高正琴

（中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050）

剛地弓形蟲(chóng)（Toxoplasma gondii，T.gondii）在分類(lèi)上屬頂復(fù)亞門(mén)（Apicomplexa）孢子蟲(chóng)綱（Sporozoasida）真球蟲(chóng)目（Eucoccidiorida）弓形蟲(chóng)科（Toxoplasmatidae），是一種單細(xì)胞寄生蟲(chóng)。1908年，首先由法國(guó)學(xué)者Nicolle和Manceaux從一種叫做剛地梳趾鼠（Ctenodactylus gondii）的沙漠嚙齒類(lèi)動(dòng)物的肝、脾單核細(xì)胞中分離出來(lái)，該動(dòng)物被用作動(dòng)物模型，在突尼斯巴斯德研究所查爾斯尼科爾的實(shí)驗(yàn)室里研究利什曼[1]。與此同時(shí)，Splendore在巴西的一只兔體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了弓形蟲(chóng)[2]。隨后，世界各地相繼在多種脊椎動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了弓形蟲(chóng)。弓形蟲(chóng)有三個(gè)主要的生命周期階段：1）速殖子（tachyzoite）（希臘語(yǔ)tachos=speed；快速繁殖的階段）；2）緩殖子（bradyzoite）（希臘語(yǔ) brady=slow；在組織中發(fā)現(xiàn)的可傳播的階段）；3）在貓的腸道中發(fā)現(xiàn)的有性階段[3]。在實(shí)驗(yàn)室中，速殖子可以被無(wú)限期地維持和培養(yǎng)[4]。弓形蟲(chóng)的終宿主只有貓科動(dòng)物，但其中間宿主十分廣泛，包括人類(lèi)、家畜、鳥(niǎo)類(lèi)、海洋哺乳動(dòng)物、蛇等[5]。人和動(dòng)物感染率極高，引起弓形蟲(chóng)病（toxoplasmosis），呈世界性分布。據(jù)報(bào)道全球超過(guò)三分之一的人感染弓形蟲(chóng)[6]。

對(duì)于弓形蟲(chóng)病，至今尚無(wú)有效的防控手段。因此，開(kāi)發(fā)新的診斷工具，特別是快檢技術(shù)用于監(jiān)測(cè)疫病的暴發(fā)流行就顯得非常重要。目前，國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的弓形蟲(chóng)感染概況在很大程度上是未知的。目前尚未見(jiàn)不同方法檢測(cè)鑒定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物弓形蟲(chóng)的具體研究和感染調(diào)查的報(bào)道。本研究首次采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) （enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、聚合酶鏈反應(yīng)（polymeras chain reaction，PCR）和直接鏡檢實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)顯微視屏攝錄技術(shù)（direct microscopy real-time dynamic video recording technique），對(duì)國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的弓形蟲(chóng)進(jìn)行快速檢定和感染調(diào)查，為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的修訂提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本來(lái)源

2012年12月至2016年12月，12 394只表觀健康的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（包括：猴290只、小型豬425只、犬579只、兔1 234只、地鼠372只、豚鼠1 363只、大鼠987只、小鼠7 144只）來(lái)自全國(guó)60個(gè)不同廠家。采血分離血清。

1.2 主要試劑

弓形蟲(chóng)抗體IgG檢測(cè)試劑盒（酶聯(lián)免疫法）和弓形蟲(chóng)循環(huán)抗原 CAg檢測(cè)試劑盒（酶聯(lián)免疫法）購(gòu)自珠海經(jīng)濟(jì)特區(qū)海泰生物制藥有限公司；DNA提取試劑盒（QIAamp DNA Mini Kit）購(gòu)自德國(guó) Qiagen公司；dNTPMixture、EX Taq、Agarose、DNA Marker購(gòu)自日本 TaKaRa公司；Nuclease-Free Water購(gòu)自美國(guó)Progema公司。

1.3 主要儀器

THERMO MULTISKAN MK3全自動(dòng)酶標(biāo)儀（Thermo ELECTRON CORPORATION，美國(guó)）；Verity 96 Thermal Cycler基因擴(kuò)增儀（Applied Biosystyem，美國(guó)）；Gel Logic凝膠成像分析系統(tǒng)（東樂(lè)自然基因生命科學(xué)公司）；生物安全柜（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）；LEICA DM2500 生物顯微鏡（Leica M icrosystems，德國(guó)）；倒置顯微鏡及成像系統(tǒng)（Nikon，日本）。

