霍嘉穎，孫寶國(guó)，鄭福平，孫金沅，孫嘯濤，李賀賀，羅雪蓮，黃明泉,*

（1.北京工商大學(xué)食品學(xué)院，食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康北京高精尖創(chuàng)新中心，中國(guó)輕工業(yè)酒類品質(zhì)與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100048；2.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所，北京 102206）

活性氧（reactive oxygen species，ROS）是超氧化合物陰離子自由基、羥自由基、過氧化氫、單線態(tài)氧、過氧化脂質(zhì)和次氯酸鹽等物質(zhì)的總稱。低濃度的ROS在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)和防御病原體方面起著不可或缺的作用，而較高濃度的ROS會(huì)導(dǎo)致一些普遍的疾病和病癥，包括心血管疾病、關(guān)節(jié)炎、癌癥、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、局部缺血、免疫力和內(nèi)分泌功能障礙等[1-4]。為了防止機(jī)體的氧化損傷，可以通過機(jī)體內(nèi)酶抗氧化系統(tǒng)（谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT））和非酶抗氧化系統(tǒng)（VC、VE、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、類胡蘿卜素等還原性物質(zhì)）有效清除ROS[5-6]。除了細(xì)胞自身調(diào)節(jié)之外，來(lái)自食物中的一些抗氧化活性物質(zhì)也可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)這兩種抗氧化系統(tǒng)或者抑制自由基的產(chǎn)生起到防止ROS積聚或?qū)⑵鋸南到y(tǒng)中消除的作用[7]。

許多動(dòng)物和植物都富含天然存在的一些抗氧化劑，而目前動(dòng)物蛋白作為抗氧化活性肽的重要來(lái)源已經(jīng)被廣泛研究，例如在鵝蛋[8]、草魚[9]、泥鰍[10]等動(dòng)物性蛋白來(lái)源中已發(fā)現(xiàn)了具有抗氧化活性的多肽。在天然植物中也存在許多具有抗氧化活性的物質(zhì)，包括類黃酮、α-生育酚、VE、VC、甘露醇及GSH等，這些物質(zhì)既可直接與ROS反應(yīng)而將其還原，又可作為酶的底物在ROS的清除中發(fā)揮重要作用[11-12]。另外，在酒類飲料中也有很多關(guān)于抗氧化活性肽的研究。例如，2015年王正元等[13]以黍米黃酒為研究對(duì)象，分離純化得到了氨基酸序列為Cys-Gly-Ser-Pro的四肽，該四肽具有自由基清除功能，可以起到一定的抗氧化作用。2007年，Alcaide-Hidalgo等[14]從葡萄酒中分離出的酵母多肽，并對(duì)酵母多肽的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性和抗氧化活性（氧化自由基吸收能力法）進(jìn)行了考察。但是，關(guān)于白酒中多肽的研究很少。2014年，Zhang Rong等[15]采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分離結(jié)合四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜（quadrupole-time-of-flight mass spectrometer，Q-TOF-MS）與核磁共振檢測(cè)技術(shù)，分析鑒定出白酒體系中非揮發(fā)性特征成分地衣素，并剖析了地衣素影響小分子香氣化合物揮發(fā)性的作用機(jī)制。2016年，吳繼紅等[16]在白酒中發(fā)現(xiàn)一種多肽，具有明顯的抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶活性的作用。而關(guān)于白酒中的抗氧化肽，目前僅有少量文獻(xiàn)有所報(bào)道，有研究發(fā)現(xiàn)來(lái)自芝麻香型白酒中的一種四肽具有細(xì)胞內(nèi)抗氧化活性，可以對(duì)2,2’-偶氮雙（2-甲基丙脒）二鹽酸鹽（2,2’-azobis(2-methylpropanimidamidine) dihydrochloride，AAPH）誘導(dǎo)的人體肝癌HepG2細(xì)胞的氧化損傷起防護(hù)作用[17]。

