馬 雪，呂海英,2,*，李 進(jìn),2，張 玉，張 俊

（1.新疆特殊環(huán)境物種保護(hù)與調(diào)控生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830054；2.新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830054；3.干旱區(qū)植物逆境生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830054）

準(zhǔn)噶爾山楂（Crataegus songorica K. Koch.）是薔薇科（Rosaceae）山楂屬（Crataegus）落葉灌木或小喬木植物，作為新疆特有植物，僅分布于伊犁地區(qū)[1]。其果實(shí)富含花色苷[2]、熊果酸[3]、黃酮類物質(zhì)[4]等，極富營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，在食品、醫(yī)藥等方面日益受到重視。然而，準(zhǔn)噶爾山楂果實(shí)在提取花色苷后的殘?jiān)划?dāng)成廢棄物丟棄，而其中仍含有大量的多糖類物質(zhì)[5]，這不僅浪費(fèi)了大量的資源，而且污染了環(huán)境。研究發(fā)現(xiàn)多糖廣泛存在于微生物細(xì)胞壁和動(dòng)植物體內(nèi)[6]，參與機(jī)體各種生理代謝，具有抗氧化、抗衰老、抗癌、抗腫瘤、降血糖、降血脂、免疫調(diào)節(jié)[7-15]等多種生物活性，得到廣泛的應(yīng)用和發(fā)展。

目前關(guān)于山楂多糖的研究主要集中在提取、純化及結(jié)構(gòu)鑒定[16-22]方面，對(duì)于提取過(guò)花色苷的山楂殘?jiān)械亩嗵浅煞质欠袢跃哂猩锘钚怎r見(jiàn)報(bào)道。因此，為達(dá)到高效利用新疆特有植物準(zhǔn)噶爾山楂資源的目的，本實(shí)驗(yàn)以準(zhǔn)噶爾山楂殘?jiān)鼮樵?，通過(guò)超聲波輔助水提醇沉法[23]提取多糖，研究其對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠的影響，以期為準(zhǔn)噶爾山楂這一特色資源的綜合利用和開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)，從而使我國(guó)西北野生植物盡快向生產(chǎn)轉(zhuǎn)化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

準(zhǔn)噶爾山楂成熟果實(shí)，2015年9月采于新疆伊犁果子溝。取已提取過(guò)花色苷的準(zhǔn)噶爾山楂殘?jiān)?0 ℃烘干后磨粉，過(guò)篩，備用。

（20±2）g左右的清潔級(jí)昆明雄性小鼠90 只，由新疆維吾爾自治區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK（新）2011-0001。

總抗氧化能力（total antioxidative capability，T-AOC）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）檢測(cè)試劑盒 南京建成生物工程有限公司；D-半乳糖 美國(guó)Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2800型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海尤尼柯儀器有限公司；SHZ-III循環(huán)水多用真空泵 上海市滬西儀器廠；FA1104N電子天平、HHS-數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海精密科學(xué)儀器有限公司；JYD001-2007石蠟切片機(jī) 浙江金華益迪醫(yī)療設(shè)備廠；ZK-82A型真空干燥箱 上海實(shí)驗(yàn)儀器總廠；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；TDL-60-B臺(tái)式離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀儀器有限公司；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 準(zhǔn)噶爾山楂粗多糖的制備

5 g山楂粉末→90 ℃蒸餾水浸提60 min→減壓濃縮→雙氧水氧化脫色→Sevag試劑除蛋白→4 000 r/min離心10 min→上清液加5 倍體積的體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液→4 ℃靜置24 h→減壓抽濾分離絮狀沉淀→乙醇、丙酮溶液淋洗3 次→60 ℃恒溫箱烘干→得粗多糖。

1.3.2 樣品溶液的制備

取準(zhǔn)噶爾山楂粗多糖，配制質(zhì)量濃度為200、400、800 mg/mL[24]的多糖類化合物藥液，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 動(dòng)物分組及給藥

小鼠飼養(yǎng)溫度（24±2）℃，相對(duì)濕度45%～65%，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，根據(jù)體質(zhì)量將小鼠隨機(jī)分為6 組，每組15 只：正常對(duì)照組、D-半乳糖衰老模型組、多糖低劑量組、多糖中劑量組、多糖高劑量組、VE對(duì)照組。正常對(duì)照組每日上午10：00頸背部皮下注射1 mg/g mb生理鹽水，其余組注射1 mg/g mbD-半乳糖藥液，正常對(duì)照組、模型組給予等體積生理鹽水，VE對(duì)照組灌胃50 mg/mL VE藥液，多糖低、中、高劑量組分別灌胃200、400、800 mg/mL多糖類化合物藥液，普通飼料常規(guī)喂養(yǎng)建立D-半乳糖衰老模型。小鼠每周測(cè)量2 次體質(zhì)量，根據(jù)體質(zhì)量變化適當(dāng)增減給藥劑量[25]。

