劉麗莎，趙金紅，蔣華彬，張 清，金 楊，白 潔，李玉美，彭義交*

（北京食品科學研究院，北京 100068）

北豆腐中蛋白質(zhì)、脂肪、糖類含量豐富，含有異黃酮、低聚糖、大豆磷脂等功能性成分，且鈣、鎂等微量元素含量較高[1]，深受我國消費者喜愛。由于北豆腐營養(yǎng)豐富、水分活度高且pH值呈中性，適合微生物代謝繁殖；此外，由于原料微生物污染嚴重、自動化加工程度不高、殺菌溫度過高易影響大豆蛋白凝膠性質(zhì)[2]，導致北豆腐產(chǎn)品貨架期極短，嚴重限制了豆制品企業(yè)的規(guī)?；l(fā)展。

豆腐中的微生物主要來源于大豆原料及加工環(huán)境，研究表明豆腐中最普遍的微生物有腸道菌、鏈球菌屬、乳桿菌屬、片球菌屬、假單胞菌屬、穩(wěn)桿菌屬、芽孢桿菌屬等[3-5]；內(nèi)酯豆腐中腐敗菌為芽孢桿菌屬和屎腸球菌屬[6]；魚豆腐等豆制品中主要為乳桿菌屬、魏斯氏菌屬、腸球菌屬和葡萄球菌屬[7]。目前，微生物污染及控制依舊是限制傳統(tǒng)豆制品發(fā)展的重要瓶頸，尤其在北豆腐加工過程中大豆浸泡工序耗時長（8～12 h），微生物快速增殖，豆?jié){品質(zhì)不穩(wěn)定，點腦需靠人工經(jīng)驗值指導，標準化自動控制難以實現(xiàn)；大型加工企業(yè)目前大多采用流水浸泡減輕微生物的影響，但耗費大量水資源并產(chǎn)生大量污水；科研人員也將生物防腐劑、超高壓、微波、射線等技術(shù)引入豆制品防腐并取得一定效果[8-10]，但目前未在產(chǎn)業(yè)化中應用。關(guān)于豆腐腐敗方面的研究主要集中于豆腐貨架期間微生物數(shù)量及種類，針對不同腐敗菌對北豆腐的腐敗作用、加工過程腐敗菌分析及控制的報道較少。低耗水制漿技術(shù)是本團隊前期研發(fā)的具有低耗水、耗時短、低排放等優(yōu)勢的綠色制漿技術(shù)，關(guān)于其對豆制品制漿過程的微生物控制作用還鮮有報道。本研究通過分離北豆腐加工貯藏期間的優(yōu)勢菌，分析腐敗菌在北豆腐產(chǎn)品中的生長規(guī)律及腐敗作用，探明北豆腐加工過程中主要腐敗菌來源及增殖環(huán)節(jié)，并研究低耗水制漿技術(shù)對豆制品加工過程中微生物的控制作用，保障傳統(tǒng)豆制品加工穩(wěn)定性，為豆制品加工自動化及食品安全保障提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

盒裝北豆腐 北京某豆制品加工企業(yè)；散裝北豆腐北京市西紅門市場手工作坊；微生物培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)股份有限公司；溶菌酶、蛋白酶K、細菌總DNA提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒 寶生物工程（大連）有限公司；引物合成及序列測定 北京博邁德生物技術(shù)有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ME204E分析天平 瑞士Mettler Toledo公司；高壓蒸汽滅菌鍋 長沙平凡儀器儀表有限公司；DM750顯微鏡 德國Leica公司；TC-512聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 英國TechNet公司；PB-10 pH計 德國Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 北豆腐優(yōu)勢腐敗菌分離純化及鑒定

1.3.1.1 優(yōu)勢菌分離純化

從北豆腐菌落總數(shù)計數(shù)平皿中收集不同菌落形態(tài)的菌落進行反復劃線純化，分離主要優(yōu)勢菌。

1.3.1.2 形態(tài)學鑒定

觀察菌株的菌落形態(tài)，包括大小、形態(tài)、顏色、質(zhì)地、邊緣狀態(tài)及透明度等。挑取培養(yǎng)18～24 h長勢好的單菌落，經(jīng)革蘭氏染色觀察菌體形態(tài)。