1.4 ELISA檢測(cè)弓形蟲(chóng)抗體IgG和循環(huán)抗原CAg

用ELISA方法檢測(cè)血清樣本中弓形蟲(chóng)抗體IgG和循環(huán)抗原CAg。所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。每次試驗(yàn)均設(shè)陰性對(duì)照、臨界對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)定吸光度 A?？贵w IgG結(jié)果判定：樣本A450值＜臨界對(duì)照平均值為陰性，樣本A450值≥臨界對(duì)照平均值為陽(yáng)性。循環(huán)抗原CAg結(jié)果判定：樣本 A450值＜臨界對(duì)照平均值 ×0.90為陰性，樣本A450值＞臨界對(duì)照平均值×1.10為陽(yáng)性。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)上判定結(jié)果：弓形蟲(chóng)抗體IgG和循環(huán)抗原CAg任意一個(gè)陽(yáng)性即定義為弓形蟲(chóng)感染陽(yáng)性，否則為陰性。計(jì)算弓形蟲(chóng)總感染率（弓形蟲(chóng)感染陽(yáng)性數(shù)/總數(shù)×100%）。

1.5 引物設(shè)計(jì)和DNA提取

根據(jù)GenBank中公布的弓形蟲(chóng)p30基因序列（major surface parasite antigen）（GenBank登錄號(hào)：S76248），設(shè)計(jì)一對(duì) PCR引物（表1）。引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。用QIAamp DNA Mini Kit提取待測(cè)血清樣本 DNA，具體操作見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.6 PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)弓形蟲(chóng)

PCR總反應(yīng)體積為50μL，包括：5.0μL 10×Buffer（Mg2+Plus），4.0 μL dNTP Mixture，正、反向引物各 0.5 μL，0.25 μL EX Taq（5 unit/μL），3.0 μL模板 DNA，37.25 μL Nuclease-Free Water。 PCR反應(yīng)參數(shù)：95℃ 1 m in，1個(gè)循環(huán)；95℃ 30 s，60℃30 s，72 ℃ 1 min，35 cycles；72 ℃ 10 min，1 cycle。試驗(yàn)中陽(yáng)性對(duì)照為弓形蟲(chóng)1型RH株，陰性對(duì)照為藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)（Giardia lamblia）、四翼無(wú)刺線蟲(chóng)（Aspiculuris tetraptera）、隱匿管狀線蟲(chóng)（Syphacia obvelata）、鼠管狀線蟲(chóng)（Syphacia muris）。 1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。凝膠成像分析系統(tǒng)攝錄試驗(yàn)結(jié)果。

1.7 直接鏡檢實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)顯微視屏攝錄技術(shù)檢測(cè)弓形蟲(chóng)

在負(fù)壓生物安全柜內(nèi)，待測(cè)血清用生理鹽水進(jìn)行適當(dāng)稀釋后滴片，采用直接鏡檢實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)顯微視頻攝錄技術(shù)檢測(cè)樣本中寄生蟲(chóng)病原體。根據(jù)蟲(chóng)體的形態(tài)和大小來(lái)進(jìn)行蟲(chóng)種的鑒定。

2 結(jié)果

2.1 ELISA檢測(cè)弓形蟲(chóng)抗體IgG和循環(huán)抗原CAg結(jié)果

用ELISA法對(duì)12 394只動(dòng)物進(jìn)行了弓形蟲(chóng)檢測(cè)，每次試驗(yàn)均設(shè)陰性對(duì)照、臨界對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照，符合條件者試驗(yàn)結(jié)果方有效。結(jié)果：循環(huán)抗原CAg檢出陽(yáng)性率為0（0/12 394），抗體 IgG檢出陽(yáng)性率為0.03%（4/12 394）。初次檢測(cè)結(jié)果顯示，在12 394份血清中檢出4份血清弓形蟲(chóng)抗體IgG陽(yáng)性，第一次檢測(cè) A值分別為 2.074、1.954、1.494、1.167；陰性對(duì)照值為 0.054；臨界值為 0.520、0.519、0.527；陽(yáng)性對(duì)照值為2.596。用同樣方法對(duì)這4份血清再次檢測(cè)，第二次檢測(cè) A值分別為 1.272、1.075、0.810、0.649；陰性對(duì)照值為 0.053；臨界值為0.519、0.526、0.516；陽(yáng)性對(duì)照值為 2.453。 這 4 份血清第三次檢測(cè) A值分別為1.228、1.460、1.109、1.278；陰性對(duì)照值為 0.053；臨界值為 0.448、0.445、0.412；陽(yáng)性對(duì)照值為 2.350。根據(jù)上述結(jié)果，判定這4份血清樣本弓形蟲(chóng)抗體IgG陽(yáng)性。這4份陽(yáng)性樣本均來(lái)自于豚鼠（表2）。應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物弓形蟲(chóng)，結(jié)果從12 394份實(shí)驗(yàn)動(dòng)物樣本檢出了4份弓形蟲(chóng)陽(yáng)性樣本，弓形蟲(chóng)總感染率為0.03%（4/12 394）。