抗氧化活性物質(zhì)的評(píng)價(jià)方法目前主要有細(xì)胞模型法、體內(nèi)法和體外法3 種：體外法是一種常用的方法，具有實(shí)驗(yàn)周期短、成本低、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，但不能反映細(xì)胞內(nèi)真實(shí)的生理?xiàng)l件[18]；體內(nèi)法（動(dòng)物模型和臨床研究）是評(píng)估樣品抗氧化作用較好的方法，但其樣品用量大、成本高、實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)；而采用細(xì)胞模型法評(píng)價(jià)物質(zhì)的抗氧化活性，既可以符合機(jī)體真實(shí)的生理?xiàng)l件，同時(shí)也克服了動(dòng)物模型成本高、實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)，使得研究更經(jīng)濟(jì)、快捷[7,19]。

本研究主要通過HPLC-Q-TOF-MS鑒定了從芝麻香型白酒中分離出來(lái)的一種三肽，同時(shí)利用AAPH誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞氧化損傷模型探究其細(xì)胞內(nèi)抗氧化活性，為中國(guó)白酒的健康發(fā)展提供理論支持，也為今后健康白酒的研發(fā)提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

芝麻香型白酒原漿酒（乙醇體積分?jǐn)?shù)65%） 山東扳倒井股份有限公司；HepG2細(xì)胞 中國(guó)疾病預(yù)防控制中心；Arg-Asn-His（RNH）合成肽標(biāo)準(zhǔn)品（純度大于95%）吉爾生化（上海）有限公司；乙腈（色譜純，純度大于99%）賽默飛世爾（中國(guó)）公司；甲酸（色譜純，純度大于99%）北京迪科馬科技有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、抗生素、AAPH 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；微量丙二醛（malondialdehyde，MDA）、SOD、CAT、GSH-Px和總蛋白檢測(cè)試劑盒 南京建成生物技術(shù)研究所；ROS、GSH測(cè)定試劑盒 碧云天生物技術(shù)研究所；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8） 日本Dojindo公司；Dulbecco’s modified Eagle medium（DMEM）培養(yǎng)基 美國(guó)Corning公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS） 上海源葉生物科技有限公司；無(wú)菌去離子水 北京索萊寶科技有限公司；胰蛋白酶美國(guó)Gibco公司；RIPA細(xì)胞溶解緩沖液 北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HPLC-Q-TOF-MS（HPLC型號(hào)為1290，Q-TOF型號(hào)為6530）、ZORBAX SB-C18反相色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）、100 μL自動(dòng)進(jìn)樣針、2.0 mL進(jìn)樣瓶 美國(guó)Agilent公司；CCL-170B-8細(xì)胞培養(yǎng)箱 新加坡ESCO科技有限公司；SpectraMax M2e多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)Molecular Devices公司；TGL-20B-C高速臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；熒光顯微鏡日本Nikon公司；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；DKB-501A超級(jí)恒溫水槽 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；FD-1B-80型冷凍干燥機(jī) 南京普森儀器設(shè)備有限公司；漩渦混合器 北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；SL-N電子天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；1.0 mL和200、100、10 μL移液槍 北京吉爾森科技有限公司；50～300 μL電動(dòng)排槍 德國(guó)Eppendorf公司；Costa 96 孔板 美國(guó)Corning公司。

1.3 方法

1.3.1 白酒前處理

量取5 L酒樣，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在50 ℃、-0.1 MPa條件下濃縮至50 mL，殘留物用重蒸的乙酸乙酯萃取3 次，每次50 mL，將萃取后的水相凍干后用1.0 mL超純水復(fù)溶，置于-20 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 白酒中多肽的定性方法

將1.3.1節(jié)中處理的酒樣過0.45 μm濾膜后，置于1.5 mL進(jìn)樣瓶中，采用HPLC-Q-TOF-MS鑒定該樣品中的多肽，多肽的氨基酸序列通過從頭測(cè)序算法（De novo）進(jìn)行解析。

1.3.2.1 色譜條件

流動(dòng)相A：超純水（含體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸溶液），流動(dòng)相B：乙腈（含體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸溶液）；洗脫程序：0～3 min，92%流動(dòng)相A；3～15 min，92%～20%流動(dòng)相A；15～20 min，20%～8%流動(dòng)相A；20～25 min，8%～92%流動(dòng)相A；25～30 min，92%流動(dòng)相A；流速：0.5 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：214 nm；柱溫：室溫（25 ℃）；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3.2.2 MS條件

