■李軍濤 冼健安 陳惠琴 張秀霞 鄭佩華 魯耀鵬 王冬梅

(中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，海南?？?71101)

杜仲是中國(guó)的的名貴滋補(bǔ)藥材。飼料中適量添加有助于提高動(dòng)物的生長(zhǎng)性能、抗應(yīng)激和抗氧化能力等[1-5]。在集約化養(yǎng)殖中，為了追求水產(chǎn)動(dòng)物更高、更快的生長(zhǎng)性能，飼料中脂肪的添加量越來越高，由于機(jī)體自身膽汁酸和胰脂肪酶分泌量不足，導(dǎo)致脂肪利用率很低，對(duì)動(dòng)物體產(chǎn)生不良的影響。一方面過剩的脂肪容易被氧化，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒害作用，另一面消化吸收不完全的脂肪進(jìn)入腸道后段易被有害菌利用引起腹瀉等腸道疾病。膽汁酸的添加可以有效的提高機(jī)體對(duì)脂肪的消化吸收、利用率等，從而降低飼料代謝能耗，節(jié)約成本。已有的研究表明，在畜禽飼料中添加膽汁酸，可以改善飼料品質(zhì)、穩(wěn)定飼料質(zhì)量，達(dá)到提高生長(zhǎng)性能、降低料肉比[6-9]，同時(shí)還可以暢通腸道，起到保肝護(hù)膽的作用。在水產(chǎn)動(dòng)物方面，近年來國(guó)內(nèi)外的學(xué)者已經(jīng)在日本鰻鱺（Anguilla japonica）[10]、牙鲆（Paralichthys olivaceus）[11]、羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）[12-13]等物種上開展研究。凡納濱對(duì)蝦是我國(guó)最廣泛的海水蝦類養(yǎng)殖品種，受水體污染加劇和高效配合飼料匱乏的限制，養(yǎng)殖成功率低下，其中的一個(gè)重要原因就是凡納濱對(duì)蝦相對(duì)簡(jiǎn)單的機(jī)體構(gòu)造不足以應(yīng)對(duì)劇烈的環(huán)境變化。本研究以杜仲提取物和膽汁酸為中草藥添加劑，探究添加后對(duì)凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)性能和免疫相關(guān)酶活性的變化。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料

飼料采用的是海大集團(tuán)凡納濱對(duì)蝦專用飼料作為基礎(chǔ)飼料，分別添加0.3 g/kg的杜仲提取物對(duì)照組，(0.3+0.08)、(0.3+0.12)、(0.3+0.16)g/kg杜仲提取物和膽汁酸共3個(gè)添加梯度的試驗(yàn)組。配制飼料前先將杜仲提取物和膽汁酸充分溶解，采用梯度稀釋的方法制作各個(gè)試驗(yàn)組飼料，將制好的飼料自然風(fēng)干，分別儲(chǔ)存在-20℃的冰箱中備用，飼喂前將飼料解凍至室溫。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在除日糧外的養(yǎng)殖系統(tǒng)、飼養(yǎng)條件等外界條件均相同的情況下，設(shè)置對(duì)照組和各試驗(yàn)組。正式試驗(yàn)開始前將蝦苗暫養(yǎng)在3 m3圓形鋼化玻璃缸中，并投喂基礎(chǔ)飼料進(jìn)行馴化飼養(yǎng)，待蝦苗長(zhǎng)到2.5 cm左右，選擇體格健壯，無病無害，生長(zhǎng)狀況良好的蝦苗隨機(jī)分為4組，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30尾蝦。試驗(yàn)開始時(shí)平均初始體重為(0.193±0.002)g，每箱的總重是(5.82±0.05)g。分箱后再用基礎(chǔ)飼料暫養(yǎng)3 d，試驗(yàn)蝦達(dá)到攝食的穩(wěn)定狀態(tài)后開始飼養(yǎng)試驗(yàn)。試驗(yàn)日糧按照蝦總重的5%～8%投喂(日投飼量按照蝦的攝食情況和水溫具體制定)。

