張海耿， 單建軍， 顧川川， 管崇武， 張宇雷， 倪 琦

(農(nóng)業(yè)部漁業(yè)裝備與工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院漁業(yè)機(jī)械儀器研究所，上海 200092)

循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)(RAS)模式逐漸在世界各國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域得到重視和應(yīng)用，是未來(lái)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的主要發(fā)展方向之一。生物濾器的生物過(guò)濾環(huán)節(jié)是循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)水處理的核心部分，生物濾器在正常運(yùn)轉(zhuǎn)前需對(duì)濾器中的微生物進(jìn)行掛膜培養(yǎng)，生物濾器常見的啟動(dòng)方式主要有自然掛膜法、微生物接種掛膜法和活性污泥掛膜法[1-3]。流化床生物濾器是一種極具開發(fā)潛力和競(jìng)爭(zhēng)力的生物過(guò)濾器，具有高效、可控、占地面積小等優(yōu)點(diǎn)，逐漸在循環(huán)水養(yǎng)殖領(lǐng)域推廣應(yīng)用[4]。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)流化床生物濾器的研究主要集中于裝置的結(jié)構(gòu)[5]、水力特性[6]、硝化性能[7]等方面，對(duì)于該濾器掛膜方式的研究還鮮有報(bào)道。不同的掛膜方式可能會(huì)影響生物濾器中微生物的生長(zhǎng)與繁殖，而生物濾器中載體表面微生物群落的變化和代謝情況又與濾器的水處理性能密切相關(guān)[8]。因此，開展流化床生物濾器掛膜方式研究有助于更深入地了解流化床生物濾器的運(yùn)行特征及凈水機(jī)制。

高通量測(cè)序技術(shù)作為新一代測(cè)試技術(shù)，可全面精準(zhǔn)地分析不同領(lǐng)域中的微生物的豐度和群落特征。目前，該技術(shù)已在環(huán)境工程[9-10]、農(nóng)學(xué)[11-12]、生命科學(xué)[13-14]、海洋科學(xué)[15-16]等領(lǐng)域逐漸得到應(yīng)用，同樣，該技術(shù)也為揭示流化床生物濾器的掛膜過(guò)程及凈水機(jī)制提供了可能。

本研究構(gòu)建了2套中華鱘循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)，生物過(guò)濾環(huán)節(jié)采用流化床生物濾器，并選用玻璃微珠為濾器的填料；分析在自然掛膜法和微生物接種掛膜法兩種啟動(dòng)方式下流化床生物濾器的掛膜過(guò)程，并采用高通量測(cè)序方法，研究不同時(shí)期流化床生物濾器中微生物群落的變化，旨在研究不同啟動(dòng)方式對(duì)流化床生物濾器中微生物群落的結(jié)構(gòu)變化和種類的影響，以期了解流化床生物濾器的凈水機(jī)制，并通過(guò)優(yōu)化濾器啟動(dòng)時(shí)的運(yùn)行參數(shù)，為其在循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中的高效運(yùn)行提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 中華鱘循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)

試驗(yàn)在中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院漁業(yè)機(jī)械儀器研究所如東中試基地的2套R(shí)ASs中進(jìn)行。該系統(tǒng)主要由養(yǎng)殖池、豎流沉淀池、微濾機(jī)、調(diào)節(jié)池、流化床生物濾器、低壓純氧混合裝置(LHO)和紫外殺菌裝置組成(圖1)，總水體約80 m3。其中，養(yǎng)殖池為方形圓角池，池深1.6 m，有效水體70 m3；流化床生物濾器筒體直徑1.2 m，高3 m，濾料放置高度1.2 m，濾器布水方式采用底部雙切向進(jìn)水，通過(guò)漩渦流推動(dòng)濾料均勻向上膨脹；離心泵流量50 m3/h，養(yǎng)殖水體循環(huán)量1.6 h/次。每天對(duì)養(yǎng)殖池及豎流沉淀池定時(shí)排污，RAS每天的補(bǔ)水量約為總水體的3%。