TOF模式：離子源：電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI）；掃描模式：正離子模式；干燥氣溫度：300 ℃；流量：8 L/min；噴霧器壓力：241.32 kPa；毛細(xì)管電壓：4 000 V；離子掃描范圍：m/z 100～1 000；采集速率：4 張質(zhì)譜圖/s；裂解電壓：120 V；碰撞池電壓：0 V。

MS模式：離子源：ESI；掃描模式：正離子模式；干燥氣溫度：300 ℃，流量：8 L/min；鞘氣溫度：350 ℃，流量：12 L/min；噴霧器壓力：241.32 kPa；毛細(xì)管電壓：4 000 V；裂解電壓：120 V；碰撞池電壓：18 V；MS掃描范圍：m/z 50～1 000；采集速率：2 張質(zhì)譜圖/s。

1.3.3 白酒中多肽的定量分析

采用外標(biāo)曲線法對(duì)多肽進(jìn)行定量分析，方法如下：用超純水配制質(zhì)量濃度分別為0.01、0.10、1.00、5.00、10.00、25.00 mg/L的RNH標(biāo)準(zhǔn)品溶液，HPLC-Q-TOF-MS分析條件同1.3.2節(jié)。將經(jīng)過前處理的酒樣同不同質(zhì)量濃度的RNH標(biāo)準(zhǔn)品溶液在同等條件下采用MS掃描模式對(duì)目標(biāo)母離子進(jìn)行掃描，對(duì)積分峰面積與標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多肽的質(zhì)量濃度。

1.3.4 多肽的細(xì)胞內(nèi)抗氧化活性測(cè)定

1.3.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2細(xì)胞采用含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5% FBS和50 μg/mL抗生素（慶大霉素、青霉素和鏈霉素）的DMEM培養(yǎng)基，在5% CO2、95%空氣、37 ℃的濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 d更換一次培養(yǎng)基，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí)，使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02%乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）溶液進(jìn)行分離。為了避免FBS的干擾，在測(cè)定之前將平板更換為無(wú)FBS培養(yǎng)基。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.4.2 多肽對(duì)HepG2細(xì)胞毒性的影響

為避免多肽對(duì)細(xì)胞存活率產(chǎn)生的影響，確定適合后續(xù)實(shí)驗(yàn)的樣品濃度，將密度為1×105個(gè)/mL的細(xì)胞接種到Costa 96 孔板中，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)24 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為2 組，分別為樣品組和對(duì)照組，每組設(shè)置4 個(gè)孔。樣品組中加入10 μL質(zhì)量濃度分別為12.00、8.00、4.00、2.00、1.00、0.500、0.250、0.125 mg/mL的多肽，對(duì)照組加入等體積的無(wú)FBS培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；之后各組每孔加入10 μL CCK-8，放置4 h后用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm處的OD值，并按照下式計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.3.4.3 多肽對(duì)AAPH誘導(dǎo)氧化損傷的HepG2細(xì)胞中ROS的影響

實(shí)驗(yàn)分為4 組，分別為樣品組、AAPH對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和空白組，每組設(shè)置4 個(gè)孔。樣品組加入100 μL質(zhì)量濃度分別為1.00、2.00、4.00 mg/mL的多肽，以及含10 μmol/L 2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽（2’,7’-dichlor odihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）的無(wú)FBS培養(yǎng)基，對(duì)照組和空白組分別加入100 μL不含樣品、含10 μmol/L DCFH-DA的無(wú)FBS培養(yǎng)基，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 min后取出，棄去培養(yǎng)液后用無(wú)FBS培養(yǎng)基小心清洗細(xì)胞3 次。向樣品組和AAPH對(duì)照組加入100 μL濃度為200 μmol/L的AAPH溶液，向空白組加入等體積無(wú)FBS培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育3 h后取出，用熒光顯微鏡拍照，并使用熒光酶標(biāo)儀測(cè)定熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)488 nm、發(fā)射波長(zhǎng)525 nm[17]。陽(yáng)性對(duì)照組加入100 μL按體積比1∶1 000稀釋后的Rosup，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育0.5 h后取出測(cè)定其熒光強(qiáng)度，測(cè)定條件同空白組。