1.3 飼養(yǎng)管理

養(yǎng)殖試驗(yàn)是2017年5～7月在海南省澄邁縣拔南村寶萊生物科技公司試驗(yàn)基地進(jìn)行。養(yǎng)殖箱的規(guī)格為長(zhǎng)×寬×高為50 cm×40 cm×40 cm，養(yǎng)殖箱水深25 cm左右，整個(gè)飼養(yǎng)期間保持水質(zhì)穩(wěn)定，水溫控制在28～33 ℃，溶氧6.0 mg/l以上，pH值6.8～7.5，氨氮0.02～0.04 mg/l，亞硝酸鹽0.02～0.04 mg/l，鹽度 15‰～18‰。整個(gè)試驗(yàn)持續(xù)時(shí)間6周，每天7:00、11:00、15:00、19:00各投喂一次，每次投喂后40 min利用虹吸管收集殘餌，在烘箱中70℃烘干，記錄投喂量和殘餌量。每天換水，換水量為整個(gè)養(yǎng)殖水箱的1/3左右，每?jī)蓚€(gè)星期稱重一次，用來矯正投飼率。

1.4 樣品采集和制備

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，停食24 h，測(cè)定試驗(yàn)蝦生長(zhǎng)性能。測(cè)定各箱蝦的總重并記錄尾數(shù)，每箱蝦隨機(jī)抽取6尾，測(cè)量每尾蝦的體長(zhǎng)、體重，抽取血淋巴立即注入加有抗凝劑的Ep管中，并在冰盤上解剖分離肝胰臟和腸道并稱取重量，所有樣品立即放入液氮罐中，樣品采集完成后，保存在-80℃冰箱備用。統(tǒng)計(jì)飼喂量、餌料系數(shù)、肥滿度、肝體比、增重率、成活率。

1.5 測(cè)定指標(biāo)

1.5.1 生長(zhǎng)性能指標(biāo)

1.5.2 免疫相關(guān)酶活性指標(biāo)的測(cè)定

酶活性測(cè)定的試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。酶活力的測(cè)定方法按照試劑盒的說明書測(cè)定。

1.6 數(shù)據(jù)分析

Excel初步計(jì)算后所有的試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan's法多重比較，試驗(yàn)結(jié)果均采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示，P＜0.05表示差異顯著。并用Origin 8.0作柱狀圖顯示結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加杜仲提取物及膽汁酸對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能的影響（見表1）

表1 添加杜仲提取物及膽汁酸對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能的影響

由表1可知，對(duì)照組的肥滿度系數(shù)與其他各試驗(yàn)組差異不顯著(P＞0.05)，隨著膽汁酸添加梯度的增加，肥滿度呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，但試驗(yàn)組均高于對(duì)照組，肥滿度系數(shù)最高的是(0.3+0.08)g/kg組，結(jié)果是5.754%；對(duì)照組與各試驗(yàn)組的餌料系數(shù)沒有出現(xiàn)顯著差異(P＞0.05)，其中(0.3+0.12)g/kg組最小為1.402；試驗(yàn)組的肝體比明顯低于對(duì)照組，差異顯著(P＜0.05)，且(0.3+0.16)g/kg組顯著低于(0.3+0.08)g/kg組，差異顯著(P＜0.05)，與(0.3+0.12)g/kg組，差異不顯著(P＞0.05)，(0.3+0.16)g/kg組肝體比系數(shù)最小為4.684%；各試驗(yàn)組的成活率均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。(0.3+0.12)、(0.3+0.16)g/kg組增重率高于對(duì)照組(P＜0.05)。綜合以上各生長(zhǎng)性能指標(biāo)，研究發(fā)現(xiàn)各添加膽汁酸組均可以提高凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)速度、增加可食用部分、提升成活率、降低餌料系數(shù)?；谏L(zhǎng)性能的各指標(biāo)，(0.3+0.12)g/kg的杜仲提取物與膽汁酸為最優(yōu)添加組。