2.2 PCR檢測(cè)弓形蟲(chóng)結(jié)果

以抽提的樣本 DNA為模板，用優(yōu)化后的 PCR方法檢測(cè)待測(cè)血清樣本中的弓形蟲(chóng) DNA。12 394份實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清樣本弓形蟲(chóng)核酸PCR檢出陽(yáng)性樣本4份，陽(yáng)性率0.03%，與弓形蟲(chóng)抗體 IgG檢測(cè)陽(yáng)性樣本（0.03%）一致。結(jié)果如圖1顯示，這4份弓形蟲(chóng)抗體IgG陽(yáng)性豚鼠血清中均出現(xiàn)了特異性的目的基因條帶，與預(yù)期擴(kuò)增的弓形蟲(chóng)p30基因1 634 bp大小相一致。PCR檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明，這4份弓形蟲(chóng)抗體IgG陽(yáng)性豚鼠血清中確實(shí)存在弓形蟲(chóng)DNA（圖 1）。

2.3 直接鏡檢實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)顯微視屏攝錄技術(shù)檢測(cè)弓形蟲(chóng)結(jié)果

直接鏡檢實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)顯微視屏攝錄技術(shù)檢測(cè)，在血清樣本中發(fā)現(xiàn)蟲(chóng)體呈弓形如月牙狀，長(zhǎng)5～7μm，寬2～4μm，一端較尖，另一端鈍圓；一側(cè)扁平，另一側(cè)較膨?。▓D2）。依據(jù)蟲(chóng)體的大小和形態(tài)特征，鑒定為弓形蟲(chóng)速殖子。直接鏡檢實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)顯微視屏攝錄技術(shù)檢測(cè)12 394份實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清樣本檢出弓形蟲(chóng)蟲(chóng)體陽(yáng)性樣本4份，陽(yáng)性率0.03%，與弓形蟲(chóng)IgG抗體和p30基因檢測(cè)結(jié)果相吻合（表2）。然而，此類(lèi)形態(tài)學(xué)鑒定不足之處為定性檢查而非定量檢測(cè)，該滴片法更不適于蟲(chóng)體計(jì)數(shù)。因此，對(duì)于臨床癥狀不典型的感染動(dòng)物，應(yīng)采集血液、精液、腹腔液及靶器官組織，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行弓形蟲(chóng)感染的動(dòng)態(tài)分布檢測(cè)，這在后繼感染性試驗(yàn)中精確定量檢測(cè)弓形蟲(chóng)病原體十分必要。

圖1 PCR擴(kuò)增感染動(dòng)物血清樣本弓形蟲(chóng)p30基因特異性DNA產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR products am p lified by p rim ers targeted p30 gene specific DNA of genom ic DNA extracted from serum sam p les of anim als in fected w ith Toxop lasm a gondii

圖2 中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中弓形蟲(chóng)速殖子鏡檢形態(tài)Fig.2 M icroscop ic m orphology of Toxoplasma gondii tachyzoite derived from laboratory anim als in China

表2 中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中弓形蟲(chóng)感染情況Tab le 2 The p revalence of Toxoplasm a gondii in laboratory anim als in China

