陳云鳳 龍 釗 王曉紅 許佳玲 羅劍文 張以順*

流式細(xì)胞分選儀可對快速、直線及流動狀態(tài)中的單個細(xì)胞或其他微粒進(jìn)行逐個、多參數(shù)和快速定性定量分析，同時可對特定群體精確識別并分離的現(xiàn)代細(xì)胞分析技術(shù)設(shè)備[1-3]。MoFlo XDP超速流式細(xì)胞分選儀(美國Beckman Coulter公司)是細(xì)胞生物學(xué)、單克隆抗體技術(shù)、激光技術(shù)、流體力學(xué)、電子計(jì)算機(jī)等學(xué)科高度融合發(fā)展的結(jié)晶[4-6]。流式細(xì)胞技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、腫瘤學(xué)、免疫學(xué)、血液學(xué)、病理學(xué)、臨床檢驗(yàn)、藥理學(xué)、農(nóng)業(yè)及畜牧業(yè)等領(lǐng)域[7-11]。

流式細(xì)胞分選技術(shù)具有高通量、分選速度快、分選細(xì)胞純度高和活性好等技術(shù)優(yōu)勢，但當(dāng)分選前調(diào)校和操作較為復(fù)雜費(fèi)時，如果分選的每個步驟操作不當(dāng)或儀器參數(shù)設(shè)置不準(zhǔn)確，則會對分選出目標(biāo)細(xì)胞的活性、純度、得率和分選速度有較大影響，甚至縮短儀器的使用壽命[12]。為此，本研究對中山大學(xué)生物學(xué)國家實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心使用7年的MoFlo XDP超速流式細(xì)胞分選儀管理方法進(jìn)行探討。

1 MoFlo XDP超速流式細(xì)胞分選儀的管理

1.1 實(shí)驗(yàn)室環(huán)境

流式細(xì)胞分選儀的性能和使用壽命受環(huán)境溫度、濕度及清潔度等方面的影響。流式細(xì)胞分選儀室必須是一個全密封的環(huán)境，配有冷暖空調(diào)、紫外燈和抽濕機(jī)，應(yīng)具有配備冷暖空調(diào)、紫外消毒的緩沖間，防止污染。真空泵和壓縮機(jī)置于緩沖間，可減少流式細(xì)胞儀室的噪音。

1.2 儀器管理員

大型科研設(shè)備的管理實(shí)行專管共用原則，集中于實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，實(shí)行校內(nèi)外共享服務(wù)，由專職儀器管理員進(jìn)行儀器的操作和日常維護(hù)[13-14]。專職管理員于實(shí)驗(yàn)前介入師生的相關(guān)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，閱讀相關(guān)資料，結(jié)合自己的操作經(jīng)驗(yàn)，指導(dǎo)師生完善實(shí)驗(yàn)樣品制備和實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)，確保師生的實(shí)驗(yàn)順利完成。

流式細(xì)胞分選儀的開機(jī)、調(diào)節(jié)和關(guān)機(jī)必須由管理員完成。流式細(xì)胞分選儀的光路和流路比較復(fù)雜，濾光片很靈敏，濾光片位置一點(diǎn)點(diǎn)變化就會引起光路很大偏差[15]。管理員具備熟練的操作方法，可在短時間內(nèi)把光路和流路調(diào)好。如果讓師生完成這些工作，可能出現(xiàn)：①光路偏離太多，需要管理員或工程師花很長時間才能矯正；②調(diào)節(jié)旋鈕的螺紋滑絲，影響光路和流路的精確性；③因忘記關(guān)激光、壓縮機(jī)等而降低儀器的性能和縮短使用壽命。

1.3 培訓(xùn)與交流

(1)管理員培訓(xùn)與交流。學(xué)院對大型科研設(shè)備管理員的技術(shù)培訓(xùn)與交流主要采取送出去和請進(jìn)來兩種方式。每年學(xué)院利用學(xué)校給予的政策與經(jīng)費(fèi)支持，有針對性地安排相關(guān)設(shè)備管理員到國內(nèi)外高校和儀器公司進(jìn)行參觀、學(xué)習(xí)和交流[13]。并邀請儀器生產(chǎn)廠家的專業(yè)技術(shù)人員到學(xué)院儀器現(xiàn)場開展定向培訓(xùn)。

(2)師生培訓(xùn)與交流。使用流式細(xì)胞分選儀的師生需要對其原理、性能及適用范圍等有個大概的認(rèn)知，才能針對不同的實(shí)驗(yàn)材料采取最適合的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和方案。

(3)師生主動提前介入。將流式細(xì)胞術(shù)的基本原理和應(yīng)用納入一年級本科生和研究生的《生物學(xué)儀器設(shè)備技術(shù)》課程。同時，邀請專家和工程師給師生們開展實(shí)驗(yàn)技術(shù)及應(yīng)用交流討論。