1.3.4.4 細(xì)胞內(nèi)MDA含量和抗氧化酶（GSH-Px、SOD、CAT）活力的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)分為3 組，分別為空白組、AAPH對(duì)照組和樣品組，每組設(shè)置4 個(gè)孔。將HepG2細(xì)胞以1×105個(gè)/mL的密度接種在Costa 24 孔板中，每孔加入1 mL細(xì)胞懸液，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)24 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。棄去培養(yǎng)液，樣品組每孔細(xì)胞加入600 μL質(zhì)量濃度分別為1.00、2.00、4.00 mg/mL的多肽，AAPH對(duì)照組和空白組加入等體積無(wú)FBS培養(yǎng)基，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h，然后將細(xì)胞用PBS清洗兩次。為了誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，樣品組和AAPH對(duì)照組每孔均加入600 μL 200 μmol/L AAPH溶液，空白組加入等體積無(wú)FBS培養(yǎng)基，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育3 h后將細(xì)胞用PBS清洗3 次。用含有1 mmol/L苯基甲烷磺酰氟的RIPA裂解液在4 ℃裂解10 min，收集裂解后的細(xì)胞，在10 000×g條件下離心5 min獲得上清液。測(cè)定上清液中的MDA含量以及GSH-Px、SOD和CAT活力，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品定量測(cè)定細(xì)胞溶質(zhì)中的蛋白質(zhì)量濃度，按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.3.4.5 細(xì)胞內(nèi)GSH濃度的測(cè)定

將HepG2細(xì)胞以1×105個(gè)/mL的密度接種在Costa 24 孔板中，每孔加入1.0 mL細(xì)胞懸液，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)24 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。通過1.3.4.4節(jié)方法處理細(xì)胞。將加入600 μL 200 μmol/L AAPH溶液孵育3 h之后的細(xì)胞用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液在37 ℃消化5 min，然后用PBS清洗2 次。加入含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基終止消化，并將混合物在4 ℃下以10 000×g離心10 min，收集細(xì)胞碎片沉淀物。用蛋白去除試劑去除細(xì)胞碎片沉淀物中的細(xì)胞內(nèi)蛋白，再將細(xì)胞碎片沉淀在-80～37 ℃之間快速循環(huán)兩次，然后將細(xì)胞碎片沉淀物在4 ℃保持5 min，以10 000×g離心10 min后獲得上清液。使用試劑盒測(cè)定細(xì)胞上清液中的GSH濃度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC-Q-TOF-MS鑒定白酒樣品中的多肽氨基酸序列

對(duì)MS數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，提取離子色譜圖，發(fā)現(xiàn)保留時(shí)間為6.794 min處m/z 426.218 4（[M+H]+）的組分峰面積最大，而且峰純度高。將m/z 426.218 4的離子作為母離子進(jìn)行MS/MS分析，其離子色譜圖、MS圖及MS/MS圖如圖1所示。

圖1 多肽母離子m/z 426.218 4的離子色譜圖（A）、MS圖（B）和MS/MS圖（C）Fig.1 Extracted ion chromatogram (A), MS (B), and MS/MS (C) of m/z 426.218 4

為了得到多肽的氨基酸序列，根據(jù)文獻(xiàn)[10,17,20-23]報(bào)道的方法，采用從頭測(cè)序算法解析未知多肽的MS/MS碎片信息，確認(rèn)其氨基酸序列。多肽通常在ESI-MS/MS條件下被質(zhì)子化，當(dāng)碰撞能量在10～200 eV時(shí)，多肽主要在酰胺鍵處發(fā)生斷裂，而側(cè)鏈的化學(xué)鍵在此低能量下較難發(fā)生斷裂，因此，MS/MS碎片離子主要是b離子和y離子[23]。

