張真真,曲愛娟,王艷

(1.北京大學(xué)第一醫(yī)院感染疾病科，北京 100034；2.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生理學(xué)與病理生理學(xué)系，重塑相關(guān)心血管疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100069)

對(duì)乙酰氨基酚(acetaminophen,APAP)是一種常見的解熱鎮(zhèn)痛藥物，正常劑量情況下發(fā)揮解熱鎮(zhèn)痛作用，然而APAP過量時(shí)常常引起急性肝損傷甚至誘導(dǎo)肝衰竭，死亡率較高。1966年，Davidson等首次報(bào)道了2例由于APAP引起肝壞死的病例[1]。1973年Mitchell等通過APAP動(dòng)物模型系列研究APAP肝損傷機(jī)制，表明APAP經(jīng)過I相代謝酶細(xì)胞色素P450 酶代謝形成活性產(chǎn)物N-乙?；?對(duì)-苯醌亞胺(N-acetyl-p-benzoquinone imine,NAPQI)，谷胱甘肽(glutathion,GSH)耗竭，NAPQI蓄積與大分子蛋白質(zhì)結(jié)合形成共價(jià)化合物，從而造成肝細(xì)胞損傷，也稱為代謝階段損傷[2]。2005年Reid等研究表明APAP誘導(dǎo)的肝損傷不僅引起代謝階段損傷，進(jìn)一步引起肝細(xì)胞內(nèi)線粒體損傷，氧化應(yīng)激形成[3]，隨后大量研究表明APAP經(jīng)過代謝階段以及氧化應(yīng)激階段兩次打擊學(xué)說以后觸發(fā)多條信號(hào)通路，最終引起肝細(xì)胞損傷[4-5]。其中過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferator activated receptor alpha,PPARα)是核受體超家族成員之一，參與肝臟代謝酶的調(diào)節(jié)，本文將綜述PPARα在APAP肝損傷的作用機(jī)制以及研究進(jìn)展。

1 APAP肝損傷的發(fā)病機(jī)制

過量的APAP引起肝損傷在體內(nèi)經(jīng)歷兩次打擊學(xué)說(代謝損傷以及氧化應(yīng)激引起的損傷放大)。造成肝細(xì)胞壞死，釋放損傷相關(guān)分子模式(damage associated molecular patterns,DAMPs)，最終引起肝內(nèi)無菌性炎癥反應(yīng)，對(duì)肝損傷和修復(fù)發(fā)揮雙重調(diào)節(jié)作用。

1.1APAP的代謝治療劑量APAP大多數(shù)通過肝內(nèi)Ⅱ相代謝酶UDP-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UDP-glucuronosyltrans-ferase,UGT)和磺基轉(zhuǎn)移酶(sulfotransferase,SULT)轉(zhuǎn)化為無毒的葡萄糖醛酸鹽或硫酸鹽從腎臟排泄，其中UGT酶包括UGT1A1，UGT1A6，SULT酶包括SULT1A1，SULT1A3/3，SULT1E1，少部分通過I相代謝酶細(xì)胞色素P450酶系(主要為CYP2E1)轉(zhuǎn)化為活性代謝產(chǎn)物NAPQI,NAPQI隨后在谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase,GST)的作用下與肝內(nèi)GSH結(jié)合，轉(zhuǎn)化為無毒的APAP-GSH，從膽汁排泄；當(dāng)APAP過量時(shí)，將引起NAPQI在體內(nèi)蓄積，GSH耗竭，過多的NAPQI與肝細(xì)胞線粒體內(nèi)大分子蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合，形成蛋白質(zhì)共價(jià)化合物，抑制線粒體氧化呼吸，引起線粒體氧化應(yīng)激，活性氧(reactive oxygen species,ROS)產(chǎn)生，造成線粒體第一次打擊[6]。

1.2線粒體氧化應(yīng)激引起損傷放大APAP代謝損傷僅占很小一部分，當(dāng)活性代謝產(chǎn)物NAPQI與線粒體大分子蛋白質(zhì)結(jié)合，引起線粒體氧化應(yīng)激，ROS產(chǎn)生，激活腺苷酸活化蛋白激酶[adenosine 5′-monophosphate (AMP)-activated protein kinase,AMPK]信號(hào)通路，早期(0～2 h)引起糖原合成酶激酶-3β (glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)以及MAP3k混合譜系酶3(mixed lineage kinase 3,MLK3)的激活，而在晚期(2～4 h)則促進(jìn)凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1(apoptosis signal regulating kinase 1,ASK1)激活，兩者均能引起絲裂原活化蛋白激酶激酶4/7 (mitogen-activated protein kinase Kinases 4/7,MKK4/7) 激活，最終引起c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK) 磷酸化，磷酸化的JNK與線粒體外膜蛋白Sab結(jié)合，進(jìn)一步抑制線粒體氧化呼吸，引起第二次打擊，ROS持續(xù)產(chǎn)生，最終引起線粒體膜通透性孔開放(mitochondria permeability transition,MPT)，膜勢(shì)能下降，繼而肝細(xì)胞壞死[4]。

