郭 琦，高春燕*

（大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，云南 大理 671000）

硬毛地筍（Lycopus lucidus Turcz.）又名蟲草參、地參，為唇形科澤蘭屬多年生草本植物，具有很高的營養(yǎng)及保健功效，是藥食兼用的佳品，享有“植物珍品”、“山中之王”的美稱，曬干后可入藥，其功能與冬蟲夏草相似[1]。硬毛地筍資源豐富，主要分布在云南昆明、大理、麗江等少數(shù)民族聚居地區(qū)，以大理地區(qū)分布最為廣泛，且品質(zhì)最優(yōu)。已有的研究表明該屬植物的主要成分有揮發(fā)油、黃酮類、酚類、三萜類、糖類及酸類化合物[2-5]，具有很好的抗菌、抗氧化、降血脂、降血糖等多種生理功效[6-16]。大量的研究表明，酚類化合物是良好的還原劑、金屬離子螯合劑、單線態(tài)氧淬滅劑及供氫體，具有較強(qiáng)的抗氧化活性[17-25]。

DNA是生命的重要遺傳物質(zhì)，控制細(xì)胞的增殖與分化。自由基是帶有未成對(duì)電子的分子與離子，具有較高的反應(yīng)活性。細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的自由基可以攻擊DNA，造成嚴(yán)重的DNA氧化損傷，進(jìn)而引起遺傳物質(zhì)的改變。其中，過氧自由基（ROO·）可對(duì)DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖類等生物大分子造成嚴(yán)重的氧化損傷，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡與組織損傷，進(jìn)而引起多種疾病的產(chǎn)生，如癌癥、慢性炎癥、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病等。王長松等[26]曾對(duì)5 種中藥酚酸類化合物體外抗DNA損傷的作用進(jìn)行研究，但有關(guān)硬毛地筍酚類化合物對(duì)DNA損傷保護(hù)作用的研究尚鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過體外2,2-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽（2,2-azobis(2-methylpropionamidine)dihydrochloride，AAPH）引發(fā)ROO·損傷pBR322質(zhì)粒DNA模型，對(duì)硬毛地筍酚類化合物保護(hù)ROO·介導(dǎo)的DNA損傷作用進(jìn)行研究，旨在為硬毛地筍及天然抗氧化劑的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

硬毛地筍：分別于2016年11月16日（T1）、2016年12月15日（T2）和2017年1月14日（T3）采于云南大理劍川縣沙溪鎮(zhèn)四聯(lián)村，洗凈烘干、粉碎，凍存?zhèn)溆谩２牧辖?jīng)大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院中藥研究所鑒定為唇形科澤蘭屬多年生草本植物硬毛地筍（L. lucidus Turcz.）。

咖啡酸、迷迭香酸、沒食子酸、福林-酚試劑、水溶性VE（Trolox）、pBR322質(zhì)粒DNA 美國Sigma公司；甲醇、冰乙酸（色譜純） 美國Thermo Fisher公司；甲醇、乙酸乙酯、AAPH、Tris、瓊脂糖均為國產(chǎn)分析純。1.2 儀器與設(shè)備

Scientz-ND系列真空冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；WFJ 2000型紫外-可見分光光度計(jì)上海尤尼科儀器有限公司；1200高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀、ZORBAX SB-C18色譜柱 美國Agilent公司；DYY-6C型電泳儀 北京市六一儀器廠；Image Quant 300 CCD凝膠成像分析系統(tǒng) 美國通用電器公司。