1.3.4 測(cè)試樣品的準(zhǔn)備

給藥8 周后，小鼠禁食不禁水12 h，稱量小鼠體質(zhì)量。摘除小鼠眼球，取得眼眶血，2 000 r/min離心10 min，取上層清液，-20 ℃保存?zhèn)溆肹26]。小鼠脫臼處死后，迅速取出肝、腦組織，按1∶9（m/V）加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.86%的生理鹽水，冰水浴下研磨，使組織勻漿化，3 000 r/min離心10～15 min，取上清液-20 ℃保存?zhèn)溆肹27]。

1.3.5 相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)

1.3.5.1 臟器指數(shù)

小鼠處死后，剖離胸腺和脾臟，稱取質(zhì)量，并按下式分別計(jì)算胸腺和脾臟指數(shù)。

1.3.5.2 抗氧化指標(biāo)測(cè)定

取小鼠血清及肝、腦組織勻漿上清液，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)所示測(cè)定MDA含量、T-AOC及GSH-Px活力。

1.3.5.3 肝、腦組織切片的制作及病理形態(tài)學(xué)觀察

小鼠解剖后迅速摘取肝、腦組織切塊為1.0 cm×1.0 cm×0.2 cm的薄片→放入中性福爾馬林固定液中固定24 h→分別經(jīng)75%（體積分?jǐn)?shù)，下同）、85%、95%、100%乙醇溶液脫水1 h→100%乙醇脫水30 min→放入二甲苯透明處理15 min→石蠟包埋組織塊→切片→烤片1 d→蘇木精染色液中染色10～30 min→流水沖洗約15 min→沖洗后將切片放入體積分?jǐn)?shù)1%鹽酸-乙醇溶液中褪色→流水中使其恢復(fù)藍(lán)色→將切片按次序分別放入50%、70%、80%乙醇中各3～5 min→體積分?jǐn)?shù)0.5%伊紅復(fù)染1 min→取出后將切片放入95%乙醇中洗去多余的紅色→放入無(wú)水乙醇中3～5 min→用吸水紙吸干多余的乙醇→將切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各3～5 min→用中性樹(shù)膠封片，并在顯微鏡下觀察病理變化[28]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

測(cè)定結(jié)果采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間差異顯著性比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），各組間比較用Duncan法。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理組小鼠體質(zhì)量變化

表1 小鼠體質(zhì)量變化趨勢(shì)（n＝15）Table1 Change in body mass of mice (n= 15)g

如表1所示，在實(shí)驗(yàn)前5 周，各組小鼠之間體質(zhì)量無(wú)顯著性差異（P＞0.05），從第6周開(kāi)始，除D-半乳糖衰老模型組小鼠體質(zhì)量逐漸減少，其余組小鼠體質(zhì)量均有所增加；第7周和第8周，除多糖低劑量組外，模型組與其他4 組小鼠體質(zhì)量之間均有顯著差異。頸背部皮下注射8 周后，模型組小鼠行動(dòng)遲緩，整日蜷成一團(tuán)，精神萎靡，毛色灰暗，形體瘦弱，呈現(xiàn)出明顯衰老體征。說(shuō)明D-半乳糖造成的衰老對(duì)小鼠體質(zhì)量的改變有一定程度的影響，準(zhǔn)噶爾山楂殘?jiān)械亩嗵菍?duì)衰老小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢有良好的改善作用。

2.2 多糖類化合物對(duì)D-半乳糖衰老模型小鼠肝組織T-AOC、GSH-Px活力和MDA含量的影響

正常機(jī)體內(nèi)的自由基生成和消亡處于動(dòng)態(tài)平衡中，當(dāng)平衡失調(diào)，體內(nèi)積累的大量自由基會(huì)使機(jī)體產(chǎn)生衰老癥狀，目前由于機(jī)體衰老引起的肝硬化已成為人類第二大健康殺手，因此肝組織的抗氧化作用已成為檢測(cè)機(jī)體衰老程度的重要指標(biāo)[29]。

圖1 體內(nèi)肝組織抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Effect of the polysaccharides on T-AOC, GSH-Px activity and MDA content in liver

