郁 省, 王 杰, 顏丙春

(1. 江蘇省揚州市婦幼保健院, 江蘇 揚州, 225002; 2. 揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 江蘇 揚州, 225001)

腦卒中具有高發(fā)病率、高死亡率和高致殘率等特點，嚴(yán)重危害人類的健康[1-3]。氧化應(yīng)激在腦缺血損傷中發(fā)揮著重要的作用[4]。8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)是DNA氧化損傷的標(biāo)志物，它能觸發(fā)多種細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路，導(dǎo)致神經(jīng)細胞的損傷及凋亡[5-7]。近年來，兒童缺血性腦卒中的發(fā)病比例也逐年上升，已成為兒童期重要的致殘性疾病之一[8]。研究[9-10]表明幼齡沙鼠具有抗腦缺血的能力。本研究通過短暫性雙側(cè)頸總動脈夾閉、再灌注模型，觀察短暫性腦缺血再灌注后不同時間點幼齡沙鼠海馬CA1與DG區(qū)8-OHdG免疫活性的變化，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取清潔級雄性蒙古沙土鼠，幼年鼠體質(zhì)量25～30 g, 1月齡; 成年鼠體質(zhì)量65～75 g, 6月齡，由韓國江原大學(xué)實驗動物中心提供。所有動物適應(yīng)環(huán)境1周后開始實驗，模型建立過程中盡可能減少動物的痛苦和動物使用的數(shù)量，整個實驗程序都符合當(dāng)前國際動物實驗使用指南標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 實驗儀器與試劑

冰凍切片機CM1950(萊卡，德國); 異氟烷(瑞沃德，中國); 小動物麻醉機(Midmark, 美國); 電子顯微鏡(尼康，日本); 甲酚紫(Sigma); 8-OHdG抗體(Abcam公司); Fluoro-Jade B (Histochem, Jefferson, AR); ELISA試劑盒(科能生物技術(shù)有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組、短暫性腦缺血模型的制備: 以清潔級蒙古沙土鼠短暫性雙側(cè)頸總動脈夾閉、再灌注模型(夾閉時間為5 min)制作缺血后再灌注模型(模型制備方法參考文獻[10])。實驗設(shè)有幼年組(1個月齡沙鼠,n=60)和成年組(6個月齡沙鼠,n=60), 幼年組和成年組又隨機分為假手術(shù)組(n=30)和手術(shù)組(n=30)。缺血再灌注手術(shù)后，實驗動物按照術(shù)后6 h、1 d、7 d依次處死，每次處死10只; 一部分沙鼠經(jīng)10%水合氯醛麻醉后進行心臟灌流并固定，腦取出后利用低溫恒溫組織切片機連續(xù)切取厚度為30 μm的腦組織并將其儲存在PBS溶液中備用; 另外一部分沙鼠經(jīng)10%水合氯醛麻醉后斷頭取腦，將分離的海馬置于EP管內(nèi)，存放于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 組織處理及染色: ① 甲酚紫染色: 選出備好的腦組織切片(海馬部分)并將其貼附在用明膠處理過的玻片上，然后按照甲酚紫的步驟進行染色，最后脫水并用松脂溶液蓋玻(具體參考文獻[11])。② Fluoro-Jade B(F-JB)組織熒光染色: 首先，將選好的腦組織切片放入高錳酸鉀溶液中處理20 min，再放入0.000 4% Fluoro-Jade B的溶液中染色30 min, 最后干燥后利用顯微鏡照相。注意全過程要進行避光處理。③ 免疫組化染色: 將選好的腦組織切片在0.3%過氧化氫溶液處理30 min，然后分別在goat anti-8-OHdG(1︰500)的溶液中培養(yǎng)過夜; 再將組織切片進行二抗及ABC處理，通過DAB進行顯色。將組織貼片、脫水后，用加拿大香脂膠蓋片。為了確認染色的特異性，對照染色用免疫血清來代替一抗，其他步驟一致。④ 腦組織8-OHdG含量測定: 將-80 ℃中的腦組織取出，分別加入1 mL PBS液充分勻漿; 3 000轉(zhuǎn)/min離心20 min, 收集上清液。采用雙抗體夾心法[酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)], 在小鼠8-OHdG抗體包被的微孔板中加入含8-OHdG的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品，與辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的8-OHdG抗體結(jié)合形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，徹底洗滌后甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色，用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測量各孔吸光度(A)。結(jié)果以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo), A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品A由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得相應(yīng)濃度，再乘以稀釋倍數(shù)即為樣品的實際濃度。