2.2 添加杜仲提取物及膽汁酸對(duì)凡納濱對(duì)蝦免疫相關(guān)酶活性的影響

2.2.1 添加杜仲提取物及膽汁酸對(duì)凡納濱對(duì)蝦溶菌酶活性的影響（見圖1）

如圖1所示，在血清中溶菌酶的活性對(duì)照組顯著低于各試驗(yàn)組(P＜0.05)，各試驗(yàn)組之間差異不顯著(P＞0.05)，溶菌酶活性最高的是(0.3+0.08)g/kg組，達(dá)到了5.93 U/ml，杜仲提取物與膽汁酸共同添加后，可以明顯的提高凡納濱對(duì)蝦血清中溶菌酶的活性；在肝臟中，對(duì)照組的溶菌酶活性顯著低于(0.3+0.12)、(0.3+0.16)g/kg組(P＜0.05)，與(0.3+0.08)g/kg組差異不顯著(P＞0.05)，溶菌酶活性最高的兩組依次是(0.3+0.16)、(0.3+0.12)g/kg 組，分別達(dá)到1.256、1.250 U/ml?；谌芫冈诟闻K和血清兩個(gè)組織中的酶活性，(0.3+0.12)g/kg杜仲提取物與膽汁酸共同添加是較優(yōu)的添加梯度。

圖1 肝臟和血清中的溶菌酶活性及顯著性變化

2.2.2 添加杜仲提取物及膽汁酸對(duì)凡納濱對(duì)蝦丙二醛(MDA)含量的影響（見圖2）

由圖2所示，血清中，(0.3+0.08)、(0.3+0.12)g/kg組MDA水平分別為5.397、5.342 nmol/ml，顯著低于對(duì)照組和(0.3+0.16)g/kg組(P＜0.05)；在肝臟中，(0.3+0.12)g/kg組的MDA水平顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，其他組間差異不顯著(P＞0.05)，MDA水平最低的(0.3+0.12)g/kg組含量為5.342 nmol/ml，添加膽汁酸能有效的降低MDA水平。MDA水平的高低反映自由基對(duì)機(jī)體的損傷情況，所以(0.3+0.12)g/kg組的凡納濱對(duì)蝦健康程度最好，為杜仲提取物與膽汁酸共同添加是較優(yōu)的添加梯度。

圖2 肝臟和血清中的MDA含量及顯著性變化

2.2.3 添加杜仲提取物及膽汁酸對(duì)凡納濱對(duì)蝦過氧化氫酶(CAT)活性的影響（見圖3）

圖3 肝臟和血清中的CAT活性及顯著性變化

圖3可知，在血清中凡納濱對(duì)蝦CAT的活性，對(duì)照組與各試驗(yàn)組都沒有出現(xiàn)顯著性差異(P＞0.05)，(0.3+0.12)g/kg組的活性明顯高于(0.3+0.16)g/kg組，差異顯著(P＜0.05)，與(0.3+0.08)g/kg組差異不顯著(P＞0.05)，CAT 活性最高的(0.3+0.12)g/kg組達(dá)到4.59(U/mg prot.)；在肝臟中，對(duì)照組與各試驗(yàn)組沒有出現(xiàn)顯著性差異(P＞0.05)，(0.3+0.12)g/kg組的活性明顯高于(0.3+0.16)、(0.3+0.08)g/kg組，差異顯著(P＜0.05)，其他組間差異不顯著(P＞0.05)，CAT活性最高的(0.3+0.12)g/kg組達(dá)到6.62(U/mg prot.)，CAT是過氧化物酶體的標(biāo)志酶，代表機(jī)體的抗氧化能力?；贑AT活性在肝臟和血清兩種組織的共同變化，最佳在添加量為(0.3+0.12)g/kg杜仲提取物和膽汁酸共同添加組。

2.2.4 添加杜仲提取物及膽汁酸對(duì)凡納濱對(duì)蝦酚氧化酶(phenoloxidase，PO)活性的影響（見圖4）

圖4 血清中的PO活性及顯著性變化

由圖4可知，對(duì)照組與其他試驗(yàn)組間差異不顯著(P＞0.05)，(0.3+0.12)g/kg組明顯高于(0.3+0.08)g/kg組，差異顯著(P＜0.05)，PO是在氧分子存在條件下，能把酚類氧化成鄰苯醌或?qū)σ槐锦拿?，減少動(dòng)物體受到酚類物質(zhì)對(duì)機(jī)體的損害，(0.3+0.12)g/kg組的PO活性最高，達(dá)到3.82 U/mg，為該條件下較合適的添加量。因此，結(jié)果表明在(0.3+0.12)g/kg的杜仲提取物和膽汁酸共同添加較合適。

