■ 單春喬 陳桂芳 馮柳柳 劉 艷， 江國托，*

(1.大連三儀動物藥品有限公司，遼寧大連116036；2.江蘇三儀生物工程有限公司，江蘇邳州221300)

非淀粉多糖（Non-starch polysaccharides,NSP）是指植物中結構多糖的總稱，主要包括纖維素、半纖維素、果膠類、抗性淀粉四部分，飼料原料不同，含有的NSP的種類和數(shù)量也不一樣。玉米中主要NSP包括木聚糖、纖維素、β-葡聚糖，豆粕中NSP主要包括果膠、纖維素、甘露聚糖[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，家禽飼糧中NSP含量達5%時，就會產(chǎn)生抗營養(yǎng)作用[2]。NSP酶主要由木聚糖酶、β-葡聚糖酶、纖維素酶、果膠酶、甘露聚糖酶組成[3]。

目前主要使用生物學法、離體消化法篩選特異性酶譜組合的復合酶制劑。用生物學法篩選復合酶制劑不僅費時費力，并且實驗結果變化較大，而離體消化法應用于酶譜篩選中會達到事半功倍的效果[4]，并且有許多研究證明胃蛋白酶-胰酶兩步法與體內(nèi)真消化率有很高的相關性[5]。

近年來，傳統(tǒng)飼料與現(xiàn)代動物營養(yǎng)學技術的結合愈加明顯，在雞飼糧中使用NSP酶已經(jīng)非常普遍，但NSP酶在肉鴨飼糧中應用很少，主要關于肉鴨的NSP酶在我國的相關研究較少。NSP酶的作用效果受很多因素的影響，動物種類、飼養(yǎng)水平、酶的種類與水平等不同，效果差異較大。因此，針對飼糧的抗營養(yǎng)特性篩選與之適應的NSP酶對最大限度地利用飼料潛在還原糖的含量具有重要意義[6]。

為了探討NSP酶中酶的組成與活性同肉鴨飼糧潛在可利用還原糖的關系，本實驗以胃蛋白酶-胰液素兩步酶水解法為手段，以酶水解物的還原糖含量為尺度，針對肉鴨飼糧中NSP的特性，篩選與之適應的酶譜，為NSP酶制劑在肉鴨飼糧中的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗飼糧

本實驗選用玉米-豆粕型肉鴨飼糧，肉鴨基礎飼糧配制參照中華人民共和國肉鴨營養(yǎng)標準（2012）和NRC（1994）標準，基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平（飼喂基礎）

1.1.2 酶制劑和酶活定義

本實驗所用的主要酶制劑有：木聚糖酶（固體型，30萬U/g）、β-葡聚糖酶（固體型，3萬U/g）和甘露聚糖酶（固體型，5萬U/g），購自廣州億添元生物科技有限公司。

木聚糖酶酶活的定義：在37℃和pH值5.5的條件下，每分鐘從濃度為5 mg/ml的木聚糖溶液中降解釋放1 μmol的還原糖（以木糖計）所需要的酶量為1個酶活力單位(U)。

β-葡聚糖酶酶活的定義：在37℃和pH值5.5的條件下，每分鐘從濃度為4 mg/ml的β-葡聚糖溶液中分解釋放1 μmol還原糖（以葡萄糖計）所需要的酶量為1個酶活力單位(U)。

甘露聚糖酶酶活的定義：在37℃和pH值5.5的條件下，每分鐘內(nèi)從濃度為3 mg/ml的甘露聚糖溶液中分解釋放1 μmol的還原糖（以甘露糖計）所需要的酶量為1個酶活力單位(U)。

1.1.3 主要試劑

酶活底物葡聚糖（G6513-1G）、木聚糖（X4252-10G）、甘露聚糖（G0753-500G）購于Sigma公司；實驗試劑胃蛋白酶（P7000）、胰液素（P7545-25G）購于Sigma公司；氯霉素（0230）購于Biotopped公司；氫氧化鈉、鹽酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司；磺基水楊酸（分析純）購于天津市光復科技發(fā)展有限公司。

1.1.4 主要儀器

萬能粉碎機（上海比朗儀器有限公司）、大容量全溫度振蕩培養(yǎng)箱（太倉市華美生化儀器廠）、磁力攪拌器（常州市金壇晨陽電子儀器廠）、紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）、pH計（上海三信儀表廠）、真空抽濾泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗設計