如圖1B所示，分析本研究得到的母離子m/z 426.218 4的MS/MS圖，推測(cè)m/z 270.091 9的碎片離子為y2離子，可能是Asn-His；推測(cè)m/z 271.121 3的碎片離子為b2離子，可能是Arg-Asn；推測(cè)m/z 156.093 7的碎片離子為y1離子，可能是His；推測(cè)m/z 157.137 7的碎片離子為b1離子，可能為Arg。綜上所述，確定m/z 426.218 4的多肽氨基酸序列為Arg-Asn-His。其結(jié)構(gòu)如圖2所示。

圖2 RNH結(jié)構(gòu)式Fig.2 Structure of RNH

2.2 白酒中RNH的定量測(cè)定結(jié)果

本研究采用外標(biāo)法對(duì)RNH進(jìn)行定量分析，標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為y＝142 567x-51 242（R2＝0.997 7），計(jì)算出白酒中RNH質(zhì)量濃度為（18.78±0.34）μg/L。

2.3 RNH的細(xì)胞內(nèi)抗氧化活性分析

2.3.1 RNH對(duì)HepG2細(xì)胞毒性的影響

圖3 RNH質(zhì)量濃度對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響Fig.3 Effect of RNH concentration on viability of HepG2 cells

如圖3所示，當(dāng)RNH質(zhì)量濃度在4.00 mg/mL以內(nèi)時(shí)，隨著樣品質(zhì)量濃度的增加，細(xì)胞死亡率基本沒有變化；但當(dāng)RNH質(zhì)量濃度達(dá)到4.00 mg/mL時(shí)，細(xì)胞死亡率顯著增加（P＜0.05），表明在此質(zhì)量濃度下HepG2細(xì)胞已經(jīng)受到損傷，但是存活率依舊在80%以上，可以視為細(xì)胞在此條件下能正常存活。為了考察不同RNH質(zhì)量濃度對(duì)細(xì)胞抗氧化性的影響，選擇3 個(gè)質(zhì)量濃度1.00、2.00、4.00 mg/mL作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的樣品質(zhì)量濃度。

2.3.2 RNH對(duì)AAPH誘導(dǎo)的氧化損傷HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS的影響

AAPH是一種偶氮化合物，在37 ℃下可以自發(fā)分解產(chǎn)生自由基。其產(chǎn)生的自由基與氧立即發(fā)生反應(yīng)而引起脂質(zhì)氧化[24]。細(xì)胞膜脂質(zhì)的氧化降解可導(dǎo)致其喪失完整性，同時(shí)導(dǎo)致運(yùn)輸機(jī)制產(chǎn)生缺陷并且增加細(xì)胞膜的滲透性，使得AAPH可滲透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，引起ROS的產(chǎn)生[25]。因此，用AAPH誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，通過細(xì)胞內(nèi)ROS的濃度來(lái)反映HepG2細(xì)胞的氧化損傷是一種有效方式。

本研究利用熒光探針DCFH-DA進(jìn)行ROS檢測(cè)。DCFH-DA本身沒有熒光，可以自由穿過細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞后，可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成沒有熒光的DCFH，而DCFH不能透過細(xì)胞膜，而且可以被細(xì)胞內(nèi)ROS氧化為具有熒光的7’-二氯熒光素（7’-dichlorofluorescein，DCF），根據(jù)DCF熒光強(qiáng)度即可知細(xì)胞內(nèi)ROS水平[26-27]。

圖 4 RNH對(duì)AAPH誘導(dǎo)的氧化損傷HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS的影響Fig.4 Effect of RNH on intracellular ROS in HepG2 cells with AAPH-induced oxidative damage

如圖4A所示，空白組未經(jīng)AAPH處理，顯示出比較弱的熒光，說(shuō)明細(xì)胞沒有受到氧化損傷。相比而言，AAPH對(duì)照組熒光較強(qiáng)。與AAPH對(duì)照組相比，經(jīng)過不同質(zhì)量濃度RNH預(yù)處理的樣品組表現(xiàn)出了較弱的熒光，說(shuō)明多肽在一定程度上降低了細(xì)胞內(nèi)ROS水平。為了避免人眼主觀性的差異，用酶標(biāo)儀對(duì)細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖4B所示。與AAPH對(duì)照組相比，加入不同質(zhì)量濃度的RNH顯著減少了ROS產(chǎn)生（P＜0.05），而且呈濃度依賴性。這表明用RNH處理后的HepG2細(xì)胞受到部分保護(hù)，可防止其受到氧化損傷，而且RNH的質(zhì)量濃度越高，保護(hù)效果越好。