1.4 成像和統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 缺血再灌注后沙鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的死亡情況

幼年沙鼠具有抗腦缺血損傷的能力。甲酚紫染色用于標(biāo)記腦組織中的尼氏小體, F-JB染色主要用于標(biāo)記死亡的神經(jīng)元。結(jié)果顯示，成年沙鼠CA1區(qū)遲發(fā)性神經(jīng)元的死亡主要發(fā)生于缺血再灌注4 d。幼齡沙鼠CA1區(qū)遲發(fā)性神經(jīng)元的死亡主要發(fā)生于缺血再灌注7 d, 且死亡的神經(jīng)元較成年沙鼠少。見圖1、2。

A、B、C: 甲酚紫染色，分別顯示成年沙鼠對照組、缺血再灌注4 d、缺血再灌注7 d 海馬CA1區(qū)尼氏小體(200倍);D、E、F: 甲酚紫染色，分別顯示幼齡沙鼠對照組、缺血再灌注4 d、缺血再灌注7 d 海馬CA1區(qū)尼氏小體(200倍);A1、B1、C1: F-JB染色，分別顯示成年沙鼠對照組、缺血再灌注4 d、缺血再灌注7 d 海馬CA1區(qū)死亡的神經(jīng)元(200倍);D1、E1、F1: F-JB染色，分別顯示幼齡沙鼠對照組、缺血再灌注4 d、缺血再灌注7 d海馬CA1區(qū)死亡的神經(jīng)元(200倍)圖1 成年與幼齡沙鼠缺血再灌注后海馬CA1區(qū)甲酚紫染色及F-JB染色的免疫組織化學(xué)法結(jié)果比較

G: 甲酚紫染色柱狀圖; H: F-JB染色柱狀圖。與Sham組比較, *P<0.05; 與成年組比較, #P<0.05。

圖2成年與幼齡沙鼠缺血再灌注后海馬CA1區(qū)甲酚紫染色及F-JB染色表達比較(n=5)

2.2 缺血再灌注后沙鼠海馬CA1及DG區(qū)8-OHdG免疫活化的情況

結(jié)果顯示，成年沙鼠海馬CA1及DG區(qū)8-OHdG免疫活性于缺血再灌注后6 h增至最高，之后逐漸下降。幼齡沙鼠海馬CA1及DG區(qū)的8-OHdG免疫活性變化趨勢與成年沙鼠相同，但整體水平較成年沙鼠低，且變化差異不明顯。見圖3、4、5、6。

2.3 缺血再灌注后沙鼠海馬8-OHdG含量的變化

成年沙鼠海馬8-OHdG的含量于缺血再灌注后6 h升至最高，隨后逐漸下降，于第7天時恢復(fù)至正常水平。另外，幼齡沙鼠缺血損傷后海馬8-OHdG的含量變化趨勢與成年沙鼠相同，但整體水平明顯較成年沙鼠低。見圖7。

3 討 論

本課題組前期研究[11-12]表明，幼齡沙鼠海馬CA1區(qū)約60%的神經(jīng)元在缺血再灌注7 d后死亡。本研究再次確認缺血再灌注損傷后神經(jīng)元死亡情況，結(jié)果與既往研究一致，并進一步闡明腦缺血再灌注后幼齡沙鼠DNA損傷標(biāo)記物8-OHdG免疫活性的變化。

