蔡一鳴，呂 未，吳淑平，趙豐華，呂立哲

（信陽市農業(yè)科學院河南省茶葉工程技術研究中心國家茶葉產業(yè)技術體系信陽綜合試驗站，河南信陽464000）

近年來，伴隨著生物技術的快速發(fā)展，分子標記技術被廣泛應用于茶樹品種研究中，目前研究中常用的分子標記有RAPD（Random amplified polymorphic DNA，隨機擴增多態(tài)性 DNA）、AFLP（Amplified fragment length polymorphism，擴增片段長度多態(tài)性）、SNP（Single nucleotide polymorphism，單核苷酸多態(tài)性），ISSR （Inter-simple sequence repeat，簡單重復區(qū)間序列）、SSR（Simple sequence repeat，簡單重復序列）。較其他分子標記，SSR分子標記因其多態(tài)性高、數量豐富、可重復性好、多等位性、共顯性以及對基因組有很好的覆蓋性等[1]特點優(yōu)勢，逐步成為目前茶樹DNA水平上研究的主流分子標記。SSR分子標記的不斷開發(fā)與應用，對研究茶樹遺傳多樣性、親緣關系分析、品種鑒定、種質資源的創(chuàng)新、茶樹指紋圖譜庫的建立、分子輔助育種等方面都具有重要的現實意義。而茶樹DNA指紋圖譜的構建可以有效的鑒別茶樹品種、保證苗木純度、保護茶樹品種權益等。

1 SSR分子標記

1.1 SSR分子標記的概念

真核生物的基因組中，含有大量的重復序列，根據其在染色體上的分布可將其分為串聯重復序列和散布重復序列。而散布重復序列因其拷貝數量很大，在重復單位間常有序列變化，難以進行分子標記。串聯重復序列可以根據重復單元數量的不同分為衛(wèi)星序列、小衛(wèi)星序列、微衛(wèi)星序列。微衛(wèi)星 DNA，又名 SSR（Simple sequence repeat，簡單重復序列），是由1～6個核酸為基本單元組成的長度達幾十到幾百bp的一段DNA。SSR在真核生物基因組中的含量非常豐富，且隨機分布，由于重復次數的不同，導致SSR在不同種或者個體間存在高度變異，表現為多個位點的多態(tài)性。關于SSR分子標記的產生有很多說法，但目前普遍認為SSR的產生是由于DNA復制過程中的滑動錯配導致[2]。為了將這些變異行之有效地揭示出來，SSR分子標記應運而生。隨著研究的不斷深入，SSR標記被不斷地開發(fā)應用，已然成為分子標記領域的熱點研究。

1.2 SSR分子標記的開發(fā)

每個微衛(wèi)星DNA的側翼序列即兩翼DNA序列，是相對保守的單一序列，可以根據兩翼保守序列設計一對SSR引物，用于多態(tài)性分析。SSR引物的開發(fā)是SSR分子標記的關鍵因素，目前SSR引物開發(fā)的途徑主要有以下4種[3]：（1）查閱相關文獻，獲得相關SSR分子標記引物，這種方法效率最高，但此方法使用受限，只限于已有引物開發(fā)出的物種；（2）利用近緣物種的SSR引物，此方法盲目性很大，其在所研究物種上的多態(tài)信息含量如何，不得而知；（3）從NCBI等數據庫中搜索有關物種的DNA序列或者EST序列以獲得SSR序列，設計引物，該方法簡便有效，隨著EST序列的不斷開發(fā)，EST-SSR分子標記在茶樹、杉木、小麥等作物中的應用也越來越多；（4）通過構建SSR基因組文庫，開發(fā)本物種的SSR引物，此方法較前3種方法稍顯復雜，但也是最根本和最有效的途徑，保證多態(tài)信息水平。

2 茶樹DNA指紋圖譜

2.1 DNA指紋圖譜原理

隨著高度變異的DNA序列的發(fā)現，1985年Jeffreys等[4]利用一段核心序列合成的探針與人的基因組酶切片段進行Southern雜交，獲得了10多條雜交譜帶，進一步研究發(fā)現，不同個體間雜交譜帶的位置千差萬別，這些圖譜的發(fā)現，就像人的指紋一樣因人而異，因此得名DNA指紋圖譜。在法醫(yī)學、人類遺傳學、植物學以及鳥類和哺乳動物的研究中都有廣泛應用。DNA指紋圖譜是指在DNA水平上，通過分子標記鑒別不同生物個體之間差異性的電泳圖譜，與傳統(tǒng)的形態(tài)和生化鑒定相比，具有高度的個體特異性和穩(wěn)定性，包括RFLP、RAPD、AFLP、ISSR、SSR和SNP等。DNA指紋圖譜的構建應遵循以最少的引物或者引物組合，鑒別大量品種的原則，將電泳條帶轉換成基因型代碼，結合核心引物名稱及育成品種單位縮寫等信息，生成另一種形式的DNA指紋圖譜，像人類身份證一樣，擁有唯一性[5]。