1.3.1.3 16S rDNA鑒定

采用細菌總DNA試劑盒提取腐敗菌DNA，16S rDNA鑒定引物：LPW57（5’-AGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）、LPW205（5’-CTTGTTACGACTTCACCC-3’）[11]。PCR體系（25 μL）：2×Taq PCR Master Mix 11 μL，上、下游引物各1.5 μL，模板DNA 1.0 μL，ddH2O 10 μL。程序：94 ℃初始變性5 min；94 ℃變性1 min，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物純化后連接T載體測序，將結(jié)果與GenBank中收錄的其他菌株序列進行分析比對。結(jié)合菌株形態(tài)學及分子生物學對主要腐敗菌進行鑒定。

1.3.2 腐敗菌對北豆腐的腐敗作用測定

盒裝北豆腐沸水加熱20 min，將腐敗菌稀釋成105CFU/mL回接至豆腐表面，于25 ℃下貯藏，測定豆腐活菌數(shù)、理化指標及感官品質(zhì)。

1.3.2.1 活菌數(shù)

無菌操作稱取北豆腐10 g，搗碎后于90 mL滅菌生理鹽水中充分振搖，體積比1∶10稀釋，用稀釋平板法測定樣品的活菌數(shù)。

1.3.2.2 pH值

用清潔小勺取北豆腐樣品，搗碎后于6 000 r/min離心5 min，用pH計測定上清液pH值。

1.3.2.3 可溶性氨基酸態(tài)氮質(zhì)量分數(shù)

按GB 5009.235—2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸態(tài)氮的測定》，取樣品5 g加50 mL水研碎，50 ℃放置10 min，離心取10 mL濾液加入70 mL水中，用0.1 mol/L NaOH溶液滴定至pH 8.2，加入10 mL體積分數(shù)38%甲醛溶液（pH 8.2），用0.1 mol/L NaOH溶液滴定至pH 9.2，以空白水樣為對照。氨基酸態(tài)氮質(zhì)量分數(shù)按下式計算。

式中：c為NaOH溶液濃度（0.1 mol/L）；V1為樣品消耗NaOH溶液體積/mL；V01為對照消耗NaOH溶液體積/mL。

1.3.2.4 感官評價

北豆腐接種腐敗菌后每隔6 h取樣，觀察其顏色、氣味、質(zhì)地和產(chǎn)黏情況，評價豆腐腐敗程度。

1.3.3 北豆腐加工及貯藏過程的微生態(tài)分析

按北豆腐生產(chǎn)工序（某豆制品企業(yè)北豆腐生產(chǎn)線）取樣，市售盒裝及散裝北豆腐于25 ℃貯藏24 h，按GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》檢測菌落總數(shù)，根據(jù)菌落形態(tài)統(tǒng)計菌群數(shù)量，研究北豆腐加工及貯藏過程中的微生態(tài)。

1.3.4 低耗水制漿技術(shù)對微生物的控制作用

將相同原料分別采用如下不同工藝浸泡制漿，檢測制漿后生漿的菌落總數(shù)及腐敗菌種類，研究不同工藝對北豆腐加工過程中微生物的影響。

傳統(tǒng)工藝：大豆原料清洗一遍，按料液比1∶7加水浸泡12 h制漿；流水浸泡工藝：大豆原料清洗一遍，按料液比1∶7流水浸泡12 h制漿（某豆制品企業(yè)制漿生產(chǎn)線）；低耗水制漿技術(shù)[12]：大豆破碎脫皮，按料液比1∶7加水浸泡3 h制漿。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2016軟件和SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)均重復3 次，采用Duncan法進行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)勢菌的分離純化及鑒定結(jié)果

