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        準(zhǔn)噶爾山楂殘?jiān)嗵菍?duì)D-半乳糖衰老模型小鼠的影響

        2018-12-29 08:30:24呂海英
        食品科學(xué) 2018年23期
        關(guān)鍵詞:小鼠劑量模型

        馬 雪,呂海英,2,*,李 進(jìn),2,張 玉,張 俊

        (1.新疆特殊環(huán)境物種保護(hù)與調(diào)控生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,新疆 烏魯木齊 830054;2.新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830054;3.干旱區(qū)植物逆境生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆 烏魯木齊 830054)

        準(zhǔn)噶爾山楂(Crataegus songorica K. Koch.)是薔薇科(Rosaceae)山楂屬(Crataegus)落葉灌木或小喬木植物,作為新疆特有植物,僅分布于伊犁地區(qū)[1]。其果實(shí)富含花色苷[2]、熊果酸[3]、黃酮類物質(zhì)[4]等,極富營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,在食品、醫(yī)藥等方面日益受到重視。然而,準(zhǔn)噶爾山楂果實(shí)在提取花色苷后的殘?jiān)划?dāng)成廢棄物丟棄,而其中仍含有大量的多糖類物質(zhì)[5],這不僅浪費(fèi)了大量的資源,而且污染了環(huán)境。研究發(fā)現(xiàn)多糖廣泛存在于微生物細(xì)胞壁和動(dòng)植物體內(nèi)[6],參與機(jī)體各種生理代謝,具有抗氧化、抗衰老、抗癌、抗腫瘤、降血糖、降血脂、免疫調(diào)節(jié)[7-15]等多種生物活性,得到廣泛的應(yīng)用和發(fā)展。

        目前關(guān)于山楂多糖的研究主要集中在提取、純化及結(jié)構(gòu)鑒定[16-22]方面,對(duì)于提取過(guò)花色苷的山楂殘?jiān)械亩嗵浅煞质欠袢跃哂猩锘钚怎r見(jiàn)報(bào)道。因此,為達(dá)到高效利用新疆特有植物準(zhǔn)噶爾山楂資源的目的,本實(shí)驗(yàn)以準(zhǔn)噶爾山楂殘?jiān)鼮樵?,通過(guò)超聲波輔助水提醇沉法[23]提取多糖,研究其對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠的影響,以期為準(zhǔn)噶爾山楂這一特色資源的綜合利用和開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù),從而使我國(guó)西北野生植物盡快向生產(chǎn)轉(zhuǎn)化。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        準(zhǔn)噶爾山楂成熟果實(shí),2015年9月采于新疆伊犁果子溝。取已提取過(guò)花色苷的準(zhǔn)噶爾山楂殘?jiān)?0 ℃烘干后磨粉,過(guò)篩,備用。

        (20±2)g左右的清潔級(jí)昆明雄性小鼠90 只,由新疆維吾爾自治區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證號(hào):SCXK(新)2011-0001。

        總抗氧化能力(total antioxidative capability,T-AOC)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)檢測(cè)試劑盒 南京建成生物工程有限公司;D-半乳糖 美國(guó)Sigma公司;其他試劑均為分析純。

        1.2 儀器與設(shè)備

        UV-2800型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海尤尼柯儀器有限公司;SHZ-III循環(huán)水多用真空泵 上海市滬西儀器廠;FA1104N電子天平、HHS-數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海精密科學(xué)儀器有限公司;JYD001-2007石蠟切片機(jī) 浙江金華益迪醫(yī)療設(shè)備廠;ZK-82A型真空干燥箱 上海實(shí)驗(yàn)儀器總廠;RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;TDL-60-B臺(tái)式離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀儀器有限公司;KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 準(zhǔn)噶爾山楂粗多糖的制備

        5 g山楂粉末→90 ℃蒸餾水浸提60 min→減壓濃縮→雙氧水氧化脫色→Sevag試劑除蛋白→4 000 r/min離心10 min→上清液加5 倍體積的體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液→4 ℃靜置24 h→減壓抽濾分離絮狀沉淀→乙醇、丙酮溶液淋洗3 次→60 ℃恒溫箱烘干→得粗多糖。

        1.3.2 樣品溶液的制備

        取準(zhǔn)噶爾山楂粗多糖,配制質(zhì)量濃度為200、400、800 mg/mL[24]的多糖類化合物藥液,于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.3.3 動(dòng)物分組及給藥