A、B、C、D: 8-OHdG染色，分別顯示成年沙鼠對照組、缺血再灌注6 h、缺血再灌注4 d、缺血再灌注7 d 海馬CA1區(qū)8-OHdG免疫活性(200倍); E、F、G、H: 8-OHdG染色，分別顯示幼齡沙鼠對照組、缺血再灌注6 h、缺血再灌注4 d、缺血再灌注7 d 海馬CA1區(qū)8-OHdG免疫活性(200倍)圖3 成年與幼齡沙鼠缺血再灌注后海馬CA1區(qū)8-OHdG表達的免疫組織化學(xué)結(jié)果(n=5)

在腦缺血再灌注損傷發(fā)生發(fā)展過程中，有眾多病理機制參與其中，如興奮性氨基酸的過度釋放、體內(nèi)離子水平失衡、能量耗竭、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和細胞凋亡，這些因素相互作用，最終導(dǎo)致腦組織的不可逆損害[13-15]。氧化應(yīng)激在腦缺血的病理生理機制中起著至關(guān)重要的作用。腦缺血再灌注后可以激活多途徑而產(chǎn)生大量自由基。腦內(nèi)形成的自由基會直接攻擊細胞、脂質(zhì)、蛋白、DNA、核苷酸或堿基，進而導(dǎo)致氧化損傷[16]。研究[17]表明與脂質(zhì)及蛋白的氧化相比，缺血再灌注誘導(dǎo)產(chǎn)生的DNA損傷標(biāo)記物通過調(diào)節(jié)多種細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路直接損傷神經(jīng)元DNA片段，進而導(dǎo)致神經(jīng)元的凋亡或功能缺失。

A、B、C、D: 8-OHdG染色，分別顯示成年沙鼠對照組、缺血再灌注6 h、缺血再灌注4 d、缺血再灌注7 d海馬DG區(qū)8-OHdG免疫活性(200倍, ML表示分子層, GCL表示顆粒細胞層,PL表示錐體細胞層); E、F、G、H: 8-OHdG染色，分別顯示幼年沙鼠對照組、缺血再灌注6 h、缺血再灌注4 d、缺血再灌注7 d海馬DG區(qū)8-OHdG免疫活性(200倍)圖5 成年與幼齡沙鼠缺血再灌注后海馬DG區(qū)8-OHdG表達的免疫組織化學(xué)結(jié)果(n=5)

與Sham組比較, ?P< 0.05; 與成年組比較, #P<0.05圖7 成年與幼齡沙鼠缺血再灌注后海馬中8-OHdG的含量比較(n=5)

海馬CA1區(qū)是缺血性腦卒中時最易損傷的區(qū)域，遲發(fā)性神經(jīng)細胞死亡也往往發(fā)生于此。實驗結(jié)果表明，成年沙鼠海馬CA1區(qū)域 8-OHdG免疫活性在缺血后6 h和1 d時較前升高且成年沙鼠8-OHdG整體水平較幼齡沙鼠高。沙鼠海馬CA1區(qū)8-OHdG的活性表達與神經(jīng)細胞的損傷呈正相關(guān)，幼齡沙鼠低水平的8-OHdG會改善腦損傷區(qū)域神經(jīng)細胞的死亡。研究[18-19]證實成年哺乳動物大腦中的海馬齒狀回顆粒下層(SGZ)是內(nèi)源性神經(jīng)干細胞再生的主要區(qū)域之一。腦缺血損傷可以引起SGZ區(qū)的內(nèi)源性神經(jīng)干細胞代償性增殖，進而遷移至腦損傷周邊區(qū)域以維持腦的功能。本研究中幼齡沙鼠海馬DG區(qū)8-OHdG低表達狀態(tài)，預(yù)示幼年沙鼠不僅具有抵抗腦缺血損傷的能力，而且在腦卒中后將有較好的預(yù)后。

綜上所述，本研究表明腦缺血再灌注后幼年沙鼠海馬CA1和DG區(qū)相對低表達狀態(tài)與其抗腦缺血有著密切的聯(lián)系。