2.1.1 形態(tài)學鑒定結(jié)果

采用平板培養(yǎng)技術(shù)從北豆腐成品及貯藏過程中篩選分離出5 類菌落形態(tài)不同的優(yōu)勢菌（圖1），分別命名為BDF-1～5。

圖1 腐敗菌菌落形態(tài)圖Fig.1 Colonial morphology of spoilage bacteria

BDF-1為白色針尖狀小菌落，顯微鏡下鑒定為革蘭氏陽性鏈球菌；BDF-2在固體培養(yǎng)基上生長時呈不規(guī)則假根狀，邊緣呈羽毛狀，表面干燥，革蘭氏染色呈陽性，幼齡培養(yǎng)物桿狀，長時間培養(yǎng)出現(xiàn)球狀細胞；BDF-3為較大乳白色圓形菌落，革蘭氏染色呈陰性；BDF-4為典型的黃色菌落，邊緣整齊，表面濕潤，光滑有光澤，顯微鏡下觀察為革蘭氏陰性球桿菌；BDF-5為圓形白色菌落，邊緣不整齊，表面微皺，革蘭氏染色為陽性桿菌，產(chǎn)芽孢。

2.1.2 16S rDNA序列同源性分析結(jié)果

分別提取5 株優(yōu)勢菌的總DNA，利用細菌16S rDNA基因為目標片段，擴增獲得1 400 bp左右（1 420、1 452、1 420、1 384、1 420 bp）特異性擴增條帶，經(jīng)測序后5 株菌的16S rDNA測序結(jié)果在美國國立生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）使用BLASTN比對確定屬，結(jié)果如表1所示。

表1 腐敗菌16S rDNA鑒定Table1 Identification of spoilage bacteria by 16S rDNA gene sequence analysis

2.2 優(yōu)勢菌對北豆腐的腐敗作用

北豆腐因營養(yǎng)豐富，水分含量高，適宜微生物快速增殖，在豆腐腐敗過程中，部分種類的微生物將占據(jù)優(yōu)勢，大量增殖生成代謝產(chǎn)物使豆腐產(chǎn)生臭味、黏液、顏色變化及變軟等現(xiàn)象，此類微生物被稱為特定腐敗菌。目前國內(nèi)外報道的豆腐腐敗菌主要是庫特氏菌、腸桿菌、假單胞菌、芽孢桿菌屬等細菌，由于原料和加工環(huán)境的差別，報道的菌群有較大差異。本研究將分離到的5 株優(yōu)勢菌反接至豆腐，研究其對北豆腐的腐敗作用。

2.2.1 優(yōu)勢菌在豆腐中的增殖規(guī)律

圖2 優(yōu)勢菌在北豆腐貯藏過程中的變化Fig.2 North Chinese of curves of bacteria in tofu during storage

圖2表明，豆腐接種5 種腐敗菌后在25 ℃貯存，微生物快速增殖。BDF-3（產(chǎn)氣腸桿菌）生長速率最快，在6 h時達107CFU/g，北豆腐已有異味，至24 h時，BDF-3活菌數(shù)達109CFU/g，樣品已嚴重腐敗。BDF-2（吉氏庫特氏菌）、BDF-5（枯草芽孢桿菌）在6 h后進入快速生長期，于12 h時達108CFU/g左右，此時接種BDF-2、BDF-5的樣品已有輕微異味，至24 h時已嚴重腐敗，散發(fā)惡臭。BDF-1（乳酸乳球菌）在6 h后快速增殖，于12 h時達107CFU/g，18 h時達109CFU/g，除產(chǎn)生酸味外，對樣品其余性質(zhì)無明顯影響。BDF-4（短穩(wěn)桿菌）生長較為遲緩，至18 h時樣品產(chǎn)生品質(zhì)劣變，活菌數(shù)接近107CFU/g，貯藏24 h時活菌數(shù)近108CFU/g，產(chǎn)生惡臭味，短穩(wěn)桿菌目前主要應用于微生物殺蟲劑，可能隨原料進入豆制品加工環(huán)節(jié)[13]。