按照表2的設計進行單因素實驗，之后選取甘露糖酶、β-葡聚糖酶及木聚糖酶三個因素，每個水平1個重復，采用3因素3水平進行響應面設計，因素水平見表3，響應面實驗方案見表4。

表2 單因素實驗設計(mg/g)

表3 響應面設計因素(mg/g)

1.2.2 離體消化的準備

將飼料粉碎至一定粒度（過40目篩），放置陰涼干燥處密閉保存。將所需用的磷酸鹽緩沖溶液、氫氧化鈉溶液、鹽酸溶液、磺基水楊酸溶液配好備用，實驗所需的胃蛋白酶溶液、胰液素和氯霉素溶液在做實驗前配制。

1.2.3 離體消化操作程序

離體消化的參數(shù)和離體消化程序參照趙峰的方法[7]，胃蛋白酶和胰液素酶的消化時間3～4 h最佳，水解溫度為38℃，胃蛋白酶水解的最適pH值為2～3，胰液素酶水解的最適pH值為6.6，胃蛋白酶（P7000）、胰液素（P7545-25G）不是肉鴨的特異性酶，其中飼料添加量、pH值等消化參數(shù)做了具體調(diào)整。

表4 響應面實驗設計方案表及實驗結果

胃蛋白酶水解階段：在1 000 ml燒杯中加入5 g過40目篩的飼料樣品，加入0.2 mol/l pH值6.0的磷酸緩沖液75 ml，混合均勻后，加入0.2 mol/l HCl溶液，并調(diào)整溶液pH值至3.0，之后加入20 mg/ml胃蛋白酶鹽酸溶液5 ml和0.5 mg/ml氯霉素乙醇溶液2.5 ml，按設計的添加量準確稱取酶制劑置于燒杯中，將燒杯放在38℃恒溫振蕩器中，回旋頻率為120 r/min，5 min后開始計時，震蕩4 h。

小腸液酶水解階段：待胃消化階段結束后，向溶液中加入0.2 mol/l pH值6.6的磷酸鹽緩沖液50 ml，用1 mol/l NaOH調(diào)整消化液的pH值至6.6，然后加入5 ml胰液素磷酸鹽緩沖液（含18.5 mg胰液素），把燒杯放在38℃恒溫震蕩器中，回旋頻率為120 r/min，5 min后開始計時，震蕩4 h。

抽濾階段：在消化殘渣中加入25 ml 20%磺基水楊酸，在室溫放置30 min，將燒杯中的殘留物進行真空抽濾，最終將酶解液定容，并測定還原糖含量。

1.2.4 還原糖含量測定

酶解液中還原糖含量的測定采用DNS法進行測定。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用EXCEL 2016對數(shù)據(jù)進行整理和分析，并做出相應的曲線圖。然后用SPSS 16.0進行逐步回歸分析，并對回歸模型和回歸系數(shù)進行顯著性檢驗，從而建立酶制劑組成中每克飼料各NSP酶添加量X（mg/g）與酶解液還原糖含量Y（mg/g）間的回歸方程。使用Design Expert 8.0對響應面的實驗結果進行回歸分析，得到NSP酶譜的最佳組合。

2 結果

2.1 NSP酶與還原糖含量測定結果（見圖1～圖3）

圖1 木聚糖酶對肉鴨飼料木糖含量的影響

圖1表示的是木聚糖酶與木糖之間的相關關系，從圖1中可以看出，隨著木聚糖酶添加量的增加，酶解液中木糖的含量先提高后下降，當木聚糖酶添加量為0.006 mg/g時，木糖含量最高，因此木聚糖酶的最適添加量確定為0.006 mg/g。

圖2 β-葡聚糖酶對肉鴨飼料葡萄糖含量的影響

圖2表示的是β-葡聚糖酶與葡萄糖之間的相關關系，從圖2中可以看出，隨著β-葡聚糖酶添加量的增加，酶解液中葡萄糖的含量先提高后降低，當β-葡聚糖酶添加量為0.005 mg/g時，葡萄糖含量最高，因此β-葡聚糖酶的最適添加量為0.005 mg/g。