2.2.5 添加杜仲提取物及膽汁酸對(duì)凡納濱對(duì)蝦谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT/AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT/ALT)活性的影響（見圖5）

圖5 肝臟中的GOT、GPT活性及顯著性變化

由圖5可知，對(duì)照組GOT活性顯著低于試驗(yàn)組(P＜0.05)，其他組間差異不顯著(P＞0.05)，GOT活性的高低反映動(dòng)物體肝臟的健康程度，其升高的程度與肝細(xì)胞受損的程度相一致；對(duì)照組、(0.3+0.12)g/kg組的GPT 活性顯著低于(0.3+0.08)、(0.3+0.16)g/kg組(P＜0.05)，(0.3+0.16)g/kg組顯著低于(0.3+0.08)g/kg組(P＜0.05)。因此，本研究結(jié)果表明在(0.3+0.12)g/kg的杜仲提取物及膽汁酸添加量較合適。

3 討論

3.1 添加杜仲提取物和膽汁酸對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能的影響

已有的研究表明飼料中添加杜仲提取物，可以有效的提高水產(chǎn)動(dòng)物的生長(zhǎng)性能。季延濱等[14]報(bào)道，對(duì)中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis Milne-Edwards)投喂添加1%的杜仲提取物2周后，試驗(yàn)組的肥滿度明顯高于對(duì)照組，差異顯著(P＜0.05)；劉波等[15]研究發(fā)現(xiàn)凡納濱對(duì)蝦經(jīng)過42 d養(yǎng)殖試驗(yàn)，2.0%杜仲組的蝦體增重率最高(136.1%)，飼料系數(shù)最低(1.33)，差異顯著(P＜0.05)。鯉魚(Cyprinus carpio)[16]、羅氏沼蝦[17]等的研究得到類似的結(jié)果；本次試驗(yàn)中研究發(fā)現(xiàn)添加膽汁酸能夠提高凡納濱對(duì)蝦的成活率、增重率，降低餌料系數(shù)，這與周書耕等[18]在軍曹魚(Rachycentroncanadum)飼料中添加0.03%膽汁酸與對(duì)照組相比能降低餌料系數(shù)，提高增重率結(jié)果一致。胡田恩等[19]研究發(fā)現(xiàn)在牛蛙[Rana(Lithobates)catesbeiana]飼料中添加200 mg/kg的膽汁酸不僅可以提高特定生長(zhǎng)率、蛋白利用效率等指標(biāo)，還可有效的降低牛蛙的臟體比和全體的脂肪率。本次試驗(yàn)中各試驗(yàn)組的的肝體比指數(shù)明顯低于對(duì)照組。對(duì)齊口裂腹魚(Schizothorax prenanti)的研究發(fā)現(xiàn)，隨著飼料中膽汁酸添加水平的不斷提高，增重率、特定生長(zhǎng)率、蛋白利用效率等指標(biāo)呈現(xiàn)出先上升后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)，餌料系數(shù)則為先下降后趨于穩(wěn)定[20]。這與此次試驗(yàn)得到的變化趨勢(shì)接近。此外在加州鱸(Micropterus salmoides)[21]、大菱鲆(Scophthalmus maximus)幼魚[22]、羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)[23]的養(yǎng)殖試驗(yàn)中得到結(jié)果類似?？赡艿脑蚴牵阂环矫嫣砑幽懼岷螅行У奶岣吡朔布{濱對(duì)蝦對(duì)飼料的利用率。對(duì)吉富羅非魚(tilapia)[24]的研究發(fā)現(xiàn)，飼料添加膽汁酸能夠顯著提高脂肪酶、蛋白酶的活力，草魚(Ctenopharyngodon idellus)[25]飼料中添加膽汁酸后腸道各段及肝胰臟的消化酶活性均隨添加量的增加呈先升高后下降的趨勢(shì)。另一方面添加膽汁酸能夠改變凡納濱對(duì)蝦腸道內(nèi)的微生物菌群系統(tǒng)。對(duì)飼喂膽汁酸的各組草魚腸道微生物16S rRNA進(jìn)行宏基因組測(cè)序，結(jié)果表明會(huì)降低草魚腸道微生物的多樣性，有害菌豐度降低，可能通過調(diào)控菌群分布達(dá)到提高消化能力。第三，本次試驗(yàn)中杜仲提取物和膽汁酸共同添加，兩者都有提高生長(zhǎng)性能的表現(xiàn)，兩者的交互作用可能進(jìn)一步發(fā)揮功效，為研制高效綠色配合飼料提供理論支撐。