2.2.2 優(yōu)勢菌對豆腐pH值的影響

圖3 優(yōu)勢菌對貯藏期間豆腐pH值的影響Fig.3 Effect of dominant bacteria on pH of tofu during storage

如圖3所示，北豆腐在初始6 h內(nèi)pH值無明顯變化。6 h后，接種BDF-1的北豆腐pH值明顯下降，放置24 h后其pH值降至4.5。接種BDF-3和BDF-5的樣品pH值小幅下降，24 h后pH值為5.8左右。北豆腐pH值下降可能是微生物利用碳水化合物產(chǎn)生乳酸、乙酸等有機酸所致[14]。據(jù)報道，乳酸乳球菌、產(chǎn)氣腸桿菌有較強產(chǎn)酸能力[15-16]，可使樣品pH值迅速下降。BDF-4對北豆腐pH值影響較小，其pH值保持相對穩(wěn)定。接種BDF-2的樣品貯藏24 h后pH值升至6.4，可能是由于豆腐富含蛋白質(zhì)，微生物代謝產(chǎn)生堿性胺類化合物，從而導致其pH值上升[17-18]。

2.2.3 優(yōu)勢菌對可溶性氨基酸態(tài)氮質(zhì)量分數(shù)的影響

圖4 優(yōu)勢菌對貯藏期間豆腐可溶性氨基酸態(tài)氮質(zhì)量分數(shù)的影響Fig.4 Effect of dominant bacteria on soluble amino nitrogen content of tofu during storage

氨基酸態(tài)氮質(zhì)量分數(shù)是蛋白質(zhì)水解程度的一個重要指標，其質(zhì)量分數(shù)越高表明蛋白質(zhì)水解越嚴重[19]。圖4表明，隨著北豆腐貯藏時間延長，其可溶性氨基酸態(tài)氮質(zhì)量分數(shù)不斷升高。貯藏24 h時，氨基酸態(tài)氮質(zhì)量分數(shù)由高至低依次為BDF-5、BDF-3、BDF-2、BDF-4、BDF-1。接種BDF-1的樣品氨基酸態(tài)氮質(zhì)量分數(shù)基本保持穩(wěn)定，稍有上升。接種其余菌株的樣品氨基酸態(tài)氮質(zhì)量分數(shù)均有明顯上升，其中BDF-3、BDF-5增加最為迅速。據(jù)報道，產(chǎn)氣腸桿菌和枯草芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶能力較強[20]，微生物通過分泌蛋白酶水解蛋白質(zhì)產(chǎn)生氨基酸，破壞由7S、11S球蛋白形成的三維網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，將豆腐腐化成軟泥狀[21]。

2.2.4 感官評價結(jié)果

表2 北豆腐感官評價結(jié)果Table2 Sensory evaluation of north Chinese tofu

圖5 貯藏24 h時的豆腐樣品Fig.5 Tofu samples during storage for 24 h

北豆腐樣品初始狀態(tài)均為乳白色，表面濕潤，有彈性、無黏液、無異味。隨著微生物的繁殖，豆腐的顏色、質(zhì)地及風味產(chǎn)生了顯著變化。表2及圖5表明，乳酸乳球菌（BDF-1）對北豆腐色澤及質(zhì)地影響較小，其不產(chǎn)生黏液及色素，于25 ℃放置24 h，豆腐仍保持乳白色及原有質(zhì)地；其產(chǎn)酸能力強，樣品放置18 h時開始有較明顯的酸味；產(chǎn)蛋白酶能力弱，對豆腐蛋白質(zhì)凝膠結(jié)構(gòu)破壞較小，僅彈性降低、硬度變大，可能與pH值下降引起豆腐凝膠收縮有關(guān)。接種庫特氏菌（BDF-2）的豆腐從18 h時開始表面出現(xiàn)黃膜，至24 h時已覆滿鵝黃色黏膜，質(zhì)地變軟，從12 h時開始出現(xiàn)餿味。產(chǎn)氣腸桿菌（BDF-3）、短穩(wěn)桿菌（BDF-4）和枯草芽孢桿菌（BDF-5）均能使豆腐顏色變?yōu)榛尹S色，放置24 h時豆腐成泥狀，這與菌株生長過程中水解大豆蛋白破壞原有凝膠結(jié)構(gòu)有關(guān)，樣品質(zhì)地的腐壞速率與氨基酸態(tài)氮質(zhì)量分數(shù)變化趨勢一致。此外菌株在代謝過程中催化氨基酸脫羧，生成生物胺、氨氣、吲哚、硫化物等[22]，嚴重影響產(chǎn)品品質(zhì)及安全性。