2.3.3 多肽對(duì)細(xì)胞內(nèi)MDA含量的影響

細(xì)胞膜降解的一個(gè)重要步驟是ROS與多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）的雙鍵反應(yīng)，產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化氫，引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，并因此形成脂質(zhì)過氧化物[28]。MDA是一種由過氧化PUFA（主要是花生四烯酸）斷裂形成的三碳化合物，是脂質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物之一[29]。因此，MDA含量可以反映機(jī)體內(nèi)過氧化程度，從而間接反映細(xì)胞損傷程度。

圖 5 RNH對(duì)細(xì)胞內(nèi)MDA含量的影響Fig.5 Effect of RNH concentration on intracellular MDA

如圖5所示，與空白組相比，經(jīng)過200 μmol/L AAPH處理3 h后的HepG2細(xì)胞中MDA含量顯著增加（P＜0.05）。與AAPH對(duì)照組相比，用不同質(zhì)量濃度RNH預(yù)處理2 h后均對(duì)細(xì)胞內(nèi)MDA含量有所抑制：其中低質(zhì)量濃度（1.00 mg/mL）RNH處理后的HepG2細(xì)胞中MDA含量為1.08 nmol/mg，其對(duì)細(xì)胞內(nèi)MDA的抑制率為45.24%；而高質(zhì)量濃度（4.00 mg/mL）RNH處理后的細(xì)胞內(nèi)MDA含量為0.24 nmol/mg，其抑制率為88.10%，且與正常細(xì)胞相比無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。以上結(jié)果表明，RNH對(duì)AAPH誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞內(nèi)氧化損傷具有一定的保護(hù)作用，且具有抗氧化活性。

2.3.4 RNH對(duì)AAPH誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞中GSH濃度的影響

GSH是細(xì)胞內(nèi)非常重要的一種非酶系統(tǒng)抗氧化劑，是體內(nèi)清除ROS的一種重要物質(zhì)，對(duì)于維持機(jī)體的氧化還原平衡意義重大。GSH濃度的減小表明機(jī)體發(fā)生了強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激反應(yīng)，因此抗氧化劑保護(hù)細(xì)胞氧化損傷的一種有效途徑就是減少細(xì)胞內(nèi)GSH的消耗[23,30]。

圖 6 RNH對(duì)AAPH誘導(dǎo)的氧化損傷HepG2細(xì)胞內(nèi)GSH濃度的影響Fig.6 Effect of RNH concentration on intracellular GSH

如圖6所示，與空白組相比，加入AAPH之后GSH濃度顯著降低（P＜0.05），說(shuō)明AAPH對(duì)細(xì)胞造成了氧化損傷，細(xì)胞為了抵御氧化損傷，導(dǎo)致GSH被消耗。但是，在加入RNH對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)之后，再加入AAPH進(jìn)行氧化損傷，其GSH濃度均顯著高于AAPH對(duì)照組（P＜0.05）?？梢?，RNH可以提高HepG2細(xì)胞中的GSH濃度，減少AAPH誘導(dǎo)的氧化損傷，具有一定的抗氧化能力。

2.3.5 RNH對(duì)細(xì)胞內(nèi)GSH-Px、SOD、CAT活力的影響

作為酶促系統(tǒng)中重要的抗氧化劑，細(xì)胞內(nèi)GSH-Px、SOD、CAT 3 種酶主要通過間接清除自由基的方式減少對(duì)GSH的消耗，提高其自身活力從而抑制過氧化反應(yīng)[19]。其中SOD可以清除人體內(nèi)的自由基，催化O2-·形成H2O2和O2，而CAT和GSH-Px可將H2O2轉(zhuǎn)化為H2O，三者都是哺乳動(dòng)物體內(nèi)重要的抗氧化酶，其中SOD被認(rèn)為是防止氧化損傷的關(guān)鍵酶，具有獨(dú)特的生物活性。因此，可以將抗氧化酶活力的變化作為細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的生物性標(biāo)志[12,31]。