圖3表示的是甘露聚糖酶與甘露糖之間的相關關系，從圖3中可以看出，隨著甘露聚糖酶添加量的增加，酶解液中甘露糖的含量先提高后下降，當甘露聚糖酶添加量為0.018 mg/g時，甘露糖含量最高，因此甘露聚糖酶的最適添加量為0.018 mg/g。

圖3 甘露聚糖酶對肉鴨飼料甘露糖含量的影響

2.2 非淀粉多糖酶添加量與還原糖含量之間的方程及相關參數(shù)

各種NSP酶的添加量與還原糖含量之間的三次相關方程見表5。

從表5可以知道，NSP酶與還原糖之間都存在顯著（P＜0.05）的相關關系，而且還原糖含量與NSP酶的三次關系的相關度很高。

2.3 響應面法實驗結果

根據(jù)表4的實驗設計及結果，使用Design Expert 8.0對實驗結果進行回歸分析，得到以甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶和木聚糖酶為自變量，還原糖含量為響應值的二次多項回歸方程。

表5 非淀粉多糖酶添加量與還原糖含量之間的方程

式中：Y——還原糖含量（mg/g）；

A——甘露聚糖酶濃度（mg/g）；

B——β-葡聚糖酶濃度（mg/g）；

C——木聚糖酶濃度（mg/g）。

依據(jù)回歸方程利用軟件Design Expert 8.0繪制響應面圖，如圖4所示。

響應面圖能直觀的反映實驗參數(shù)與響應值的關系，其等高線圖也能表明因素之間的交互作用。如圖4所示，圖（a）是以甘露糖酶和β-葡聚糖酶為變量生成的響應面圖，方差分析中AB（P=0.523 3）大于0.05，表明甘露糖酶和β-葡聚糖酶之間有一定的交互作用。以甘露糖酶和木聚糖酶為變量生成的響應面圖在圖（b）中呈現(xiàn)，方差分析中 AC（P=0.667 6）大于0.05，表明其交互作用不顯著。圖（c）為β-葡聚糖酶和木聚糖酶為變量生成的響應面圖，且方差分析中BC（P=0.727 4）大于0.05，表明β-葡聚糖酶和木聚糖酶之間交互作用不明顯。之后對回歸模型方差分析，結果見表6。

由表6知，整體模型顯著（P＜0.05），失擬相不顯著（P＞0.05），表明回歸方程有較好的擬合程度。A（甘露聚糖酶）、B（β-葡聚糖酶）、C（木聚糖酶）、A2、B2和C2對結果有顯著影響（P＜0.05）；AB、AC、BC交互項對實驗結果無顯著影響（P＞0.05）。

然后利用軟件Design-Expert 8.0對方程模型進行分析，得到的最佳參數(shù)條件為A=0.015 mg/g，B=0.008 mg/g，C=0.007 mg/g，即甘露聚糖酶為0.015 mg/g、β-葡聚糖酶為0.008 mg/g及木聚糖酶為0.007 mg/g的添加水平，在此條件下，預測酶解液還原糖含量121.68 mg/g。在此條件下進行3次重復實驗，得到還原糖含量為120.43 mg，與理論值的誤差為1.03%，表明所得模型能反映出各因素對還原糖的影響。

圖4 甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶對還原糖影響的響應面圖

表6 回歸模型的方差分析

3 討論

本實驗通過體外模擬法研究了β-葡聚糖酶、甘露聚糖酶和木聚糖酶對肉鴨的飼料還原糖含量的影響，實驗結果表明，肉鴨飼糧中，木聚糖酶的最適添加量確定為0.006 mg/g，β-葡聚糖酶的最適添加量為0.005 mg/g，甘露聚糖酶的最適添加量為0.018 mg/g。飼糧的最佳NSP酶酶譜為甘露聚糖酶為0.015 mg/g、β-葡聚糖酶為0.008 mg/g、木聚糖酶為0.007 mg/g的添加水平。