1.3 方法

1.3.1 硬毛地筍酚類化合物的提取

參考文獻(xiàn)[27]的方法，稍作修改后進(jìn)行提取。準(zhǔn)確稱取硬毛地筍粉末5 g，用體積分?jǐn)?shù)80%甲醇溶液于室溫下超聲波輔助提取3 次，每次10 min，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去甲醇。水相用HCl溶液將pH值調(diào)節(jié)至1～2，然后用乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙酸乙酯，剩余殘留物冷凍干燥，得游離酚（free phenolics，F(xiàn)P）提取物。FP提取后所得殘?jiān)尤隢aOH溶液（含乙二胺四乙酸（ethylene diaminete traacetic acid，EDTA）和抗壞血酸），在氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫振蕩水解4 h。待水解完畢，用HCl溶液將pH值調(diào)節(jié)至1～2，真空抽濾，濾液經(jīng)乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙酸乙酯，剩余殘留物冷凍干燥，得到不溶性細(xì)胞壁結(jié)合酚（insoluble cell wall bound phenolics，ICP）提取物。

1.3.2 硬毛地筍提取物酚含量的測(cè)定

提取物酚含量采用福林-酚法測(cè)定[28-29]，得到?jīng)]食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝0.096 5x+0.097 4（0～6.4 μg/mL），相關(guān)系數(shù)R＝0.991 7。樣品中酚含量以每毫克提取物中沒食子酸質(zhì)量表示（μg/mg）。

1.3.3 硬毛地筍酚類化合物HPLC分析

采用HPLC法對(duì)硬毛地筍FP和ICP提取物的組成進(jìn)行分析，條件如下：ZORBAX SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流速1 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長為320 nm。流動(dòng)相A為體積分?jǐn)?shù)100%甲醇，流動(dòng)相B為甲醇-冰乙酸-超純水溶液（體積比為1∶10∶89）。梯度洗脫程序如下：FP提取物：0～1 min：15%流動(dòng)相A；1～16 min：15%～25%流動(dòng)相A；16～18 min：25%流動(dòng)相A；18～30 min：25%～30%流動(dòng)相A；30～35 min：30%～40%流動(dòng)相A；35～40 min：40%～20%流動(dòng)相A；40～43 min：20%～15%流動(dòng)相A；ICP提取物：0～1 min：20%流動(dòng)相A；1～16 min：20%～38%流動(dòng)相A；16～18 min：38%流動(dòng)相A；18～30 min：38%～60%流動(dòng)相A；30～35 min：60%流動(dòng)相A；35～40 min：60%～20%流動(dòng)相A；40～43 min：20%流動(dòng)相A。

以迷迭香酸和咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)品制作回歸曲線，得到回歸方程如下：FP提取物：y＝20.75x-335.16（R＝0.998 5，40～200 μg/mL）和y＝65.704x-989.22（R＝0.992 5，40～200 μg/mL）；ICP提取物：y＝14.186x-54.828（R＝0.991 4，5～40 μg/mL）和y＝53.679x-166.8（R＝0.993 4，5～40 μg/mL）。

1.3.4 硬毛地筍酚類化合物對(duì)ROO·介導(dǎo)的DNA損傷保護(hù)作用的測(cè)定

參考Spanou等[30]的方法略作修改。將FP和ICP提取物分別配制成質(zhì)量濃度為2、4、6、8、10 mg/mL的待測(cè)液，反應(yīng)液共20 μL，包括1 μL 0.5 μg/L pBR322質(zhì)粒DNA、11 μL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（10 mmol/L，pH 7.4）、5 μL待測(cè)液和3 μL AAPH溶液（50 mmol/L，PBS溶解）充分混勻，置于37 ℃水浴鍋中避光反應(yīng)45 min。待反應(yīng)結(jié)束后，取出4 μL反應(yīng)液并加入2 μL loading buffer（質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.15%溴酚藍(lán)溶液、10 mmol/L EDTA和質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%蔗糖溶液），混勻后吸取4 μL置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%瓊脂糖凝膠（含0.5 μg/mL溴化乙錠）中，于Tris/乙酸/EDTA緩沖液中電泳50 min。待電泳結(jié)束，用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析?？瞻讓?duì)照用PBS代替提取液，正常對(duì)照用PBS代替提取液和AAPH溶液，用人工合成抗氧化劑Trolox作為陽性對(duì)照組。按下式計(jì)算雙螺旋比例。

式中：A1為雙螺旋DNA的灰度值；A2為開環(huán)型DNA的灰度值；A3為線性DNA的灰度值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 硬毛地筍酚類化合物提取物的酚含量