根據(jù)豆腐樣品感官評價與微生物生長趨勢分析，微生物增長速率與豆腐腐敗速率（樣品感官品質(zhì)劣變程度）一致，當腐敗菌數(shù)量增長到107CFU/g時，樣品感官品質(zhì)出現(xiàn)明顯劣變，為食品能被接受的最大微生物限量值[23]，腐敗速率由快至慢為產(chǎn)氣腸桿菌（BDF-3）、庫特氏菌（BDF-2）、枯草芽孢桿菌（BDF-5）、乳酸乳球菌（BDF-1）、短穩(wěn)桿菌（BDF-4）。

2.3 北豆腐貯藏過程中的微生態(tài)分析

蛋白類食品的防腐保鮮技術(shù)一直是科研人員關(guān)注的重點及難點，由于大豆蛋白對溫度較敏感，溫度過高易導致蛋白變性影響其凝膠特性[24]，豆腐類產(chǎn)品難以徹底殺菌。不同包裝形式的北豆腐微生物污染情況有顯著差異（P＜0.05）。經(jīng)高溫殺菌處理的盒裝產(chǎn)品菌落總數(shù)為（3.3±0.5）×102CFU/g，當天生產(chǎn)的散裝北豆腐菌落總數(shù)高達（1.3±0.1）×105CFU/g，遠超過盒裝產(chǎn)品（P＜0.05）。樣品經(jīng)25 ℃貯藏24 h，散裝和盒裝北豆腐菌落總數(shù)分別達（2.9±0.3）×109CFU/g和（1.0±0.1）×108CFU/g，樣品已腐敗變質(zhì)。豆腐類產(chǎn)品蛋白質(zhì)含量豐富，水分含量高，適合微生物繁殖[25]，且北豆腐基本為敞開式加工，原料、設(shè)備及加工環(huán)境中的微生物均會污染產(chǎn)品。散裝豆腐成型后無殺菌措施且無冷鏈保藏，產(chǎn)品微生物污染更為嚴重，存在較大的食品安全問題；盒裝豆腐成品經(jīng)殺菌后仍需冷鏈運輸、銷售，才能保證北豆腐產(chǎn)品的品質(zhì)及安全性，但貨架期較短。

圖6 北豆腐貯藏過程微生態(tài)分析Fig.6 Changes in bacterial counts of north Chinese tofu during storage

如圖6所示，5 類主要腐敗菌均可在散裝產(chǎn)品中檢測到，盒裝豆腐經(jīng)殺菌后，生物多樣性明顯小于散裝豆腐，僅能檢測到乳酸乳球菌。樣品經(jīng)25 ℃貯藏24 h后完全腐敗，BDF-1和BDF-2快速增殖，為散裝和盒裝北豆腐的主要腐敗菌，散裝產(chǎn)品中利用本研究方法未檢出BDF-3～5（活菌數(shù)小于106CFU/g）。乳酸乳球菌發(fā)酵產(chǎn)酸導致樣品pH值大幅下降，此外，其能產(chǎn)生抑菌代謝產(chǎn)物或信號分子抑制其余微生物繁殖[26]。乳酸菌是豆制品加工及貯藏中普遍存在的一類微生物，傳統(tǒng)酸漿豆腐即利用乳酸菌發(fā)酵酸漿作為酸凝固劑[27]。庫特氏菌在吳麗櫻報道的3 種品牌豆腐中均有檢出[28]，也是本研究中散裝和盒裝北豆腐的主要腐敗菌，該菌可能在北豆腐產(chǎn)品中普遍存在，但在未腐敗豆腐中并不占優(yōu)勢，溫度適宜時其快速增殖造成北豆腐腐敗，針對該菌污染來源及毒理學等方面的報道較少。腸桿菌、短穩(wěn)桿菌和芽孢桿菌在盒裝北豆腐成品中未檢出，但存在于散裝北豆腐產(chǎn)品中，與其他研究中報道的豆制品中常見腐敗微生物一致[5,23,28]。