木聚糖是植物半纖維素的主要組成部分，是谷物籽實中的重要NSP之一，木聚糖抑制了谷物中的營養(yǎng)物質和動物消化液的反應，進而影響動物的消化吸收能力，降低了飼料的營養(yǎng)價值[8]。木聚糖酶可以對木聚糖進行專一分解，通過分解畜禽消化道中的木聚糖，降低食糜黏性，提高營養(yǎng)物質的消化吸收，降低畜禽下痢，因此促進了畜禽生長和提高飼料轉化率[9]。張芹[10]研究發(fā)現(xiàn)在雞飼糧中添加木聚糖酶和纖維素酶都可以提高雞的消化能力，增加酶解液中還原糖的濃度，其中木聚糖酶的添加量在5 mg時，酶解液中還原糖濃度增加了10.85%，黏度降低了7.95%。結果表明，在體外條件下，酶制劑可有效的提高飼料的消化吸收，增加飼料的可利用養(yǎng)分。有研究表明，添加木聚糖酶可顯著降低玉米、小麥和麥麩的抗營養(yǎng)因子的含量（P＜0.05），并顯著的提高木糖的含量（P＜0.05），與本實驗的實驗結果一致[11-12]。

β-葡聚糖具有特殊的支鏈性結構，使分子折疊，持水力增加，引起腸道食糜黏度增加，通過網(wǎng)狀結構的形成而吸收水分子，產(chǎn)生凝膠，從而改變了腸道的物理活性，降低了營養(yǎng)物質的消化吸收[13]。β-葡聚糖酶使β-葡聚糖對養(yǎng)分和內(nèi)源消化酶的擴散抑制作用降低，飼料養(yǎng)分的消化率和吸收利用率提高[14]。侯小鋒[15]報道，在玉米-豆粕型飼糧中添加外源酶制劑，體外模擬肉仔雞消化過程，研究添加酶制劑對飼料體外消化的影響，結果發(fā)現(xiàn)，NSP酶制劑的添加能夠促進飼料能量的離體消化率，提高飼料中葡萄糖的含量。Yu等[14]報道，采用NSP酶和蛋白酶為主的酶制劑對玉米-豆粕型飼料進行體外消化，結果表明，酶制劑能夠促進飼料的消化，提高蛋白質的消化率，增加葡萄糖的含量。

NSP酶作為特異性降解飼料原料的消化酶添加在飼料中，從原理上講可以實現(xiàn)分解NSP，從而提高飼料中營養(yǎng)物質的消化吸收能力。酶具有提高體內(nèi)代謝激素水平、增強畜禽免疫力并降低可溶性NSP對畜禽內(nèi)源酶的抑制等作用[16]。Meng等[17]報道，玉米-豆粕型飼糧中添加木聚糖酶、β-葡聚糖酶、果膠酶、纖維素酶、甘露聚糖酶和半乳聚糖酶等NSP酶后，家禽飼糧的表觀代謝能發(fā)生明顯的增加（P＜0.05），同一添加量隨飼糧中非常規(guī)飼料原料含量的提高，提高作用更趨于顯著。丁斌鷹等[18]的研究發(fā)現(xiàn)，在40%稻谷型肉鴨飼糧中添加300～600 g/t稻谷專用酶制劑，可提高粗蛋白質的表觀利用率2.20%～2.87%（P＜0.05），顯著提高總磷表觀利用率13.89%～23.23%（P＜0.05），極顯著改善植酸磷的利用率21.59%～30.37%（P＜0.01），極顯著提高粗纖維的利用率32.30%～92.68%（P＜0.01）。

飼料不同，酶作用的底物不同，所需要酶的種類和添加量也不同，因此，要充分發(fā)揮酶制劑的作用，必須根據(jù)飼料中的具體營養(yǎng)水平選擇相對應的酶制劑[19]。本實驗根據(jù)肉鴨飼料中的飼料組成確定了相應的NSP酶，提高了還原糖的含量，填補了NSP酶在肉鴨飼糧研究的空白，為NSP酶在肉鴨飼糧中的應用提供了研究數(shù)據(jù)，使肉鴨能更好的利用飼糧。

4 結論

響應面法優(yōu)化得到，肉鴨飼糧的最佳非淀粉多糖酶譜：甘露聚糖酶為0.015 mg/g、β-葡聚糖酶為0.008 mg/g、木聚糖酶為0.007 mg/g。在肉鴨飼糧中添加該組合的非淀粉多糖酶可以提高還原糖含量，促進營養(yǎng)物質的吸收和利用。