dǎo)基因[3]。這些基因的共同特點(diǎn)是在零度以上低溫誘導(dǎo)表達(dá)，然后在常溫下停止或減少表達(dá)。目前從諸如擬南芥、油菜、第一雜交、菠菜、馬鈴薯、大麥、小麥、黑麥、胡蘿卜、水稻和番茄這樣的喜冷或冬季作物中獲得了近100個(gè)冷誘導(dǎo)的基因[4-5]。在眾多的冷誘導(dǎo)基因中，擬南芥冷調(diào)控基因COR15a的功能是研究較多的，它在擬南芥的抗寒性中起著重要作用。COR15a基因的過(guò)表達(dá)可使擬南芥的冷凍溫度降低1℃，提高擬南芥原生質(zhì)體的抗寒性。切斷信號(hào)肽后的COR15a成熟蛋白可直接作為一種保護(hù)蛋白，防止葉綠體的脂質(zhì)雙尾膜形成無(wú)序的不定結(jié)構(gòu)，提高葉綠體的抗寒性，維持其低溫下的光合能力，同時(shí)提高質(zhì)膜和其他內(nèi)膜的冷穩(wěn)定性[6]。Artus等研究表明，COR15a的表達(dá)增加了細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，植株葉綠體耐低溫能力較對(duì)照提高1～2℃。

轉(zhuǎn)錄因子也稱(chēng)反式作用因子，CBF（C-repeat binding factor）轉(zhuǎn)錄因子是一個(gè)基因家族，其包括CBF1、CBF2、CBF3、CBF4、CBF5和CBF6基因，它們?cè)谥参锏蜏匦盘?hào)通路[7-8]中起著重要作用。通過(guò)與下游調(diào)控基因啟動(dòng)子DRE順式作用元件結(jié)合，介導(dǎo)上述逆境信號(hào)在植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，在誘發(fā)植株對(duì)低溫、鹽分和干旱的響應(yīng)中具有重要作用[9]。CBF1和CBF3直接調(diào)節(jié)它們的下游靶基因，也可通過(guò)CBF2將信號(hào)向下游傳遞。

在低溫馴化過(guò)程中，CBF基因的表達(dá)是在低溫條件下快速誘導(dǎo)表達(dá)的[10]。通常在遭受低溫后15min內(nèi)CBF的表達(dá)即被啟動(dòng)[11]。金萬(wàn)梅等。以根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)法將擬南芥冷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活基因CBF1導(dǎo)入草莓中，通過(guò)PCR鑒定和Southern雜交，證明提高了草莓對(duì)低溫脅迫的抗性[12]。譚克等從抗冷性強(qiáng)的黃瓜葉片RNA中擴(kuò)增并克隆了冷誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄因子CBF1，將其與CaMV 35S啟動(dòng)子和Nos終止子融合后構(gòu)建植物表達(dá)載體，利用花粉管通道法將其轉(zhuǎn)入黃瓜，獲得了具有一定耐寒能力的黃瓜再生植株，總轉(zhuǎn)化率達(dá)到3.75‰[13]。孟平紅等構(gòu)建了含有冷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子CBF 3的植物表達(dá)載體，并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)入茄子，初步建立了抗寒茄子的再生轉(zhuǎn)化體系[14]。Hsieh等將擬南芥CBF1基因?qū)敕押蟀l(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株葉片過(guò)氧化氫酶活性顯著高于對(duì)照，過(guò)氧化氫含量顯著低于對(duì)照，番茄抗寒性得到改善[15]。Haake等人構(gòu)建植物表達(dá)載體將CBF4基因轉(zhuǎn)移到擬南芥中。結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因作物的抗寒性和抗旱性都得到了提高[16]。劉榮梅等采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將CBF3基因?qū)霟煵葜校@得了Southern陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因煙草，通過(guò)對(duì)幼苗生理生化指標(biāo)的測(cè)定，表明轉(zhuǎn)基因煙草在低溫脅迫下的抗寒性強(qiáng)于對(duì)照[17]。