3.2 添加杜仲提取物和膽汁酸對(duì)凡納濱對(duì)蝦免疫相關(guān)酶活性的影響

凡納濱對(duì)蝦屬于節(jié)肢動(dòng)物們無脊椎低等生物，沒有完整的免疫系統(tǒng)，主要依靠自身的非特異性免疫抵抗細(xì)菌、病毒等有害物質(zhì)，血清和肝臟的溶菌酶含量能夠在一定程度上反映非特異免疫的水平。張玲等[26]研究發(fā)現(xiàn)，鯉魚飼料中添加膽汁酸可以顯著提高溶菌酶的活性(P＜0.05)。本試驗(yàn)中血清中溶菌酶含量各試驗(yàn)組明顯高于對(duì)照組，差異顯著(P＜0.05)，肝臟中，對(duì)照組的溶菌酶活性顯著低于(0.3+0.12)、(0.3+0.16)g/kg組，差異顯著(P＜0.05)，可能的原因是添加了膽汁酸后，促進(jìn)了凡納濱對(duì)蝦的非特異性免疫，增加了對(duì)溶菌酶的分泌。陳科全等[25]在研究草魚飼料添加膽汁酸的試驗(yàn)中通過測(cè)定肝臟、腸道、血清的MDA含量，認(rèn)為膽汁酸是維持肝-腸循環(huán)途徑健康的重要成分。本試驗(yàn)中測(cè)定添加杜仲提取物及膽汁酸對(duì)凡納濱對(duì)蝦丙二醛(MDA)含量，血清中添加(0.3+0.12)、(0.3+0.08)g/kg組MDA水平低于對(duì)照組，差異顯著(P＜0.05)；在肝臟中，(0.3+0.12)g/kg組的MDA含量顯著低于對(duì)照組，差異顯著(P＜0.05)，可能的原因是添加膽汁酸后有效的抑制了MDA等有害物質(zhì)對(duì)血清和肝臟的排放。李莉等[27]通過給小鼠注射MDA，發(fā)現(xiàn)代謝途徑是由血液流向肝臟，說明體內(nèi)的自由基、MDA等有害物質(zhì)對(duì)動(dòng)物體的多個(gè)器官組織造成損傷[28]，危害巨大。CAT、PO是反映機(jī)體抗氧化、氧化機(jī)體有害物質(zhì)能力的酶，是酶免疫系統(tǒng)的重要組成部分[29]。正常情況下，GPT、GOT在心肌細(xì)胞中含量最高，其次為肝臟，血清中含量極少。在肝臟中，主要存在于肝細(xì)胞線粒體內(nèi)，是蛋白質(zhì)代謝的動(dòng)力酶[30]。本試驗(yàn)各試驗(yàn)組肝臟GOT活性顯著高于對(duì)照組，(0.3+0.08)、(0.3+0.16)g/kg組GPT顯著高于對(duì)照組，這與Maria A等[31]報(bào)道添加膽汁酸能夠增加肝細(xì)胞內(nèi)的氨基酸利用率。因此，添加一定量的膽汁酸可以一定程度上提高對(duì)凡納濱對(duì)蝦免疫相關(guān)酶的活性，增強(qiáng)非特異免疫。由酶的種類、個(gè)體差別等因素，酶的活性變化存在不同步的差異。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)主要在凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)性能和免疫相關(guān)酶的活性方面進(jìn)行探討，旨在確定杜仲提取物及膽汁酸的添加量?；谏L(zhǎng)性能的各指標(biāo)，(0.3+0.12)g/kg杜仲提取物與膽汁酸添加組為最優(yōu)添加組。由于免疫相關(guān)酶種類的不同及活性在不同組織中的差異性，試驗(yàn)結(jié)果有較大差異，綜合考慮，試驗(yàn)認(rèn)為(0.3+0.12)g/kg杜仲提取物與膽汁酸添加組為最優(yōu)添加組，這與生長(zhǎng)性能評(píng)價(jià)的結(jié)果一致。