◎ 尤麗新，胡楠楠，班 碩，孫永杰

（1.長(zhǎng)春科技學(xué)院生物食品學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130600；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118）

食品在儲(chǔ)藏過(guò)程中常用化學(xué)防腐劑防腐保鮮，但會(huì)出現(xiàn)致癌中毒現(xiàn)象,所以人們更傾向于天然防腐劑。目前天然抗菌防腐劑主要有植物源、動(dòng)物源、微生物源抗菌防腐劑，目前微生物防腐劑主要有溶菌酶、乳酸鏈球菌素、納他霉素、紅曲素及ε-聚賴氨酸。ε-聚賴氨酸是一種廣譜抑菌劑，能夠抑制革蘭氏陰性細(xì)菌、革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌、真菌和一些耐熱性芽孢桿菌等，安全性能高，可以用于多種食品的保鮮。本試驗(yàn)在確定實(shí)驗(yàn)室購(gòu)買的白色鏈霉菌具有合成ε-聚賴氨酸能力的基礎(chǔ)上，對(duì)菌株進(jìn)行紫外線誘變育種，以提高產(chǎn)物產(chǎn)量[1-4]。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

白色鏈霉菌（Streptomyces albulus），實(shí)驗(yàn)室購(gòu)買菌種，具有產(chǎn)ε-聚賴氨酸的能力。

1.1.2 試劑

酵母膏、牛肉膏、葡萄糖、蔗糖、瓊脂粉、蛋白胨、甲基橙、誘惑紅、ε-聚賴氨酸、亞甲基藍(lán)、碘和次硝酸鉍等[5]。

1.1.3 溶液

① 0.7 mmol·L-1磷 酸 緩 沖 液（pH=6.9）。②1 mmol·L-1甲基橙試劑。③生理鹽水（0.85%）。④改良的碘化鉍鉀試液。⑤碘化鉀-碘試液。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

分析天平、電子天平、顯微鏡、冰箱、培養(yǎng)箱、離心機(jī)、凈化工作臺(tái)、鼓風(fēng)干燥箱、酸度計(jì)、振蕩器、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)和壓力蒸汽滅菌器。

1.1.5 培養(yǎng)基

①高氏一號(hào)培養(yǎng)基。②貝特納培養(yǎng)基。③液體發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 菌體活化

采用高氏一號(hào)斜面培養(yǎng)基進(jìn)行菌體活化，活化后菌株于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 分離純化菌種

取活化后的斜面種子一環(huán)，接種于斜面培養(yǎng)基（貝特納培養(yǎng)基），培養(yǎng)溫度30 ℃，培養(yǎng)6～7 d。

1.2.3 誘變育種[6-8]

（1）單孢子菌懸液的制備。待分離純化斜面菌種孢子成熟鋪滿斜面，用0.85%的無(wú)菌生理鹽水清洗孢子，調(diào)整孢子濃度為108個(gè)/mL（顯微鏡涂片計(jì)數(shù)法）。

（2）樣品的稀釋。將單孢子懸液制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5以及 10-6系列稀釋菌液，選擇 10-3、10-4、10-5稀釋度，分別做平板接種培養(yǎng)及誘變處理。

（3）紫外誘變處理。打開紫外燈預(yù)熱20 min，培養(yǎng)皿里放入轉(zhuǎn)子，分別吸取菌懸液9 mL移入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，將帶有菌懸液的培養(yǎng)皿放置在距15 W紫外燈下30 cm處，打開磁力攪拌器，開始計(jì)時(shí)，邊攪拌邊照射，照射時(shí)間分別為15、25、35、45 s以及55 s，照射完畢，關(guān)閉紫外燈。所有操作必須在紅燈下進(jìn)行。取稀釋度10-3、10-4、10-5（分別經(jīng)過(guò) 15、25、35、45 s以及 55 s誘變處理）各0.1 mL移入貝特納平板上，用無(wú)菌玻璃涂布棒涂布均勻，然后30 ℃、避光條件下培養(yǎng)72 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