由圖1可以看出，隨著多糖劑量的增加，小鼠肝組織的抗氧化能力逐漸增強(qiáng)。與正常對(duì)照組相比，模型組的T-AOC極顯著降低（P＜0.01），GSH-Px活力顯著降低（P＜0.05），MDA含量極顯著升高（P＜0.01），說(shuō)明造模成功[30]。與模型組相比，準(zhǔn)噶爾山楂多糖中、高劑量組的T-AOC極顯著增強(qiáng)（P＜0.01），GSH-Px活力顯著升高（P＜0.05），MDA含量顯著降低（P＜0.05）。說(shuō)明準(zhǔn)噶爾山楂殘?jiān)械亩嗵悄苡行г鰪?qiáng)小鼠的肝組織抗氧化能力。

2.3 多糖類化合物對(duì)D-半乳糖衰老模型小鼠腦組織T-AOC、GSH-Px活力和MDA含量的影響

脂質(zhì)過(guò)氧化損傷以及抗氧化酶在腦組織老化中有著重要的意義，腦組織的老化會(huì)影響腦的記憶功能，并出現(xiàn)學(xué)習(xí)功能障礙，腦損傷進(jìn)一步發(fā)展成為阿爾茨海默病，所以腦組織中的抗氧化酶活力是機(jī)體衰老程度的又一重要指標(biāo)[31]。

圖2 體內(nèi)腦組織抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Effect of the polysaccharides on T-AOC, GSH-Px activity and MDA content in brain

由圖2可以看出，與正常對(duì)照組相比，模型組T-AOC有所降低，但差異不顯著（P＞0.05），MDA含量顯著升高（P＜0.05），GSH-Px活力極顯著降低（P＜0.01）。與模型組相比，多糖高劑量組小鼠腦組織T-AOC和MDA含量均極顯著變化（P＜0.01）。說(shuō)明準(zhǔn)噶爾山楂殘?jiān)械亩嗵强捎行岣逥-半乳糖致衰老小鼠腦組織中T-AOC、GSH-Px活力，同時(shí)能夠降低腦組織中的MDA含量，以清除體內(nèi)的自由基等氧化性物質(zhì)，對(duì)于D-半乳糖造成的小鼠衰老現(xiàn)象具有一定的延緩作用。

2.4 多糖類化合物對(duì)D-半乳糖衰老模型小鼠血清T-AOC、GSH-Px活力和MDA含量的影響

由圖3可以看出，不同劑量的多糖對(duì)D-半乳糖造成的小鼠衰老情況具有不同程度的改善作用。與正常對(duì)照組相比，模型組血清中T-AOC顯著降低（P＜0.05），GSH-Px水平極顯著降低（P＜0.01），MDA含量顯著升高（P＜0.05）。與模型組相比，多糖中、高劑量組T-AOC和GSH-Px活力均顯著增加（P＜0.05）；多糖高劑量組MDA含量極顯著降低（P＜0.01）。說(shuō)明準(zhǔn)噶爾山楂多糖類物質(zhì)的添加可以改善由于D-半乳糖造成的衰老小鼠血清中T-AOC、GSH-Px活力降低，并一定程度上抑制血清中MDA含量的升高，進(jìn)一步起到抗機(jī)體氧化的作用。

圖3 體內(nèi)血清抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Effect of the polysaccharides on T-AOC, GSH-Px activity and MDA content in serum

2.5 多糖類化合物對(duì)D-半乳糖衰老模型小鼠胸腺和脾臟指數(shù)的影響

脾臟和胸腺是體內(nèi)重要的免疫器官，當(dāng)機(jī)體衰老時(shí)，免疫器官萎縮從而導(dǎo)致免疫功能降低。脾臟是機(jī)體最大的周圍淋巴器官，不僅是機(jī)體質(zhì)量要的免疫應(yīng)答場(chǎng)所，同時(shí)還擔(dān)任著機(jī)體重要的造血功能。胸腺質(zhì)量及指數(shù)是胸腺在機(jī)體內(nèi)大體形態(tài)的重要指標(biāo)，因此胸腺和脾臟的衰老和萎縮間接反映了機(jī)體免疫系統(tǒng)的情況[32]。

從圖4可以看出，與正常組相比，模型組胸腺和脾臟指數(shù)變化不顯著（P＞0.05）；與模型組相比，不同劑量多糖組和VE對(duì)照組的小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均有不同程度的增加，但差異均不顯著（P＞0.05）。說(shuō)明準(zhǔn)噶爾山楂多糖不會(huì)對(duì)動(dòng)物的內(nèi)臟造成損傷。