表 1 RNH對(duì)AAPH誘導(dǎo)的氧化損傷HepG2細(xì)胞內(nèi)CAT、GSH-Px和SOD活力變化的影響Table1 Effect of RNH on GSH-Px, SOD and CAT activities in HepG2 cells with AAPH-induced damage

如表1所示，與空白組相比，使用AAPH處理3 h可顯著抑制GSH-Px、SOD和CAT活力（P＜0.05），其抑制率分別為60.00%、47.33%和48.37%，表明AAPH處理增加了HepG2細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激。RNH組與AAPH對(duì)照組相比，GSH-Px、SOD和CAT活力都有所提升，低質(zhì)量濃度組分別增加32.14%、57.79%和27.85%，中質(zhì)量濃度組分別增加96.42%、138.94%和244.30%，高質(zhì)量濃度組分別增加250.00%、280.22%和560.76%。以上結(jié)果表明，多肽對(duì)AAPH誘導(dǎo)的氧化損傷HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激具有保護(hù)作用。Du Yichen[32]和Wang Liying[33]等的研究發(fā)現(xiàn)，肽具有抗氧化能力，其可以通過改善細(xì)胞內(nèi)重要抗氧化酶（GSH-Px、SOD和CAT）的活力來(lái)保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的相關(guān)損傷。在本研究中，RNH也通過增加GSH-Px、SOD和CAT 3 種抗氧化酶活力，有效地激發(fā)了HepG2細(xì)胞的抗氧化酶系防御系統(tǒng)，減少氧化應(yīng)激損傷。

多肽的抗氧化性主要與其氨基酸組成、排列順序、分子質(zhì)量大小及其空間結(jié)構(gòu)等相關(guān)。由于His結(jié)構(gòu)中含有的咪唑基團(tuán)具有良好的供電子和供氫能力，因此具有良好的自由基清除能力。據(jù)報(bào)道，咪唑基團(tuán)能抑制脂質(zhì)過氧化，如Chen Huaming等[34]從大豆β-伴球蛋白水解產(chǎn)物中鑒定出6 個(gè)肽，其中4 個(gè)含有His，這些肽均能抑制脂質(zhì)過氧化。另外，Escudero等[35]從火腿中鑒定出一系列多肽，發(fā)現(xiàn)含有His的肽段SSAHT和IHSGSVG也都具有一定的抗氧化能力，并指出這是序列中His的貢獻(xiàn)。另外，也有研究表明His能促進(jìn)血紅素的SOD活力[36-37]，從而發(fā)揮其抗氧化作用。因此，本研究從白酒中分離鑒定出的多肽RNH的抗氧化性也可能是His的貢獻(xiàn)。

3 結(jié) 論

本研究利用HPLC-Q-TOF-MS在芝麻香型白酒中鑒定出一種三肽RNH，通過AAPH誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞氧化損傷模型，發(fā)現(xiàn)該三肽具有一定的細(xì)胞內(nèi)抗氧化活性，不僅可以提高機(jī)體內(nèi)還原性物質(zhì)GSH的濃度，清除細(xì)胞內(nèi)ROS，而且能夠提高細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶（GSH-Px、SOD、CAT）的活力，同時(shí)可以防止MDA含量的增加，降低細(xì)胞中AAPH誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化水平，從而提高細(xì)胞的抗氧化能力。

目前已報(bào)道的白酒中具有生物活性的多肽還很少，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果不僅可以為功能性白酒的研究提供一定的參考，而且可以為食源性生物活性肽在白酒工業(yè)中的應(yīng)用提供一定的依據(jù)。今后將繼續(xù)對(duì)白酒中的各種健康因子進(jìn)行研究，尤其是不同香型白酒的功效將是主要研究目標(biāo)。