1.3肝細(xì)胞壞死APAP引起的肝細(xì)胞壞死主要為程序性壞死，程序性壞死是受體相互作用蛋白(receptor interacting protein,RIP)家族所介導(dǎo)的，RIP1和RIP3相互結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞由凋亡轉(zhuǎn)換至壞死，引起細(xì)胞程序性壞死[7]。有研究表明RIPK1[8]以及RIPK3[9]參與APAP誘導(dǎo)的肝壞死，同時(shí)研究表明APAP通過活化RIPK1進(jìn)一步激活JNK引起肝細(xì)胞壞死[8]，然而RIPK1通過什么機(jī)制激活JNK并不清楚，并且RIPK1以及RIPK3是否參與APAP肝損傷目前仍然存在爭議[8-9]。

1.4無菌性炎癥壞死的肝細(xì)胞釋放DAMP，包括高遷移率族蛋白1 (high mobility group box-1 protein,HMGB1)、核DNA、熱休克蛋白(heat shock protein,HSPs)、角蛋白18(keratin 18,K18)，激活先天固有免疫系統(tǒng)，引起肝內(nèi)無菌性炎癥反應(yīng)，釋放細(xì)胞因子和趨化因子，趨化單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞到達(dá)損傷部位，加重?fù)p傷并促進(jìn)再生修復(fù)[10-11]。而炎癥小體在APAP肝損傷的作用機(jī)制目前還存在爭議[12]，尚需進(jìn)一步研究。

2 PPARα在APAP肝損傷的作用

PPARα是配體激活的核受體，在代謝調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要的作用。PPARα主要表達(dá)于脂肪酸氧化代謝速率較高的組織如肝臟、心臟、骨骼肌、棕色脂肪組織以及腎臟，也可表達(dá)于免疫細(xì)胞如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞。PPARα調(diào)節(jié)脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)脂肪酸氧化，維持脂代謝平衡[13]；并具有抗炎和抗增殖效應(yīng)[14]。臨床上PPARα激動(dòng)劑用于治療高三酰甘油血癥和低密度脂蛋白膽固醇的血脂異常[15]。

2.1PPARα并不參與調(diào)節(jié)APAP肝臟代謝活化

利用PPARα激動(dòng)劑研究證實(shí)PPARα促進(jìn)多藥耐藥相關(guān)蛋白(multidrug resistance-associated protein)Mrp3和Mrp4的表達(dá)從而保護(hù)APAP肝損傷，但并不影響APAP代謝，NAD(P)H:醌氧還酶1 (NQO1)、NAPQI以及UGT酶的活性均無顯著改變[16]。PPARα全基因敲除小鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果亦證實(shí)PPARα并不通過影響APAP代謝活化而保護(hù)肝臟[17]。

2.2PPARα是否通過磷酸化參與調(diào)節(jié)APAP誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激尚需驗(yàn)證通過液相色譜質(zhì)譜技術(shù)(liquid chromatograph mass Spectrometer,LC-MS)代謝組學(xué)研究以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)PPARα通過誘導(dǎo)靶基因線粒體解偶聯(lián)蛋白2 (Uncoupling protein 2,UCP2)的表達(dá)，降低JNK，c-jun、H2O2的水平，同時(shí)增加線粒體GSH水平，進(jìn)而抑制APAP誘導(dǎo)的線粒體脂肪酸β氧化即氧化應(yīng)激水平，從而保護(hù)肝細(xì)胞[18]。但也有其他機(jī)制研究結(jié)果顯示APAP模型抗氧化基因的表達(dá)下調(diào)，氧化應(yīng)激增加，但PPARα及其靶基因Angptl4以及Mcad的表達(dá)沒有變化[19]。以上研究結(jié)果并不統(tǒng)一，PPARα在蛋白水平如何調(diào)節(jié)APAP肝損傷亦需進(jìn)一步研究證實(shí)。

PPARα蛋白活性受磷酸化調(diào)節(jié)，而ERK、p38-MAPK、PKA、PKC以及GSK3等均可調(diào)節(jié)PPARα磷酸化[20]。研究表明在APAP肝損傷中，NAPQI誘導(dǎo)早期氧化應(yīng)激，激活GSK3β以及MLK3，隨后通過MKK4/7激活JNK，激活的 pJNK隨后轉(zhuǎn)位入線粒體，引起線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換MPT，線粒體外膜腫脹裂解，促進(jìn)凋亡誘導(dǎo)因子AIF以及EndoG釋放，隨后EndoG入核，促進(jìn)肝損傷[21-22]。2016年Christian Trautwein等[23]證實(shí)在小鼠和人類急性及慢性毒性肝損傷模型以及小鼠APAP誘導(dǎo)急性肝損傷模型(APAP 500 mg·kg-1,IP,8h)中，肝細(xì)胞中JNK1和JNK2聯(lián)合作用，通過JNK-JunD依賴性通路、MAPK通路保護(hù)肝損傷。但是否上述激酶通過磷酸化PPARα發(fā)揮作用以及PPARα是否通過抑制線粒體氧化應(yīng)激干擾線粒體膜勢(shì)能，從而干擾JNK1以及JNK2的作用，最終調(diào)節(jié)APAP肝損傷仍舊需要進(jìn)一步研究來闡明。