2.2 SSR指紋圖譜在茶樹上的應用

通過SSR分子標記構建DNA指紋圖譜也叫SSR圖譜，因SSR分子標記的諸多優(yōu)勢，已成為目前茶樹指紋圖譜構建的主要途徑。特征譜帶法、引物組合法與核心引物組合法是DNA指紋圖譜分析的三種主要方法[6]。劉本英等[7]用EST-SSR標記28份茶樹品種時，只有12個品種在17個引物位點上有特征譜帶，故使用特征譜帶法，只能鑒定12個品種，如果想獲得其他品種的特征譜帶，需要大量的引物篩選工作，且隨著品種數量的增加，之前在某品種上出現的特征譜帶，有可能在其他品種上出現相同帶型，因此，特征譜帶是相對的，只有在固定樣本中有效，鑒定能力有限，而使用22個引物組合，可將28個品種全部區(qū)分開。目前在指紋圖譜研究中，主要使用的還是引物組合法及核心引物組合法。王松琳等[8]通過SSR分子標記選取3對核心引物，構建了16個白化、黃化的茶樹品種的指紋圖譜，將全部品種區(qū)分開來。章志芳等[9]利用EST-SSR標記篩選出4個核心標記構建了14個茶樹新品種的指紋圖譜。陳世軍等[10]使用SSR技術，篩選出6對引物用于黔南60個野生茶樹品種的指紋圖譜構建。黃丹娟等[11]從30對SSR引物中篩選了3對核心引物構建了湖北省13個優(yōu)良茶樹品種的CID圖譜，可直觀顯示整個鑒別過程，快速查找出各參試品種鑒定所需的引物及其對應基因型。郭燕等[12]利用4個SSR核心標記構建茶樹指紋圖譜，鑒別40份貴州古茶樹資源。由此可見，SSR圖譜可以有效鑒別茶樹品種。

3 存在的問題及展望

隨著SSR分子標記在茶樹指紋圖譜研究中的應用，一些問題也隨之而來，比如在SSR檢測方法上，目前應用最多的是聚丙烯酰胺凝膠電泳（Polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE） 銀染檢測，毛細管電泳（Capillary electrophoresis，CE）熒光檢測是近年來剛剛起步的一種高效電泳，相較于CE，PAGE成本低，但費時費力，工作效率低，檢測精度和通量都不高。而且PAGE讀帶時因人為因素導致誤差很大，而CE可在PCR技術后實現高度自動化，通過軟件實現自動讀帶，減少誤差提高工作效率。在試驗樣本較多時，可以將兩種檢測方法相結合使用，先用PAGE進行SSR標記初篩，對篩選出的標記用CE分析，提高準確度。

單一分子標記技術構建指紋圖譜的報道很多，但為使DNA圖譜結果更準確、可靠，有時用兩種或者兩種以上的分子標記進行植物的分析和評價。巫桂芬等[13]采用SRAP、ISSR和SSR三種分子標記繪制了154份黃麻指紋圖譜，結果表明，不同品種有的只能用一種標記獲得其身份證指紋，有的可由2種或者3種標記獲得。由此可見，結合多種分子標記的方法，可利用不同分子標記的優(yōu)點，解決單一分子標記中出現的難題，以此獲得更全面的分子信息。劉振等[14]使用SSR、SRAP、ISSR分子標記鑒別湘波綠2號的父本，比較了3種分子標記在不同評價指標中的適用性。張羽等[15]比較了EST-SSR、SRAP及SCoT三種分子標記在茶樹遺傳多樣性和親緣關系上的標記效率及多態(tài)信息，認為不同標記可以揭示不同的位點信息，雖然標記結果有差異但互不排斥，也不互相取代，可綜合使用多種標記更好的分析品種間遺傳多樣性。隨著品種數量的增加，引物的不斷開發(fā)，利用多種分子標記優(yōu)勢互補構建茶樹資源指紋圖譜必然成為最佳選擇。

2017年中國首次破譯茶樹基因組，測序后發(fā)現，這個茶樹基因組序列達到了3.02億個堿基對，總共從里面注釋出36 591個編碼基因。茶樹基因組測序的完成有利于開發(fā)更多的SSR標記，使構建的茶樹指紋圖譜覆蓋整個茶樹基因組[16]。

目前，雖然茶樹指紋圖譜報道很多，但構建圖譜的標準卻各不相同，缺乏一套統(tǒng)一標準，如茶樹DNA提取方法、PCR反應體系、電泳檢測等；鑒別品種所需的核心引物；差異位點數等[17-20]。2013年以來，農業(yè)部相繼頒布了大麥、小麥、百合、高粱等16個農業(yè)植物品種DNA指紋圖譜鑒定技術規(guī)程的農業(yè)行業(yè)標準，為茶樹標準指紋圖譜構建提供了借鑒和指導[5]。因此，構建茶樹DNA指紋圖譜的統(tǒng)一技術標準，已經成為我國近期開展該方面工作的重點，對實現茶樹DNA指紋圖譜的數字化、自動化、標準化有著重要意義[21-22]。

豫南茶樹種質資源豐富，但開展分子水平的研究起步較晚，且研究范圍不夠寬，2016年蘇會等[23-24]利用EST-SSR標記開展對豫南茶樹種質資源茶品質相關性狀的關聯分析，以及性狀與成分多樣性分析。本文總結了SSR分子標記技術及其在構建茶樹DNA指紋圖譜上的應用及存在的問題，旨在為豫南茶樹種質資源的創(chuàng)新利用，指紋圖譜的構建提供一定的參考和借鑒。