        小鼠飼養(yǎng)溫度(24±2)℃,相對(duì)濕度45%~65%,適應(yīng)性喂養(yǎng)一周,根據(jù)體質(zhì)量將小鼠隨機(jī)分為6 組,每組15 只:正常對(duì)照組、D-半乳糖衰老模型組、多糖低劑量組、多糖中劑量組、多糖高劑量組、VE對(duì)照組。正常對(duì)照組每日上午10:00頸背部皮下注射1 mg/g mb生理鹽水,其余組注射1 mg/g mbD-半乳糖藥液,正常對(duì)照組、模型組給予等體積生理鹽水,VE對(duì)照組灌胃50 mg/mL VE藥液,多糖低、中、高劑量組分別灌胃200、400、800 mg/mL多糖類化合物藥液,普通飼料常規(guī)喂養(yǎng)建立D-半乳糖衰老模型。小鼠每周測(cè)量2 次體質(zhì)量,根據(jù)體質(zhì)量變化適當(dāng)增減給藥劑量[25]。

        1.3.4 測(cè)試樣品的準(zhǔn)備

        給藥8 周后,小鼠禁食不禁水12 h,稱量小鼠體質(zhì)量。摘除小鼠眼球,取得眼眶血,2 000 r/min離心10 min,取上層清液,-20 ℃保存?zhèn)溆肹26]。小鼠脫臼處死后,迅速取出肝、腦組織,按1∶9(m/V)加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.86%的生理鹽水,冰水浴下研磨,使組織勻漿化,3 000 r/min離心10~15 min,取上清液-20 ℃保存?zhèn)溆肹27]。

        1.3.5 相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)

        1.3.5.1 臟器指數(shù)

        小鼠處死后,剖離胸腺和脾臟,稱取質(zhì)量,并按下式分別計(jì)算胸腺和脾臟指數(shù)。

        1.3.5.2 抗氧化指標(biāo)測(cè)定

        取小鼠血清及肝、腦組織勻漿上清液,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)所示測(cè)定MDA含量、T-AOC及GSH-Px活力。

        1.3.5.3 肝、腦組織切片的制作及病理形態(tài)學(xué)觀察

        小鼠解剖后迅速摘取肝、腦組織切塊為1.0 cm×1.0 cm×0.2 cm的薄片→放入中性福爾馬林固定液中固定24 h→分別經(jīng)75%(體積分?jǐn)?shù),下同)、85%、95%、100%乙醇溶液脫水1 h→100%乙醇脫水30 min→放入二甲苯透明處理15 min→石蠟包埋組織塊→切片→烤片1 d→蘇木精染色液中染色10~30 min→流水沖洗約15 min→沖洗后將切片放入體積分?jǐn)?shù)1%鹽酸-乙醇溶液中褪色→流水中使其恢復(fù)藍(lán)色→將切片按次序分別放入50%、70%、80%乙醇中各3~5 min→體積分?jǐn)?shù)0.5%伊紅復(fù)染1 min→取出后將切片放入95%乙醇中洗去多余的紅色→放入無(wú)水乙醇中3~5 min→用吸水紙吸干多余的乙醇→將切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各3~5 min→用中性樹(shù)膠封片,并在顯微鏡下觀察病理變化[28]。

        1.4 數(shù)據(jù)處理

        測(cè)定結(jié)果采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間差異顯著性比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),各組間比較用Duncan法。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 不同處理組小鼠體質(zhì)量變化

        表1 小鼠體質(zhì)量變化趨勢(shì)(n=15)Table1 Change in body mass of mice (n= 15)g

        如表1所示,在實(shí)驗(yàn)前5 周,各組小鼠之間體質(zhì)量無(wú)顯著性差異(P>0.05),從第6周開(kāi)始,除D-半乳糖衰老模型組小鼠體質(zhì)量逐漸減少,其余組小鼠體質(zhì)量均有所增加;第7周和第8周,除多糖低劑量組外,模型組與其他4 組小鼠體質(zhì)量之間均有顯著差異。頸背部皮下注射8 周后,模型組小鼠行動(dòng)遲緩,整日蜷成一團(tuán),精神萎靡,毛色灰暗,形體瘦弱,呈現(xiàn)出明顯衰老體征。說(shuō)明D-半乳糖造成的衰老對(duì)小鼠體質(zhì)量的改變有一定程度的影響,準(zhǔn)噶爾山楂殘?jiān)械亩嗵菍?duì)衰老小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢有良好的改善作用。

        2.2 多糖類化合物對(duì)D-半乳糖衰老模型小鼠肝組織T-AOC、GSH-Px活力和MDA含量的影響

        正常機(jī)體內(nèi)的自由基生成和消亡處于動(dòng)態(tài)平衡中,當(dāng)平衡失調(diào),體內(nèi)積累的大量自由基會(huì)使機(jī)體產(chǎn)生衰老癥狀,目前由于機(jī)體衰老引起的肝硬化已成為人類第二大健康殺手,因此肝組織的抗氧化作用已成為檢測(cè)機(jī)體衰老程度的重要指標(biāo)[29]。