2.3PPARα是否參與調(diào)節(jié)APAP肝臟炎癥尚無定論炎癥細(xì)胞明確參與了APAP肝炎癥損傷過程，但炎癥細(xì)胞中表達(dá)的PPARα是否參與APAP損傷過程目前尚不清楚。Holland,Ricky D等采用基因表達(dá)譜分析方法證實(shí)Vanin1在APAP誘導(dǎo)的肝臟炎癥中發(fā)揮重要作用[24]。隨后有研究發(fā)現(xiàn)Vanin1敲除C57BL/6鼠肝細(xì)胞增殖減少(PCNA陽性肝細(xì)胞減少)，F(xiàn)4/80陽性巨噬細(xì)胞浸潤減少和異常分布，同時(shí)炎癥細(xì)胞因子TNF-α、CCl2、iNOS以及IL-4的表達(dá)降低，肝臟局部Gr1以及CD11b陽性的炎性細(xì)胞減少，從而壞死細(xì)胞清除減少，APAP肝損傷加重。但是Vanin1對(duì)GSH含量、APAP代謝酶以及APAP生物解毒并沒有影響[25]。因此，Vanin1與炎癥細(xì)胞中表達(dá)的PPARα是否相關(guān)、PPARα是否參與APAP誘導(dǎo)的肝臟炎癥反應(yīng)尚無定論。

2.4PPARα參與APAP肝損傷晚期再生修復(fù)研究表明PPARα敲除鼠給予PHx手術(shù)后肝再生延遲，同時(shí)PPARα可以增加細(xì)胞增殖以及降低凋亡，促進(jìn)肝再生[26-27]，有助于損傷肝組織的修復(fù)。非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)小鼠APAP肝損傷模型研究結(jié)果也顯示NASH小鼠通過降低細(xì)胞分裂和組織修復(fù)，下調(diào)PPARα的表達(dá)從而促進(jìn)APAP肝損傷；給予非諾貝特飲食后減輕APAP肝損傷，說明PPARα通過促進(jìn)肝再生從而減輕NASH小鼠APAP肝損傷[28]。美國路易斯安那大學(xué)藥理毒理學(xué)系Mehendale,HM等于2003年在鏈脲霉素糖尿病鼠(STZ-DB)模型中也發(fā)現(xiàn)PPARα敲除小鼠的肝臟S期DNA合成以及PCNA水平明顯降低，說明其肝組織再生能力減弱。進(jìn)一步的基因芯片分析表明與PPARα null-DB鼠相比，WT-DB鼠細(xì)胞氧化/應(yīng)激/DNA損傷基因Gadd45、GADD153、EGR1、HO-1水平明顯下調(diào)，促進(jìn)APAP排泄的P450酶基因Cyp4a10,4a14上調(diào)。CyclinD1、 p38 MAPK、Cdk6的表達(dá)上調(diào)，NF-κB明顯激活，提示PPARα亦可能在參與干細(xì)胞再生修復(fù)的同時(shí)還參與轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié)[29]。

既往大量研究證實(shí)P38應(yīng)激激活蛋白激酶參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化、增殖、凋亡以及炎癥和應(yīng)激反應(yīng)；而P38可以磷酸化PPARα A/B結(jié)構(gòu)域中的Ser 6，12和/或21，活化PPARα；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PPARα敲除小鼠檢測(cè)p38 MAPK表達(dá)降低[30]。但是否APAP通過下調(diào)P38 AMPK，從而抑制PPARα磷酸化，抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)肝損傷仍需要進(jìn)一步研究。PPARα調(diào)節(jié)APAP肝再生的具體機(jī)制尚不十分清楚。

3 總結(jié)與展望

PPARα是關(guān)鍵的代謝調(diào)控因子，在轉(zhuǎn)錄水平作為核受體轉(zhuǎn)錄因子，具有調(diào)節(jié)脂肪酸代謝、細(xì)胞周期及炎癥基因表達(dá)的作用，在蛋白水平還可受磷酸化調(diào)節(jié)。由于目前應(yīng)用的是PPARα全基因敲除小鼠模型，可能存在機(jī)體脂質(zhì)代謝紊亂繼發(fā)氧化應(yīng)激的混雜因素存在，影響研究結(jié)果的準(zhǔn)確性，也造成目前相關(guān)研究結(jié)果不一致的原因之一。另外，由于PPARα激動(dòng)劑非諾貝特可引起急性以及持續(xù)的血肌酐水平的升高，且藥物蓄積引起肌病的風(fēng)險(xiǎn)較高，臨床需要更安全的靶向PPARα的藥物研發(fā)。未來希望能夠采用細(xì)胞特異性PPARα敲除模型，明確PPARα對(duì)于APAP肝損傷的特異性作用機(jī)制，幫助研發(fā)有效的靶向藥物，挽救并逆轉(zhuǎn)臨床藥物性肝損傷患者疾病進(jìn)程。