試驗(yàn)養(yǎng)殖對(duì)象中華鱘，初始平均質(zhì)量(40.22±1.05) kg，每個(gè)池子放12尾，初始投放密度6.8 kg/m2，日投飼率為體質(zhì)量的0.3%。試驗(yàn)期間，養(yǎng)殖水溫控制于(18±1)℃，溶氧(DO)>7 mg/L。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在流化床生物濾器運(yùn)行5 d、25 d、60 d，分3次采集生物膜樣品，每次采集3個(gè)樣品。其中，試驗(yàn)組樣品記為A、B、C，對(duì)照組樣品記為D、E、F。采樣點(diǎn)為流化床生物濾器的中部區(qū)域，樣品采集后迅速放置-20 ℃保存，等樣品全部采齊后，一起送美吉生物有限公司進(jìn)行分析。

1.3 樣品測(cè)序

對(duì)樣品進(jìn)行總DNA提取，而后采用細(xì)菌通用引物27F(5-AGAGTTTGATCCTGGCTACAG-3)和533R(5-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3)對(duì)樣品進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增(PCR)。PCR反應(yīng)過(guò)程為95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min。而后，將擴(kuò)增產(chǎn)物使用2%瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳分析，在Roche 454 GS FLX+ Titanium平臺(tái)上進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.4 生物信息學(xué)分析

利用Uparse (version 7.1) 對(duì)樣品的有效序列進(jìn)行聚類，默認(rèn)將97%相似水平的序列類聚成操作分類單元(OTU)。采用RDP classifier 貝葉斯算法對(duì)TU進(jìn)行分類學(xué)分析，并將OTU選取的代表性序列與silva(SSU123)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比[17]，利用Mothur 軟件構(gòu)建稀釋性曲線(rarefaction curve)[18]，并計(jì)算Shannon 指數(shù)[19]。

1.5 水質(zhì)測(cè)定方法及數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與討論

2.1 兩種掛膜方式下流化床生物濾器的啟動(dòng)過(guò)程

圖2顯示了不同掛膜方式流化床生物濾器進(jìn)出水TAN變化情況。由圖2可知，掛膜初期，由于生物膜尚未成熟，濾器對(duì)TAN的去除能力較弱，系統(tǒng)中TAN質(zhì)量濃度逐漸升高。隨著掛膜時(shí)間的延長(zhǎng)，TAN開始下降，對(duì)照組對(duì)TAN的去除速度快于試驗(yàn)組，經(jīng)過(guò)約1個(gè)月的掛膜，生物濾器可將系統(tǒng)中的TAN質(zhì)量濃度維持在0.2 mg/L，說(shuō)明在該工況下流化床生物濾器可成功啟動(dòng)。

圖2 不同掛膜方式下流化床生物濾器進(jìn)出水TAN變化情況

圖3 不同掛膜方式下流化床生物濾器進(jìn)出水變化情況

2.2 不同工況下流化床生物濾器微生物群落結(jié)構(gòu)變化

2.2.1 不同樣品堿基序列分布及生物多樣性

測(cè)序結(jié)束后將測(cè)序接頭及引物序列去除，并對(duì)處理后的有效序列進(jìn)行數(shù)據(jù)及長(zhǎng)度分布統(tǒng)計(jì)。為提高后續(xù)生物信息分析的準(zhǔn)確性，對(duì)有效序列進(jìn)行優(yōu)化，包括：1)利用特異性引物信息將非特異性擴(kuò)增片段序列去除；2)丟棄長(zhǎng)度短于150 bp、含有模糊堿基(Ns)、引物堿基含2個(gè)以上錯(cuò)配、單堿基重復(fù)超過(guò)6個(gè)的序列，采用焦磷酸測(cè)試方式對(duì)該樣品進(jìn)行了系統(tǒng)分析。6個(gè)樣品共測(cè)得堿基序列34 130條，平均堿基長(zhǎng)度為437 bp。