圖4 多糖對(duì)衰老小鼠胸腺和脾臟指數(shù)的影響Fig.4 Effect of the polysaccharides on thymus and spleen indexes of aging mice

2.6 肝臟病理學(xué)切片觀察

圖5 多糖對(duì)衰老小鼠肝組織的影響（×200）Fig.5 Effect of the polysaccharides on liver tissues in aging mice observed by HE staining (× 200)

由圖5可知，正常對(duì)照組（圖5A）肝小葉及肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，肝索排列整齊，肝竇正常。模型組（圖5B）肝細(xì)胞及胞核體積縮小，染色程度增強(qiáng)，肝細(xì)胞之間連接松散，部分可見(jiàn)輕度脂肪變性。VE對(duì)照組（圖5C）肝細(xì)胞及胞核體積較衰老組增大，少量肝細(xì)胞胞漿內(nèi)可見(jiàn)脂滴顆粒，肝索較寬，部分肝細(xì)胞可見(jiàn)雙核。多糖低（圖5D）、中劑量組（圖5E）肝細(xì)胞及胞核體積增大，部分肝細(xì)胞可見(jiàn)脂肪變性，尤以肝小葉周邊為重。多糖高劑量組（圖5F）肝細(xì)胞及細(xì)胞核結(jié)構(gòu)、大小及其染色程度未見(jiàn)明顯異常，個(gè)別肝細(xì)胞胞漿內(nèi)可見(jiàn)脂滴顆粒，肝索結(jié)構(gòu)無(wú)明顯異常。說(shuō)明準(zhǔn)噶爾山楂殘?jiān)械亩嗵菍?duì)D-半乳糖引起的衰老小鼠肝損傷有一定抑制作用。

2.7 海馬切片病理學(xué)觀察

圖6 多糖對(duì)衰老小鼠腦組織的影響（×400）Fig.6 Effect of the polysaccharides on brain tissues in aging mice observed by HE staining (× 400)

由圖6可知，正常對(duì)照組（圖6A）海馬神經(jīng)元數(shù)量較多，神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰完整，大小均勻且列緊密整齊，細(xì)胞胞漿豐富，核仁清晰。模型組（圖6B）神經(jīng)元數(shù)量減少，排列松散紊亂，邊界不清，胞漿少，細(xì)胞核固縮，少數(shù)神經(jīng)細(xì)胞變性壞死，部分錐體細(xì)胞形態(tài)異常。VE對(duì)照組（圖6C）神經(jīng)元數(shù)目形態(tài)正常，排列較為緊密，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，變性壞死較少。多糖低劑量組（圖6D）神經(jīng)元數(shù)量較少，排列疏松紊亂，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，有少量細(xì)胞核固縮。多糖中劑量組（圖6E）神經(jīng)元數(shù)量較低劑量組多，排列基本正常，邊界不清。多糖高劑量組（圖6F）神經(jīng)元數(shù)量較多，排列緊密，邊界清晰，細(xì)胞核固縮少見(jiàn)。說(shuō)明準(zhǔn)噶爾山楂殘?jiān)械亩嗵菍?duì)D-半乳糖致衰老小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元損傷有一定抑制作用。

3 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)準(zhǔn)噶爾山楂殘?jiān)械亩嗵沁M(jìn)行粗提取后，給D-半乳糖衰老小鼠灌胃多糖物質(zhì)，分析其對(duì)小鼠體內(nèi)抗氧化酶活力和肝組織、海馬區(qū)神經(jīng)元的影響。結(jié)果表明準(zhǔn)噶爾山楂殘?jiān)械亩嗵强梢允笵-半乳糖衰老模型組小鼠的肝、腦組織和血清中GSH-Px活力、T-AOC上升，抑制MDA含量上升，并使模型組小鼠體質(zhì)量上升。從細(xì)胞形態(tài)上看，與模型組相比，多糖中、高劑量組肝細(xì)胞和海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)明顯好轉(zhuǎn)，神經(jīng)元數(shù)量增加，細(xì)胞間隙變小，細(xì)胞核固縮情況減少，排列較模型組整齊，說(shuō)明提取過(guò)花色苷后的準(zhǔn)噶爾山楂殘?jiān)械亩嗵浅煞謱?duì)D-半乳糖引起的小鼠衰老具有良好的延緩作用，對(duì)于預(yù)防氧化損傷具有明顯的促進(jìn)作用，其綜合利用和開(kāi)發(fā)值得重視。