        圖1 體內(nèi)肝組織抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Effect of the polysaccharides on T-AOC, GSH-Px activity and MDA content in liver

        由圖1可以看出,隨著多糖劑量的增加,小鼠肝組織的抗氧化能力逐漸增強(qiáng)。與正常對(duì)照組相比,模型組的T-AOC極顯著降低(P<0.01),GSH-Px活力顯著降低(P<0.05),MDA含量極顯著升高(P<0.01),說(shuō)明造模成功[30]。與模型組相比,準(zhǔn)噶爾山楂多糖中、高劑量組的T-AOC極顯著增強(qiáng)(P<0.01),GSH-Px活力顯著升高(P<0.05),MDA含量顯著降低(P<0.05)。說(shuō)明準(zhǔn)噶爾山楂殘?jiān)械亩嗵悄苡行г鰪?qiáng)小鼠的肝組織抗氧化能力。

        2.3 多糖類化合物對(duì)D-半乳糖衰老模型小鼠腦組織T-AOC、GSH-Px活力和MDA含量的影響

        脂質(zhì)過(guò)氧化損傷以及抗氧化酶在腦組織老化中有著重要的意義,腦組織的老化會(huì)影響腦的記憶功能,并出現(xiàn)學(xué)習(xí)功能障礙,腦損傷進(jìn)一步發(fā)展成為阿爾茨海默病,所以腦組織中的抗氧化酶活力是機(jī)體衰老程度的又一重要指標(biāo)[31]。

        圖2 體內(nèi)腦組織抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Effect of the polysaccharides on T-AOC, GSH-Px activity and MDA content in brain

        由圖2可以看出,與正常對(duì)照組相比,模型組T-AOC有所降低,但差異不顯著(P>0.05),MDA含量顯著升高(P<0.05),GSH-Px活力極顯著降低(P<0.01)。與模型組相比,多糖高劑量組小鼠腦組織T-AOC和MDA含量均極顯著變化(P<0.01)。說(shuō)明準(zhǔn)噶爾山楂殘?jiān)械亩嗵强捎行岣逥-半乳糖致衰老小鼠腦組織中T-AOC、GSH-Px活力,同時(shí)能夠降低腦組織中的MDA含量,以清除體內(nèi)的自由基等氧化性物質(zhì),對(duì)于D-半乳糖造成的小鼠衰老現(xiàn)象具有一定的延緩作用。

        2.4 多糖類化合物對(duì)D-半乳糖衰老模型小鼠血清T-AOC、GSH-Px活力和MDA含量的影響

        由圖3可以看出,不同劑量的多糖對(duì)D-半乳糖造成的小鼠衰老情況具有不同程度的改善作用。與正常對(duì)照組相比,模型組血清中T-AOC顯著降低(P<0.05),GSH-Px水平極顯著降低(P<0.01),MDA含量顯著升高(P<0.05)。與模型組相比,多糖中、高劑量組T-AOC和GSH-Px活力均顯著增加(P<0.05);多糖高劑量組MDA含量極顯著降低(P<0.01)。說(shuō)明準(zhǔn)噶爾山楂多糖類物質(zhì)的添加可以改善由于D-半乳糖造成的衰老小鼠血清中T-AOC、GSH-Px活力降低,并一定程度上抑制血清中MDA含量的升高,進(jìn)一步起到抗機(jī)體氧化的作用。

        圖3 體內(nèi)血清抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Effect of the polysaccharides on T-AOC, GSH-Px activity and MDA content in serum

        2.5 多糖類化合物對(duì)D-半乳糖衰老模型小鼠胸腺和脾臟指數(shù)的影響

        脾臟和胸腺是體內(nèi)重要的免疫器官,當(dāng)機(jī)體衰老時(shí),免疫器官萎縮從而導(dǎo)致免疫功能降低。脾臟是機(jī)體最大的周圍淋巴器官,不僅是機(jī)體質(zhì)量要的免疫應(yīng)答場(chǎng)所,同時(shí)還擔(dān)任著機(jī)體重要的造血功能。胸腺質(zhì)量及指數(shù)是胸腺在機(jī)體內(nèi)大體形態(tài)的重要指標(biāo),因此胸腺和脾臟的衰老和萎縮間接反映了機(jī)體免疫系統(tǒng)的情況[32]。

        從圖4可以看出,與正常組相比,模型組胸腺和脾臟指數(shù)變化不顯著(P>0.05);與模型組相比,不同劑量多糖組和VE對(duì)照組的小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均有不同程度的增加,但差異均不顯著(P>0.05)。說(shuō)明準(zhǔn)噶爾山楂多糖不會(huì)對(duì)動(dòng)物的內(nèi)臟造成損傷。