表1 硬毛地筍酚類化合物提取物的酚含量Table1 Phenolic contents of L. lucidus Turcz. on different dates μg/mg

從表1可以看出，采收期對(duì)硬毛地筍酚類化合物提取物酚含量的影響具有顯著性。FP提取物的酚含量在T1和T2采收期之間無顯著性差異，在T3采收期時(shí)顯著下降；而ICP提取物隨著采收期的延后其酚含量呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)。

2.2 硬毛地筍酚類化合物組成的分析

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品及FP和ICP提取物的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms of phenolic standards, FP and ICP

表2 硬毛地筍酚類化合物提取物中迷迭香酸和咖啡酸的含量Table2 Contents of rosmarinic acid and caffeic acid in phenolic extracts from L. lucidus Turcz.μg/mg

從圖1可以看出，硬毛地筍ICP提取物中分離出的色譜峰多于FP提取物。表2結(jié)果表明，不同的酚類化合物在硬毛地筍FP和ICP提取物中的質(zhì)量濃度具有明顯差異。在FP提取物中，迷迭香酸是主要的酚類化合物，而咖啡酸質(zhì)量濃度較低甚至未檢出；相反地，在ICP提取物中，咖啡酸是主要的酚類化合物，而迷迭香酸質(zhì)量濃度較低。這可能是因?yàn)樵贗CP提取過程中使用NaOH水解，使咖啡酸苷類化合物在堿性條件下水解，從而導(dǎo)致咖啡酸質(zhì)量濃度升高。此外，采收期對(duì)迷迭香酸和咖啡酸在FP和ICP提取物中質(zhì)量濃度的影響不同。在FP提取物中，迷迭香酸的質(zhì)量濃度在T1和T2采收期之間無顯著性差異，從T2到T3采收期下降了37%，這與其酚含量的變化趨勢(shì)基本一致；在ICP提取物中，這兩種化合物的質(zhì)量濃度隨著采收期的延后均呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(shì)，這與酚含量的變化趨勢(shì)相反，表明其他未鑒定出的酚類物質(zhì)對(duì)總酚含量的變化也具有顯著的貢獻(xiàn)。

2.3 硬毛地筍酚類化合物提取物對(duì)ROO·介導(dǎo)的DNA損傷的保護(hù)作用

硬毛地筍酚類化合物對(duì)ROO·介導(dǎo)的DNA損傷的保護(hù)作用以DNA雙螺旋比例進(jìn)行表征，雙螺旋比例越高，表明其對(duì)DNA損傷的保護(hù)作用越強(qiáng)。由圖2可以看出，正常pBR322質(zhì)粒DNA以雙螺旋結(jié)構(gòu)為主，被ROO·損傷后，雙螺旋DNA轉(zhuǎn)變成了開環(huán)型甚至是線型結(jié)構(gòu)，當(dāng)添加硬毛地筍酚類化合物提取物和Trolox后，未觀察到雙鏈斷裂后的線性DNA分子，表明硬毛地筍酚類化合物提取物和Trolox可以阻止ROO·介導(dǎo)的DNA雙鏈的斷裂。

圖2 硬毛地筍酚類化合物和Trolox對(duì)ROO·介導(dǎo)的DNA損傷的保護(hù)作用Fig.2 Protective effects of phenolic compounds from L. lucidus Turcz.and Trolox on ROO·-mediated DNA damage