2 抗氧化酶活性基因

在低溫脅迫過(guò)程中，氧的利用能力降低，過(guò)量氧在代謝過(guò)程中轉(zhuǎn)化為活性氧（ROS），而活性氧對(duì)植物有毒害作用。這種活性氧在包括電子轉(zhuǎn)移的生化過(guò)程中是正常代謝物，但必須及時(shí)去除以維持低水平的動(dòng)態(tài)平衡，否則，會(huì)引起膜脂過(guò)氧化、DNA損傷和蛋白質(zhì)變性，以及膜脂肪酸不飽和的減少，導(dǎo)致細(xì)胞損傷或死亡。在植物中，有一個(gè)完美的抗氧化防御系統(tǒng)，它具有清除活性氧的能力，其主要有酶促和非酶促兩類(lèi)。酶促防御系統(tǒng)主要包含超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽還原酶（GR）等；非酶促防御系統(tǒng)包括谷胱甘肽（GSH）、維生素E、抗壞血酸（ASA）、胡蘿卜素等抗氧化物質(zhì)。而SOD是清除ROS的第一個(gè)重要的抗氧化酶，起著關(guān)鍵作用。目前研究表明高等植物中有三種SOD酶：線粒體Mn-SOD、葉綠體Fe、Cu/Zn-SOD和細(xì)胞質(zhì)Cu/Zn-SOD。McKersie等人從煙草中克隆了Mn-SOD的cDNA，并構(gòu)建植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入苜蓿的線粒體和葉綠體中，提高了植物中SOD的含量和活性，通過(guò)抗冷性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因苜蓿的越冬存活率獲得了較大提高，對(duì)除草劑二苯乙醚的抗性也顯著增強(qiáng)[18]。Gupta等從豌豆中克隆了Cu/Zn-SOD基因，并將其轉(zhuǎn)入煙草，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株葉綠體中SOD基因過(guò)量表達(dá)，抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）含量增加，轉(zhuǎn)基因植株的抗寒性得到顯著增強(qiáng)[19]。Ohkawa等用基因槍法將APX基因?qū)朦S瓜，經(jīng)GUS檢測(cè)證明其基因已成功轉(zhuǎn)入，與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)基因植物的抗寒性顯著增強(qiáng)[20]。

3 抗凍蛋白基因

抗凍蛋白（anti freeze protein，AFP）是一種能增強(qiáng)抗凍能力的蛋白質(zhì)類(lèi)的總稱(chēng)。其能以非線性形式使水溶液的冰點(diǎn)降低，從而幫助有機(jī)體抵御冰凍環(huán)境?？箖龅鞍资?0世紀(jì)60年代從南北極動(dòng)物血清中發(fā)現(xiàn)的，當(dāng)?shù)蜏貙?dǎo)致結(jié)晶形成時(shí)，AFP即會(huì)活化，其能特異地吸附于冰晶表面，抑制冰晶的重晶化，阻止晶格的形成,以及阻止小的冰晶結(jié)成更大的冰晶，從而減輕冰晶在凍融的動(dòng)態(tài)變化中對(duì)生物體造成傷害。而一旦溫度升高，AFP就會(huì)完全喪失它的活性。

抗凍蛋白在魚(yú)類(lèi)和昆蟲(chóng)中的研究開(kāi)始比較早，1991年，Hightower等將北極魚(yú)類(lèi)的抗凍蛋白基因?qū)霟煵莺头阎?，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因作物的抗寒性增強(qiáng)[21]。黃永芬等通過(guò)花粉管通道法將美洲擬鰈的抗凍蛋白基因?qū)敕?，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株的生長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)于對(duì)照，致死溫度比對(duì)照組低2℃[22]。梁娜等利用內(nèi)生菌回接的方法將擬步甲昆蟲(chóng)小胸鱉甲的抗凍蛋白MpAFP基因轉(zhuǎn)入棉花，其獲得的轉(zhuǎn)基因植株的抗寒性高于對(duì)照，且隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，抗凍蛋白的保護(hù)作用逐漸降低[23]。與動(dòng)物抗凍蛋白研究相比，植物抗凍蛋白研究起步較晚。1992年，Griffith等人在加拿大首次發(fā)現(xiàn)植物內(nèi)源AFP，標(biāo)志著植物抗凍蛋白研究的開(kāi)始，隨后陸續(xù)從多種植物中獲得了具有熱滯效應(yīng)的AFP[24]。1994年費(fèi)云標(biāo)等人從常綠抗凍植物沙冬青葉片中分離出了抗凍蛋白[25]。Wallis等將植物凝集素基因和AFP基因一起構(gòu)建植物轉(zhuǎn)化載體，并將其轉(zhuǎn)入馬鈴薯。結(jié)果表明，在-2℃低溫條件下，轉(zhuǎn)基因馬鈴薯葉片的電解質(zhì)滲透率比對(duì)照低2倍以上[26]。Huang等將樹(shù)狀抗凍基因DAFP21轉(zhuǎn)入擬南芥，轉(zhuǎn)基因植株的抗凍性比對(duì)照提高最多達(dá)3.3℃[27]。Worrall等人從一種低溫誘導(dǎo)的胡蘿卜中提取并克隆了AFP蛋白，并將其導(dǎo)入煙草中，轉(zhuǎn)基因植株的抗寒性明顯高于對(duì)照，所獲得的轉(zhuǎn)基因煙草提取物能抑制冰晶的生長(zhǎng)[28]。陳佳佳利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將矮沙冬青抗凍蛋白基因AnAFP轉(zhuǎn)入玉米未成熟幼胚中，結(jié)果表明，抗凍蛋白基因在玉米中異源表達(dá)，顯著提升了玉米的抗寒能力[29]。