將優(yōu)化序列截齊后，與SILVA106庫(kù)比對(duì)進(jìn)行聚類，利用焦磷酸測(cè)序法可以獲得更豐富的生物信息，而且即使測(cè)序序列數(shù)量超過(guò)6 000，仍有新的OTU可以測(cè)出。本研究中6個(gè)樣本的測(cè)序深度指數(shù)均高于0.9(P<0.1)，即樣本OTU可以有效表征樣本中微生物種群。從多樣性指標(biāo)分析，隨著掛膜天數(shù)的增加，兩種掛膜方式下微生物的種類在逐漸增加，掛膜60 d后，兩種工況下樣品的多樣性指數(shù)分別為3.42和3.21，說(shuō)明采用自然掛膜的方式，生物膜成熟后細(xì)菌的群落多樣性更高。

2.2.2 不同工況下樣品的物種差異

Venn圖更能直觀地反映載體表面不同階段微生物種類的差別(圖4)。兩種掛膜方式下，隨著掛膜時(shí)間的增加，載體上的微生物種類有一定的變化，不同時(shí)期存在一些各自特有的種屬和共有的種屬。采用自然掛膜方式時(shí)，有13個(gè)OTU一直存在于掛膜的各個(gè)時(shí)期，A期和B期、B期和C期、A期和C期的相似性指數(shù)分別為32.8、39.3和19.1，相鄰時(shí)期的相似性指數(shù)較大，表明不同時(shí)期生物載體上微生物的群落結(jié)構(gòu)是在變化的，但是演替的過(guò)程是緩慢而有規(guī)律的，這樣馴化成功的生物膜不容易脫落，比較穩(wěn)定。而采用添加微生態(tài)制劑掛膜時(shí)，有12個(gè)OTU一直存在于掛膜的各個(gè)時(shí)期，D期和E期、E期和F期、D期和F期的相似性指數(shù)分別為15.8、67.5和15.7，其中，D期和E期、D期和F期的相似性指數(shù)相對(duì)偏低，D期檢測(cè)的OUT也相對(duì)偏少，說(shuō)明微生態(tài)制劑里本身的菌種在載體掛膜時(shí)豐度不高，并且隨著時(shí)間的推移，逐漸被其他優(yōu)勢(shì)菌所取代，微生態(tài)制劑中菌種本身的功能并未發(fā)揮應(yīng)有的作用。

圖4 不同樣品Venn圖

2.2.3 不同工況下樣品的群落結(jié)構(gòu)分布

自然掛膜5 d時(shí)，載體表面微生物種類較少，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌是厚壁菌門(Firmicutes，99.75%)。Lan等[21]認(rèn)為厚壁菌與脫氮相關(guān)，在有氧或缺氧的環(huán)境中能夠進(jìn)行硝化、反硝化過(guò)程。當(dāng)載體掛膜25 d時(shí)，微生物的種類逐漸增多，但優(yōu)勢(shì)種類仍是厚壁菌門(Firmicutes，84.57%)，其次為放線菌門(Actinobacteria，10.82%)和變形菌門(Proteobacteria，3.68%)。隨著掛膜天數(shù)的增加，載體表面門水平的微生物種類更加豐富，共篩選出15個(gè)門，包括厚壁菌門(Firmicutes，45.18%)、變形菌門(Proteobacteria，22.57%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，7.74%)、放線菌門(Actinobacteria，7.68%)、Candidate_division_TM7(6.73%)、浮霉菌門(Planctomycetes，3.7%)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes，1.86%)、綠彎菌門(Chlorobi，2.19%)、酸桿菌門(Acidobacteria，0.86%)、Candidate_division_OD1(0.64%)、綠菌門(Chlorobi，0.38%)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae，0.35%)、纖維桿菌門(Fibrobacteres，0.05%)、藍(lán)藻門(Cyanobacteria，0.04%)、疣微菌門(Verrucomicrobia，0.02%)。