（4）計(jì)算存活率和致死率。對(duì)培養(yǎng)后的平板進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。以對(duì)照組平板菌落數(shù)為基準(zhǔn)，計(jì)算出經(jīng)紫外處理15、25、35、45 s以及55 s后每毫升菌液中的活菌數(shù)和致死率。

1.2.4 突變菌株初篩

亞甲基藍(lán)是一種堿性染料，而菌體會(huì)分泌產(chǎn)生帶正電的產(chǎn)物ε-聚賴氨酸，由于靜電作用，會(huì)排斥亞甲基藍(lán)，進(jìn)而菌體周圍會(huì)形成藍(lán)色較淺的透明圈。所形成的透明圈的直徑與菌體直徑比值（HC值），與對(duì)照平板進(jìn)行比較，一般HC值越大，則說(shuō)明ε-聚賴氨酸產(chǎn)量越大；HC值越小，則產(chǎn)量越小?？蓪C比值作為鑒定高產(chǎn)ε-聚賴氨酸菌株的指標(biāo)[9]。

1.2.5 突變菌株搖瓶發(fā)酵（復(fù)篩）

分別將原菌株與經(jīng)誘變初篩的菌株接入裝有40 mL發(fā)酵培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中，在空氣浴震蕩器培養(yǎng)72 h，溫度 30 ℃，轉(zhuǎn)速 200 r·min-1。

1.2.6 ε-聚賴氨酸含量的測(cè)定

用分光光度計(jì)測(cè)定ε-聚賴氨酸的含量，參照Itzhak和Shima甲基橙比色法。以磷酸緩沖液為空白樣，在465 nm下測(cè)定樣品吸光度，以A465為縱坐標(biāo)，ε-聚賴氨酸含量為橫坐標(biāo)，繪制ε-聚賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

將誘變前后菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵3 d后，發(fā)酵液經(jīng)過(guò)處理，稀釋20倍后測(cè)定OD425值，最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出發(fā)酵液中ε-聚賴氨酸的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外線誘變劑量的確定

以白色鏈霉菌作為出發(fā)菌株，進(jìn)行紫外線誘變，紫外線誘變致死率曲線如圖1。紫外誘變后菌體長(zhǎng)勢(shì)情況如圖2。

圖1 紫外誘變致死率曲線圖

圖2 紫外誘變菌體長(zhǎng)勢(shì)情況圖

由圖1看出，根據(jù)遺傳育種的經(jīng)驗(yàn)，70%～80%的致死率最好，因此確定以35 s為最適誘變劑量。

2.2 突變菌株初篩

用含甲基藍(lán)的貝特納瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)紫外誘變處理35 s后的菌株，其菌落周圍出現(xiàn)顏色較淺的透明圈，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 菌體產(chǎn)物與亞甲基藍(lán)的靜電反應(yīng)圖

由圖3可見(jiàn)，菌落周圍出現(xiàn)顏色較淺的透明圈，從培養(yǎng)菌株中選擇HC比值最大（3.3）的菌株做進(jìn)一步搖瓶復(fù)篩。

2.3 發(fā)酵液中ε-聚賴氨酸含量測(cè)定

ε-聚賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。ε-聚賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-1.452x+0.498，R2=0.995 5。

誘變前后發(fā)酵液中ε-聚賴氨酸含量如表1。

表1 誘變前后ε-聚賴氨酸含量表

誘變前后發(fā)酵液OD值分別為0.427、0.407，代入ε-聚賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=-1.452x+0.498，得出ε-聚賴氨酸含量為 0.049 g·L-1、0.063 g·L-1。進(jìn)而得出發(fā)酵液中 ε-聚賴氨酸含量為 0.98 g·L-1、1.26 g·L-1，誘變后產(chǎn)量提高率為28.57%。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)該產(chǎn)ε-聚賴氨酸的白色鏈霉菌采用紫外線誘變法進(jìn)行誘變處理，確定最佳誘變時(shí)間為35 s，此時(shí)突變菌株ε-聚賴氨酸的產(chǎn)量為1.26 g·L-1，與未誘變前比產(chǎn)量提高了28.57%。