3 討論

目前，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為全世界的剛地弓形蟲(chóng)只有一個(gè)種，一個(gè)血清型。弓形蟲(chóng)寄生在幾乎所有有核細(xì)胞中，不僅可經(jīng)胎盤(pán)垂直傳播，而且是一種重要的機(jī)會(huì)致病原蟲(chóng)（opportunistic protozoan）。孕婦感染弓形蟲(chóng)可致流產(chǎn)、早產(chǎn)、死產(chǎn)、胎兒畸形或產(chǎn)出弱智兒，先天性弓形蟲(chóng)病新生兒的典型表現(xiàn)有腦積水、小腦畸形、大腦鈣化、脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎及精神、運(yùn)動(dòng)障礙，還可伴有發(fā)熱、皮疹、嘔吐、腹瀉、黃疸、肝脾腫大、貧血、心肌炎、癲癇等。1979年在美國(guó)、1997年在加拿大和2006年在巴西分別暴發(fā)了急性弓形蟲(chóng)病。弓形蟲(chóng)感染可引起多臟器損害。弓形蟲(chóng)急性播散，?？梢鹉X膜腦炎、脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎、肝炎、肺炎、心肌心包炎、廣泛性肌炎、關(guān)節(jié)炎、腎炎和腹膜炎等。在艾滋病患者中報(bào)告的弓形蟲(chóng)腦炎的頻率增加，尤其是那些有顯著免疫抑制的患者在CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)＜200細(xì)胞/m L時(shí)，而弓形蟲(chóng)感染被認(rèn)為是導(dǎo)致艾滋病患者死亡的一種重要的機(jī)會(huì)性病原[7-8]。在抗腫瘤治療過(guò)程中，癌癥還可以重新激活潛伏的弓形蟲(chóng)感染[9]。包括淋巴瘤、白血病和骨髓瘤在內(nèi)的多種惡性腫瘤可以重新激活弓形蟲(chóng)病[10]。從血清陽(yáng)性供體移植器官可以在接受免疫治療血清陰性受體中激活潛伏性感染。從血清陰性供體移植器官也能通過(guò)激活免疫抑制治療的血清陽(yáng)性受體的潛伏性感染來(lái)啟動(dòng)致命的感染。將受感染的器官移植到血清陰性受體的危險(xiǎn)似乎大于將未受感染的器官移植到血清陽(yáng)性受體的危險(xiǎn)[11]。據(jù)報(bào)道，在心臟、肝臟、骨髓、造血干細(xì)胞移植受體者中出現(xiàn)了致命的弓形蟲(chóng)病[12-15]。家畜感染弓形蟲(chóng)可導(dǎo)致流產(chǎn)、不孕、死胎，不僅對(duì)畜牧業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，還威脅著人類(lèi)健康。研究表明慢性弓形體病與一些自身免疫性疾病、精神和神經(jīng)退行性疾病有很大關(guān)系。弓形蟲(chóng)感染可以操縱和改變行為。由此可見(jiàn)，弓形蟲(chóng)病具有重要的社會(huì)公共衛(wèi)生意義。