(4)管理員與師生合作交流。由于實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心的大型儀器都是實(shí)行校內(nèi)外共享，師生需要在網(wǎng)上預(yù)約和經(jīng)過上機(jī)培訓(xùn)后才能使用儀器[13]。儀器管理員與使用師生之間只有保持高度默契的合作交流，才能確保儀器的正常運(yùn)行和取得好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 MoFlo XDP超速流式細(xì)胞分選儀操作維護(hù)技巧

管理員在操作流式細(xì)胞分選儀時，要善于觀察，總結(jié)操作經(jīng)驗(yàn)和技巧。儀器最佳條件的設(shè)定和參數(shù)的調(diào)試直接關(guān)系到分析的精確度和分選的產(chǎn)率、純度及活力等結(jié)果[16]；正確的操作經(jīng)驗(yàn)和技巧是為了維持儀器的良好性能和延長儀器的使用壽命。

2.1 開機(jī)

開機(jī)前不需要每次更換噴嘴(cyto nozzle)，盡量減少噴嘴的更換次數(shù)來保護(hù)噴嘴固定器的螺紋。開機(jī)后需要等流路沖洗干凈和激光達(dá)到穩(wěn)定時才能調(diào)流路和光路，增加其精確性。

2.2 流路調(diào)節(jié)

調(diào)流路前必須排氣泡，氣泡會嚴(yán)重影響智能分選模式的穩(wěn)定。通常要上下移動多次噴嘴才能將流路調(diào)正，所以要觀察噴嘴在最低和最高時千分尺的位置，避免調(diào)得過低或過高造成螺紋滑絲和流動室組件脫落。噴嘴降到最低處時，千分尺的刻度通常在5以上2～3格；噴嘴升到最高處時，千分尺的刻度通常在15以上1～2格(如圖1所示)。

噴嘴位于最低處時，小孔(pin hole)應(yīng)調(diào)在液流最中間；噴嘴位于最高處時，如果液流偏小孔太多，要將液流調(diào)至偏向相反一側(cè)。這樣可以減少噴嘴上下移動次數(shù)， 更快調(diào)正液流和減少螺紋的磨損(如圖2所示)。

圖1 調(diào)液流時噴嘴的位置示圖

圖2 液流調(diào)節(jié)示圖

2.3 光路調(diào)節(jié)

(1)用熒光微球調(diào)光路時，如果發(fā)現(xiàn)上樣細(xì)胞數(shù)值為0，原因可能有未開激光、樣品壓力低于鞘液壓力、光路未調(diào)好、流路堵塞及閾值設(shè)置不好；如果發(fā)現(xiàn)上樣細(xì)胞數(shù)值很大，原因可能有前向散射光(forward scatter，F(xiàn)SC)未調(diào)好、流路堵塞了和面板上FSC閾值被改變?yōu)槠渌ǖ篱撝怠?/p>

(2)多激光檢測時，要先調(diào)好藍(lán)激光通道的變異系數(shù)(coefficient of variance，CV)值(如圖3所示)。①先調(diào)液流組的微調(diào)千分尺的左右鍵和聚焦鍵，兩個鍵輪流調(diào)，把光斑調(diào)至最上、最右且最聚集，當(dāng)發(fā)現(xiàn)光斑由不均一的紅色和黃色混合的射線(圖3-A)突然變成聚集的黃色斑點(diǎn)(圖3-B)時，再調(diào)激光組；②調(diào)激光組時，一般只調(diào)上下和前后的微調(diào)千分尺，聚焦千分尺影響較??；③藍(lán)激光調(diào)好后，再調(diào)其他激光的通道；④若每次實(shí)驗(yàn)把噴嘴降低到相同位置，其他激光的光路常不需要調(diào)節(jié)CV值即可＜3%。

圖3 光路調(diào)節(jié)示圖

(3)由于濾光片比較靈敏，如果能通過以上流路和光路調(diào)節(jié)得到理想的CV值，則不要調(diào)濾光片，否則要花更多的時間去矯正光路。

2.4 智能分選模式(IntelliSort State)的建立

(1)為防止樣品污染，建立智能分選模式前，用75%的乙醇高速上樣5 min對流路進(jìn)行消毒，再用無菌水高速上樣5 min。

(2)調(diào)Charge Phase(充電相位)和分選時，電極板會出現(xiàn)加電不正常，液滴在電極板之間來回運(yùn)動，最終影響智能分選模式的建立和降低分選純度。最佳的糾正方法是：①用蒸餾水沖洗電極板上的結(jié)晶鹽，用無屑紙擦干凈后再裝上；②調(diào)Charge Phase時電壓不要超過2700 V；③目的細(xì)胞含量高時，降低電壓使偏轉(zhuǎn)液流遠(yuǎn)離偏轉(zhuǎn)板，或者將樣品稀釋使偏轉(zhuǎn)液流變細(xì)。