4 滲透調(diào)節(jié)基因

當(dāng)植物遭受低溫、干旱和其他脅迫時(shí)，體內(nèi)將產(chǎn)生一些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來(lái)防止失水和維持體內(nèi)的水平衡。這些物質(zhì)包括可溶性糖、脯氨酸、甜菜堿和游離氨基酸。在低溫脅迫條件下，植物通過(guò)促進(jìn)滲透壓調(diào)節(jié)物合成酶的表達(dá)，增加體內(nèi)這些物質(zhì)的積累，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的水平衡，避免低溫傷害。任曉平等測(cè)定了低溫脅迫下番茄幼苗葉片游離脯氨酸含量和脯氨酸脫氫酶活性。結(jié)果表明，耐冷品種o-33-1脯氨酸積累量增加，而感冷品種游離脯氨酸積累量減少，說(shuō)明脯氨酸積累量在一定程度上反映了番茄的抗寒性[30]。Pilon-Smits等從細(xì)菌中克隆到膽堿氧化酶COX基因，分別轉(zhuǎn)入擬南芥、油菜和煙草中，提高了轉(zhuǎn)化植株中的甜菜堿含量和植株苗期低溫耐受性[31]。王關(guān)林等從枯草芽孢桿菌中分離克隆出果聚糖合酶（levansucrase）基因sacB，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入番茄植株，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株具備了良好的抗寒性[32]。

5 膜穩(wěn)定性基因

1973年，根據(jù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能與抗寒性的關(guān)系，Lyons提出了著名的“膜質(zhì)相變冷害假說(shuō)”。產(chǎn)生冷害的根本原因普遍認(rèn)為是細(xì)胞膜系統(tǒng)的受損，細(xì)胞膜系統(tǒng)是植物中第一個(gè)感受外界刺激的地方。且膜系統(tǒng)也是植物細(xì)胞與外界環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換的通道和許多生理生化反應(yīng)的場(chǎng)所，因此膜系統(tǒng)的健康完整對(duì)植株的正常生長(zhǎng)發(fā)育非常重要。研究表明，低溫冷害與生物膜系統(tǒng)類(lèi)脂分子的相變密切相關(guān)[33]，細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸的含量會(huì)影響相變溫度。近年來(lái)的研究進(jìn)一步證明，脂肪酸去飽和代謝關(guān)鍵酶基因的引入可以提高植物的抗寒性。Kodama等人將脂肪酸去飽和酶基因Fad 7導(dǎo)入煙草并過(guò)量表達(dá)，植物中不飽和脂肪酸含量增加，抗寒性相應(yīng)提高[34]。于愛(ài)群等通過(guò)對(duì)高山被孢霉脂肪酸脫氫酶基因的研究表明，低溫可激活脂肪酸脫氫酶基因的轉(zhuǎn)錄，而脂肪酸脫氫酶是不飽和脂肪酸的關(guān)鍵合成酶[35]。Gombos等發(fā)現(xiàn)不飽和脂肪酸含量的降低可抑制植物的光合作用并降低其抗寒能力[36]。Ariizumi等人將Fad 7基因?qū)胨?，不僅提高了植株的抗寒性，而且提高了低溫下的光合速率和生長(zhǎng)速率[37]。此外其它在擬南芥和菠菜中轉(zhuǎn)入脂肪酸去飽和酶的研究也證明增強(qiáng)了植株的抗寒性。

6 展望

參與植物抗寒的生理生化代謝過(guò)程非常復(fù)雜，目前國(guó)內(nèi)外在低溫逆境生理、低溫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究方面取得的一系列重要進(jìn)展，克隆了與植物抗寒相關(guān)的一些基因，初步描述了植物低溫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的原理圖，為選育耐低溫品種以及在栽培上尋找對(duì)抗低溫的措施提供了科學(xué)依據(jù)，然而，由于植物抗寒基因工程屬于新的研究領(lǐng)域，還存在許多有待進(jìn)一步研究的問(wèn)題：①由于植物的抗寒性是多基因控制的特點(diǎn)，前期的研究主要集中在單一基因上，轉(zhuǎn)化植物的抗寒性受到限制。今后應(yīng)將重點(diǎn)放在多基因轉(zhuǎn)化，各基因之間相互作用，基因與各轉(zhuǎn)錄因子之間相互關(guān)系等更深入的領(lǐng)域。②研究植株的耐寒機(jī)理和篩選耐寒材料時(shí)，必須進(jìn)行抗寒性鑒定，而所采用的鑒定指標(biāo)的準(zhǔn)確性及合理性是對(duì)育種材料抗寒性進(jìn)行正確評(píng)價(jià)的關(guān)鍵。目前轉(zhuǎn)基因作物還未設(shè)立專(zhuān)用的鑒定方法，大多數(shù)都是沿用非轉(zhuǎn)基因作物的抗寒性評(píng)價(jià)方法，今后應(yīng)有針對(duì)性地建立轉(zhuǎn)基因作物抗寒評(píng)價(jià)方法。③在抗寒分子育種研究過(guò)程中，除了繼續(xù)尋找新的抗寒基因和途徑外，還可以嘗試對(duì)轉(zhuǎn)基因植株采用常規(guī)雜交手段進(jìn)行性狀篩選與改良，通過(guò)基因工程技術(shù)與傳統(tǒng)育種手段相結(jié)合創(chuàng)造出抗寒性強(qiáng)的作物新品種。綜上所述，利用基因工程技術(shù)提高植物抗寒性的研究具有廣闊的發(fā)展前景。