        圖4 多糖對(duì)衰老小鼠胸腺和脾臟指數(shù)的影響Fig.4 Effect of the polysaccharides on thymus and spleen indexes of aging mice

        2.6 肝臟病理學(xué)切片觀察

        圖5 多糖對(duì)衰老小鼠肝組織的影響(×200)Fig.5 Effect of the polysaccharides on liver tissues in aging mice observed by HE staining (× 200)

        由圖5可知,正常對(duì)照組(圖5A)肝小葉及肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常,肝索排列整齊,肝竇正常。模型組(圖5B)肝細(xì)胞及胞核體積縮小,染色程度增強(qiáng),肝細(xì)胞之間連接松散,部分可見(jiàn)輕度脂肪變性。VE對(duì)照組(圖5C)肝細(xì)胞及胞核體積較衰老組增大,少量肝細(xì)胞胞漿內(nèi)可見(jiàn)脂滴顆粒,肝索較寬,部分肝細(xì)胞可見(jiàn)雙核。多糖低(圖5D)、中劑量組(圖5E)肝細(xì)胞及胞核體積增大,部分肝細(xì)胞可見(jiàn)脂肪變性,尤以肝小葉周邊為重。多糖高劑量組(圖5F)肝細(xì)胞及細(xì)胞核結(jié)構(gòu)、大小及其染色程度未見(jiàn)明顯異常,個(gè)別肝細(xì)胞胞漿內(nèi)可見(jiàn)脂滴顆粒,肝索結(jié)構(gòu)無(wú)明顯異常。說(shuō)明準(zhǔn)噶爾山楂殘?jiān)械亩嗵菍?duì)D-半乳糖引起的衰老小鼠肝損傷有一定抑制作用。

        2.7 海馬切片病理學(xué)觀察

        圖6 多糖對(duì)衰老小鼠腦組織的影響(×400)Fig.6 Effect of the polysaccharides on brain tissues in aging mice observed by HE staining (× 400)

        由圖6可知,正常對(duì)照組(圖6A)海馬神經(jīng)元數(shù)量較多,神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰完整,大小均勻且列緊密整齊,細(xì)胞胞漿豐富,核仁清晰。模型組(圖6B)神經(jīng)元數(shù)量減少,排列松散紊亂,邊界不清,胞漿少,細(xì)胞核固縮,少數(shù)神經(jīng)細(xì)胞變性壞死,部分錐體細(xì)胞形態(tài)異常。VE對(duì)照組(圖6C)神經(jīng)元數(shù)目形態(tài)正常,排列較為緊密,細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰,變性壞死較少。多糖低劑量組(圖6D)神經(jīng)元數(shù)量較少,排列疏松紊亂,細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,有少量細(xì)胞核固縮。多糖中劑量組(圖6E)神經(jīng)元數(shù)量較低劑量組多,排列基本正常,邊界不清。多糖高劑量組(圖6F)神經(jīng)元數(shù)量較多,排列緊密,邊界清晰,細(xì)胞核固縮少見(jiàn)。說(shuō)明準(zhǔn)噶爾山楂殘?jiān)械亩嗵菍?duì)D-半乳糖致衰老小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元損傷有一定抑制作用。

        3 結(jié) 論

        通過(guò)對(duì)準(zhǔn)噶爾山楂殘?jiān)械亩嗵沁M(jìn)行粗提取后,給D-半乳糖衰老小鼠灌胃多糖物質(zhì),分析其對(duì)小鼠體內(nèi)抗氧化酶活力和肝組織、海馬區(qū)神經(jīng)元的影響。結(jié)果表明準(zhǔn)噶爾山楂殘?jiān)械亩嗵强梢允笵-半乳糖衰老模型組小鼠的肝、腦組織和血清中GSH-Px活力、T-AOC上升,抑制MDA含量上升,并使模型組小鼠體質(zhì)量上升。從細(xì)胞形態(tài)上看,與模型組相比,多糖中、高劑量組肝細(xì)胞和海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)明顯好轉(zhuǎn),神經(jīng)元數(shù)量增加,細(xì)胞間隙變小,細(xì)胞核固縮情況減少,排列較模型組整齊,說(shuō)明提取過(guò)花色苷后的準(zhǔn)噶爾山楂殘?jiān)械亩嗵浅煞謱?duì)D-半乳糖引起的小鼠衰老具有良好的延緩作用,對(duì)于預(yù)防氧化損傷具有明顯的促進(jìn)作用,其綜合利用和開(kāi)發(fā)值得重視。

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