(3)理想的分選模式為：①最后一個連接液滴被粗細(xì)均勻的衛(wèi)星液滴掛??；②最后一個連接液滴與斷開液滴之間的衛(wèi)星液滴呈粗細(xì)均勻的直線，位于兩個液滴中間；③對于100 nm的噴嘴，Maintaining(智能分選模式的維持)的指示線一直保持在最高點(diǎn)。分選模式如圖4所示。

圖4 理想的智能分選模式(IntelliSort State)示圖

2.5 檢測和分選

(1)檢測。先檢查樣品的質(zhì)量狀況，樣品若帶有培養(yǎng)基、未過濾或細(xì)胞凝聚成團(tuán)會堵塞流路。

(2)分選。上樣、分析和分選操作，經(jīng)過管理人員多次培訓(xùn)后由使用師生獨(dú)立完成。對師生要進(jìn)行以下操作和注意事項(xiàng)培訓(xùn)：①用75%酒精棉球擦拭分選窗，防止樣品污染；②為保持智能分選模式的穩(wěn)定，要等上樣準(zhǔn)備就緒，發(fā)現(xiàn)有穩(wěn)定的每秒細(xì)胞數(shù)(events per second， EPS)時，才開啟電腦上的分選，反之，要先停止電腦上的分選，才能在面板上操作暫?；蛲Ｖ股蠘?；③上樣和停止上樣是同一個按鈕，所以只能按一次按鈕，耐心等待上樣器的開門和關(guān)門，如果連續(xù)按兩次或更多次，上樣器的門會開了又關(guān)，同時上樣針會上升了又下降，這時候取樣品可能會造成上樣針和上樣器損壞，還可能引起手受傷事故；④面板上出現(xiàn)對話提示框，當(dāng)智能分選模式已不能維持，應(yīng)立即停止分選，避免目的細(xì)胞的分選純度受影響；⑤如發(fā)現(xiàn)EPS越來越少，可能是待分選樣品沉底或聚集了，應(yīng)停止分選，混勻后再上樣分選；⑥如出現(xiàn)EPS越來越多，這時流路開始堵塞，應(yīng)立即停止分選，用無菌水高速上樣沖洗，及時發(fā)現(xiàn)這種情況并沖洗流路可防止流路嚴(yán)重堵塞甚至損壞；⑦要留意樣品的液面高度，切勿讓上樣針露出液面吸入氣泡而影響智能分選模式的穩(wěn)定。

2.6 關(guān)機(jī)

(1)為了更好地維護(hù)和保證流式細(xì)胞分選儀下次實(shí)驗(yàn)?zāi)茼樌M(jìn)行，需由管理員完成關(guān)機(jī)。防止流路堵塞和提高儀器的使用效率的方法有：①高速沖洗流路，用1%次氯酸鈉洗滌前需用無菌水沖洗，盡量把流路中殘留的細(xì)胞沖洗掉，如果直接用1%次氯酸鈉沖洗，會造成太多細(xì)胞在流路中破裂，細(xì)胞碎片在流路中積累越來越多而堵塞流路；②每次實(shí)驗(yàn)后加滿鞘液，鞘液經(jīng)靜置后可以減少氣泡。

(2)延長儀器使用壽命的注意事項(xiàng)有：①先將激光鎖匙旋到關(guān)閉，使激光慢慢降溫，15 min后關(guān)閉激光電源，可延長激光的壽命；②關(guān)閉液流顯示燈，可延長燈泡壽命。

3 MoFlo XDP超速流式細(xì)胞分選儀管理效果

通過對MoFlo XDP超速流式細(xì)胞分選儀的管理與維護(hù)取得了較好的效果，從實(shí)驗(yàn)室環(huán)境、儀器管理員、培訓(xùn)與交流等方面積累了豐富的管理和維護(hù)經(jīng)驗(yàn)。近年來，儀器公司多次組織相關(guān)部門的流式細(xì)胞儀操作者來學(xué)院進(jìn)行培訓(xùn)。通過管理和維護(hù)，MoFlo XDP超速流式細(xì)胞分選儀使用機(jī)時超過10000 h，從未出現(xiàn)過流路嚴(yán)重堵塞、樣品污染等不良現(xiàn)象，仍然保持良好的分選效率，分選純度仍保持在99%以上，并延長了設(shè)備的使用壽命。

4 結(jié)語

流式細(xì)胞分選儀是多門學(xué)科綜合的結(jié)晶，被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域，管理和維護(hù)以及更好地開發(fā)利用流式細(xì)胞分選儀的功能，是管理員需要繼續(xù)深入研究的課題。流式細(xì)胞分選儀管理員和科研人員需要不斷地有意識地學(xué)習(xí)各門相關(guān)學(xué)科知識，以便更好地將流式細(xì)胞分選儀應(yīng)用到各學(xué)科的教學(xué)和科研中。