掛膜初期，微生態(tài)制劑中細(xì)菌的種類并不多，其優(yōu)勢(shì)菌種為厚壁菌門(Firmicutes，99.06%)，另篩選出Candidate_division_TM7(0.04%)和Candidate_division_OD1(0.02%)兩類門，該菌群在前者工況下中后期才穩(wěn)定成熟，說(shuō)明微生態(tài)制劑的添加在一定程度上豐富了生物濾器中細(xì)菌的種類。與采用自然掛膜方式相似，隨著掛膜天數(shù)的增加，其載體表面門的種類逐漸增多。當(dāng)掛膜60 d時(shí)，共篩選出18個(gè)門，其優(yōu)勢(shì)菌群為擬桿菌門(Bacteroidetes，48.75%)、變形菌門(Proteobacteria，41.09%)和厚壁菌門(Firmicutes，4.93%)，并篩選出螺旋菌門(Spirochaetae，0.08%)、軟壁菌門(Tenericutes，0.04%)和Candidate_division_SR1(0.02%)等在自然工況沒(méi)有出現(xiàn)的新型菌門。

將樣品中的微生物繼續(xù)細(xì)分至細(xì)菌屬可以更好地了解微生物在流化床中的功能，通過(guò)與SILVA106數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，共鑒定出156個(gè)微生物屬，與之前研究相比(10～40 種微生物)[22-24]，利用高通量測(cè)序可以更全面地了解生物過(guò)濾中微生物的組成，更好地了解污染物的去除機(jī)理。2種掛膜方式下，掛膜初期微生物種類較少，主要以厚壁菌門中的芽胞桿菌(Bacillus)為主。隨著掛膜天數(shù)的逐漸增加，其微生物種類在不斷豐富。屈撓桿菌屬(Flexibacter)是擬桿菌門(Bactervidetes)中的一類細(xì)菌，革蘭氏陰性菌在一些自然及人工的污水處理系統(tǒng)均有被檢測(cè)到[25]。另外，自然掛膜方式下，篩選出的功能性細(xì)菌，其比例高于采用接種掛膜方式。黃桿菌屬(Flavobacterium)是一類兼性厭氧細(xì)菌 ，能在低氧情況下硝酸鹽被轉(zhuǎn)化成各種還原性產(chǎn)物[26-27]，說(shuō)明濾器中存在一定的反硝化過(guò)程。占α-Proteobacteria綱一定比例的Rhodobacter菌屬是一種紫色非硫細(xì)菌( purple nonsulfur bacteria) ，這種細(xì)菌的最大特點(diǎn)是能夠利用多種有機(jī)物作為碳源進(jìn)行異養(yǎng)的光合代謝反應(yīng)，基質(zhì)利用的多樣性使得它們?cè)跒V器中具有一定的優(yōu)勢(shì)[28-29]，從而成為優(yōu)勢(shì)菌屬出現(xiàn)在生物膜的中后期。

3 結(jié)論

流化床生物濾器采用自然掛膜或添加微生物制劑都可成功啟動(dòng)，但通過(guò)添加微生態(tài)制劑可縮短濾器的掛膜時(shí)間。兩種掛膜方式下，相鄰時(shí)期微生物的相似性指數(shù)較大，表明不同時(shí)期生物載體上微生物的群落結(jié)構(gòu)是在變化的，但是演替的過(guò)程是緩慢而有規(guī)律的。采用自然掛膜的方式，生物膜成熟后細(xì)菌的群落多樣性高于接種微生態(tài)制劑，說(shuō)明自然掛膜方式微生物群落結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。掛膜初期，兩類工況下載體表面微生物種類較少，其優(yōu)勢(shì)細(xì)菌都是厚壁菌門，隨著掛膜天數(shù)的增加，其載體表面微生物種類逐漸增多，通過(guò)與SILVA106數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，共鑒定出156個(gè)微生物屬。另外，自然掛膜方式下，篩選出的功能性細(xì)菌的比例高于采用接種掛膜方式，如黃桿菌屬(Flavobacterium)和紫色非硫細(xì)菌(purple nonsulfur bacteria)等，在養(yǎng)殖水體中污染物的轉(zhuǎn)化及去除方面起著重要的作用,說(shuō)明采用自然掛膜法更利于流化床生物濾器的穩(wěn)定運(yùn)行。

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