2.4 北豆腐加工過程中的微生態(tài)分析及控制

2.4.1 北豆腐加工過程的微生態(tài)分析

圖7 盒裝北豆腐加工環(huán)節(jié)微生態(tài)分析Fig.7 Bacterial community analysis of packaged north Chinese tofu during processing

如圖7所示，在盒裝北豆腐加工過程中，浸泡、生漿工序的微生物數(shù)量最高（大于105CFU/g），生物多樣性最豐富，優(yōu)勢菌為乳酸乳球菌（BDF-1）、產(chǎn)氣腸桿菌（BDF-3）和短穩(wěn)桿菌（BDF-4）。我國傳統(tǒng)豆制品加工一般選用蛋白質(zhì)含量較高的國產(chǎn)大豆，在田間收獲后未經(jīng)篩選、除雜、清洗等處理，大豆原料攜帶大量微生物進入浸泡環(huán)節(jié)[28-29]，經(jīng)10～12 h流水浸泡，蛋白質(zhì)、糖類物質(zhì)溶出，微生物大量繁殖（105CFU/g），溫度較高時，微生物快速繁殖產(chǎn)酸導致pH值下降，還可能產(chǎn)生胺類等有害成分，嚴重影響豆?jié){加工穩(wěn)定性及安全性。

熟漿的微生物數(shù)量最低（24 CFU/g），與李博[6]、石彥國[30]等的報道一致，這是因為大部分微生物被殺滅，僅殘留少量乳酸乳球菌。點腦成型過程溫度高，微生物數(shù)量變化不顯著（P＞0.05）。豆腐成型后經(jīng)冷卻、分割、包裝，微生物數(shù)量顯著上升（至104CFU/g），主要為乳酸乳球菌和產(chǎn)氣腸桿菌，這是由于北豆腐為敞開式加工，設(shè)備、包布、冷卻水、環(huán)境中微生物容易污染產(chǎn)品。包裝后北豆腐經(jīng)巴氏殺菌，微生物數(shù)量顯著降低（至102CFU/g），不耐熱微生物基本被殺滅，冷鏈條件下貨架期可保持7 d，在常溫下不足1 d。

庫特氏菌在加工過程并未檢出，但在散裝及盒裝產(chǎn)品中均出現(xiàn)。據(jù)報道，庫特氏菌主要存在于雞糞、不流動淡水、肉制品、牛乳中[31]，曾在豆腐切割刀上檢出[28]，豆腐成品中的庫特氏菌可能是成型后冷卻、分割過程中由設(shè)備及冷卻水帶入，在加熱過程中未完全殺滅，在適宜溫度下快速增殖，成為豆腐的主要腐敗菌。

2.4.2 不同浸泡工藝對制漿過程中微生物增殖的影響

圖8 不同浸泡工藝對制漿過程中微生物增殖的影響Fig.8 Effect of different pulping technologies on microbial proliferation in soymilk during processing

大豆浸泡過程中的微生物主要為乳酸乳球菌、產(chǎn)氣腸桿菌、短穩(wěn)桿菌三大類，主要來源于大豆原料，散裝產(chǎn)品由于殺菌程度低，這3 類菌均能在成品中檢出，盒裝產(chǎn)品殺菌較為徹底，乳酸乳球菌為主要優(yōu)勢菌。前期研究證實，乳酸乳球菌和產(chǎn)氣腸桿菌在豆?jié){中發(fā)酵產(chǎn)酸使蛋白凝聚，短穩(wěn)桿菌產(chǎn)生黃色菌膜，3 類腐敗菌都會嚴重影響豆?jié){的加工穩(wěn)定性和產(chǎn)品品質(zhì)[32]。