硬毛地筍FP和ICP提取物對(duì)DNA損傷的保護(hù)作用不同。就FP提取物而言：在2～10 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，T1采收期的雙螺旋比例在87.52%～89.52%范圍內(nèi)，且隨FP提取物質(zhì)量濃度的增加，保護(hù)作用無顯著性變化（P＞0.05）；T2采收期雙螺旋比例在64.57%～90.32%范圍內(nèi)，當(dāng)FP提取物質(zhì)量濃度由2 mg/mL增加至4 mg/mL時(shí)，保護(hù)作用顯著升高（P＜0.05），但在4～10 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)時(shí)，保護(hù)作用隨質(zhì)量濃度的增加而顯著降低（P＜0.05）；T3采收期雙螺旋比例在65.71%～92.35%范圍內(nèi)，2～8 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)保護(hù)作用無顯著差異（P＞0.05），當(dāng)質(zhì)量濃度由8 mg/mL上升至10 mg/mL時(shí)，保護(hù)作用顯著下降（P＜0.05）。就ICP提取物而言：在2～10 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，T1采收期的雙螺旋比例在4.4%～71.9%范圍內(nèi)，當(dāng)質(zhì)量濃度由2 mg/mL增加至4 mg/mL時(shí)，保護(hù)作用顯著下降（P＜0.05），但4～10 mg/mL范圍內(nèi)保護(hù)作用隨著質(zhì)量濃度增加而顯著上升（P＜0.05）；T2采收期雙螺旋比例在3.09%～75.49%之間，保護(hù)作用隨著質(zhì)量濃度的增加而顯著升高（P＜0.05）；T3采收期雙螺旋比例在2.25%～65.94%之間，在2～6 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)保護(hù)作用無顯著性差異（P＞0.05），當(dāng)質(zhì)量濃度由6 mg/mL上升至10 mg/mL時(shí)，保護(hù)作用隨著質(zhì)量濃度的增加而顯著上升（P＜0.05）。

Trolox對(duì)ROO·介導(dǎo)的DNA損傷具有顯著的保護(hù)作用，在25～400 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，Trolox的雙螺旋比例在30.46%～92.28%之間，當(dāng)質(zhì)量濃度在25～200 μg/mL范圍內(nèi)時(shí)，保護(hù)作用隨著質(zhì)量濃度的增加而顯著上升（P＜0.05）；進(jìn)一步增加質(zhì)量濃度，保護(hù)作用未顯著上升（P＞0.05）。與Trolox相比，2～10 mg/mL范圍內(nèi)的FP提取物最大保護(hù)作用接近于200～400 μg/mL范圍內(nèi)Trolox的最大保護(hù)作用，而ICP提取物在測(cè)定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的最大保護(hù)作用小于Trolox?？梢钥闯?，F(xiàn)P提取物對(duì)DNA損傷的保護(hù)作用顯著強(qiáng)于ICP提取物，這與其酚類化合物組成不同有關(guān)。

2.4 相關(guān)性分析

表3 提取物酚含量與DNA損傷保護(hù)作用的相關(guān)性分析Table3 Correlational analysis between phenolic contents and protective effects on DNA damage

由表3可以看出，T2和T3采收期的ICP提取物酚含量與保護(hù)ROO·介導(dǎo)的DNA損傷的作用具有顯著的正相關(guān)性，說明提取物中的酚類物質(zhì)對(duì)DNA損傷的保護(hù)作用具有顯著的貢獻(xiàn)；而其他提取物中的酚含量與保護(hù)DNA損傷的作用沒有顯著的正相關(guān)性，甚至出現(xiàn)負(fù)相關(guān)，說明其保護(hù)作用不僅與酚含量有關(guān)，還與酚類化合物的組成有關(guān)。硬毛地筍酚類化合物可能通過其主要成分，也可能通過其各成分之間的協(xié)同作用發(fā)揮保護(hù)DNA損傷的作用。

3 結(jié) 論

不同采收期對(duì)硬毛地筍酚類化合物提取物酚含量的影響具有顯著差異。硬毛地筍酚類化合物提取物中共鑒定出2 種化合物，分別為咖啡酸和迷迭香酸，不同化合物在FP和ICP提取物中的質(zhì)量濃度具有明顯差異。硬毛地筍酚類化合物對(duì)ROO·介導(dǎo)的DNA損傷具有顯著的保護(hù)作用，但不同組分酚類化合物的保護(hù)作用存在差異，其中FP提取物對(duì)DNA損傷的保護(hù)作用明顯強(qiáng)于ICP提取物。