弓形蟲(chóng)感染的檢測(cè)可采用病原學(xué)、血清學(xué)、分子生物學(xué)等方法。顯微鏡檢查弓形蟲(chóng)病原體特異性強(qiáng)但敏感性低，需要經(jīng)驗(yàn)豐富的檢驗(yàn)人員進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒別，工作量大操作繁瑣且具有一定的生物安全性危害。血清學(xué)方法比較簡(jiǎn)便快捷便于批量檢測(cè)，然而，抗核抗體、類(lèi)風(fēng)濕因子和同型自然抗體（natural antibody）等，可使血清學(xué)方法測(cè)定弓形蟲(chóng)抗體時(shí)呈現(xiàn)假陽(yáng)性反應(yīng)；對(duì)于免疫抑制個(gè)體或潛伏感染未激發(fā)產(chǎn)生抗體的個(gè)體則會(huì)呈現(xiàn)假陰性結(jié)果。因此，對(duì)于弓形蟲(chóng)病的診斷需要結(jié)合多種方法的檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行綜合判斷。近年來(lái)，將PCR和核酸探針技術(shù)應(yīng)用于弓形蟲(chóng)感染的檢測(cè)，更具有靈敏、特異、早期診斷的意義，并開(kāi)始試用于臨床[16-17]。Burg等[18]和Homan等[19]報(bào)道用PCR方法分別檢測(cè)弓形蟲(chóng)基因組中35-拷貝B1基因首尾串聯(lián)（head-to-tail tandem）（GenBank accession number AF179871）194 bp 和300-拷貝 529 bp重復(fù)元素序列（repeat element sequence， RE） （GenBank accession number AF146527）。Cassaing等[20]報(bào)道用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)弓形蟲(chóng)B1、RE基因，比較了胎兒、新生兒、免疫低下和眼弓形蟲(chóng)病患者的診斷，結(jié)果顯示，弓形蟲(chóng)病B1基因分子診斷僅有33.3%的陽(yáng)性率，而用RE基因?qū)ρ蛩?、房水、全血、腦脊液和支氣管肺泡液等樣品有更高的陽(yáng)性率。Wang等[21]報(bào)道用 MAT（modified agglutination test，改良的凝集試驗(yàn)）檢出中國(guó)河南地區(qū)肉兔血清弓形蟲(chóng)抗體陽(yáng)性率為3.6%（44/1 213）。Pastorello等[22]報(bào)道 HIV病人死亡是由嚴(yán)重播散性弓形體病引起的彌散性壞死性肺炎、腦炎和難治性膿毒性休克的結(jié)果。Edvinsson等[23]報(bào)道在DNA濃度較低時(shí)，應(yīng)用弓形蟲(chóng)529 bp重復(fù)元素實(shí)時(shí)PCR提高了臨床免疫缺陷移植受體血液中弓形蟲(chóng)感染診斷的靈敏度和準(zhǔn)確性。Bourdin等[24]報(bào)道PCR檢測(cè)免疫缺陷患者血液樣本中弓形蟲(chóng)的敏感性高于免疫能力較強(qiáng)的患者。Burrells等[25]報(bào)道分別用ELISA和qPCR對(duì)人工感染弓形蟲(chóng)的小牛和小鼠進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：經(jīng)舌、腦和隔膜接種的小鼠具有較高的弓形蟲(chóng)DNA載量，如低Cq值所示；經(jīng)半腱肌接種的小鼠有較高的DNA載量（由低Cq值表示）和強(qiáng)烈的抗體反應(yīng)；經(jīng)腰大肌接種的小鼠也顯示低Cq值，但在ELISA中呈陰性；經(jīng)肝臟、心臟和三頭肌接種的小鼠抗體為陰性，具有較高的Cq值，但仍被歸類(lèi)為qPCR陽(yáng)性；經(jīng)咬肌和背最長(zhǎng)肌接種的小鼠保持了qPCR和ELISA陰性；抗體陽(yáng)性小牛的咬肌、心臟、隔膜、三頭肌、半腱肌中檢出了 DNA，肝臟中未檢出DNA。因此，研究認(rèn)為：在實(shí)驗(yàn)性感染動(dòng)物弓形蟲(chóng)傳播的檢測(cè)中，一個(gè)單一的測(cè)試并不能說(shuō)明全部的情況。

本研究首先采用ELISA法進(jìn)行弓形蟲(chóng)抗體（IgG）和循環(huán)抗原（CAg）檢測(cè)，然后再采用 PCR鑒定弓形蟲(chóng)p30基因進(jìn)行確診，兩者的檢測(cè)結(jié)果一致并由弓形蟲(chóng)速殖子形態(tài)學(xué)識(shí)別確認(rèn)，發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中確實(shí)存在弓形蟲(chóng)感染。此次感染弓形蟲(chóng)的豚鼠均為普通級(jí)動(dòng)物，雖然飼養(yǎng)在相對(duì)獨(dú)立封閉的空間內(nèi)，但依舊無(wú)法排除人、野鼠、貓、犬等傳播的弓形蟲(chóng)病，被污染的飼料、飲水、墊料也可能造成該病原體感染的進(jìn)一步擴(kuò)散傳播。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物感染弓形蟲(chóng)后，在正常免疫力的作用下，一般不會(huì)出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，大多數(shù)處于隱性感染狀態(tài)，但在免疫功能下降、處于應(yīng)激狀態(tài)或合并感染其他病原微生物時(shí)就可能導(dǎo)致嚴(yán)重感染甚至死亡。盡管?chē)?guó)內(nèi)相關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理部門(mén)已采取了一些相對(duì)嚴(yán)格的質(zhì)量監(jiān)管措施，然而一些廠家自身管理仍存在一定問(wèn)題。因此，切實(shí)加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)管工作，配備精干高效的抽檢隊(duì)伍，制定嚴(yán)格合理的篩查監(jiān)測(cè)程序，選用快速準(zhǔn)確的診斷技術(shù)，做好弓形蟲(chóng)病的預(yù)防傳播工作就顯得尤為重要。在今后的研究中，應(yīng)進(jìn)一步加大樣本采集數(shù)量，擴(kuò)大樣本采集范圍，為全面掌握我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物弓形蟲(chóng)感染情況和綜合防治提供科學(xué)依據(jù)。