圖8表明，低耗水制漿技術(shù)可大幅降低原料微生物數(shù)量，菌落總數(shù)從傳統(tǒng)工藝的3.7×105CFU/g降至8.6×103CFU/g（P＜0.05）。大豆原料攜帶的微生物主要來源于種皮[29]，采用低耗水制漿技術(shù)的原料經(jīng)前處理脫皮，可有效降低原料中攜帶的各類微生物數(shù)量。

傳統(tǒng)大豆制漿技術(shù)由于耗時長（12 h），微生物增殖迅速，制漿后菌落總數(shù)達2.3×108CFU/g，溫度較高時，微生物腐敗速率更快，對豆?jié){品質(zhì)影響更為顯著。大型豆制品加工廠為保證產(chǎn)品品質(zhì)及安全性，采用流水浸泡制漿技術(shù)將微生物總數(shù)控制在105～106CFU/g，但此工藝耗水量及污水排放量巨大，給企業(yè)造成極大的經(jīng)濟負擔和環(huán)境壓力。低耗水制漿技術(shù)由于破碎后的大豆顆粒較小，吸水面積增加，蛋白質(zhì)吸水迅速，3 h即可完成浸泡；且由于原料污染程度降低，制漿結(jié)束后菌落總數(shù)（7.0×104CFU/g）較傳統(tǒng)工藝和流水浸泡工藝顯著下降（P＜0.05），與傳統(tǒng)工藝浸泡初始階段相當。低耗水制漿技術(shù)制漿過程中微生物污染少且繁殖慢，無需換水，浸泡用水可直接用于磨漿，可大幅降低工藝耗水量及污水排放量，有利于傳統(tǒng)豆制品加工行業(yè)的可持續(xù)發(fā)展；此外，由于耗時短，微生物對豆?jié){的水解腐敗作用較小，豆?jié){的加工穩(wěn)定性和安全性得以保障，有利于豆制品加工過程的標準化自動控制。

3 結(jié) 論

本研究考察市售散裝及盒裝北豆腐微生物污染及多樣性，發(fā)現(xiàn)散裝北豆腐成品菌落總數(shù)高，微生物種類繁多，盒裝北豆腐經(jīng)殺菌處理，微生物多樣性較單一，主要為乳酸乳球菌。從北豆腐成品中分離出5 株優(yōu)勢菌，經(jīng)16S rDNA鑒定為乳酸乳球菌、吉氏庫特氏菌、產(chǎn)氣腸桿菌、短穩(wěn)桿菌及枯草芽孢桿菌。腐敗菌回接實驗表明，微生物數(shù)量達107CFU/g時，豆腐開始產(chǎn)生較明顯的腐敗現(xiàn)象，乳酸乳球菌產(chǎn)酸使豆腐pH值下降，其余4 種優(yōu)勢菌可導致北豆腐顏色變化、質(zhì)地變軟、產(chǎn)生不良氣味，嚴重影響產(chǎn)品品質(zhì)及安全性。

豆制品企業(yè)加工過程浸泡、制漿工序中由于原料攜帶大量微生物且條件適宜，微生物污染嚴重，主要污染微生物為乳酸乳球菌、產(chǎn)氣腸桿菌和短穩(wěn)桿菌，經(jīng)煮漿后微生物數(shù)量大幅下降，僅為24 CFU/g，經(jīng)點腦、壓榨成型、冷卻、分割后的成品微生物數(shù)量上升，經(jīng)殺菌后成品微生物數(shù)量控制在102CFU/g。本研究發(fā)現(xiàn)，通過低耗水制漿技術(shù)可減少工藝用水量并縮短耗時，有效控制浸泡及制漿過程中微生物數(shù)量，降低加工過程中微生物對產(chǎn)品加工穩(wěn)定性及安全性的影響，為傳統(tǒng)豆制品的標準化控制及工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。