李 鑫， 劉鳳永， 袁宏軍， 管 陽， 付金鑫， 王茂強

目前臨床上尚未出現(xiàn)原發(fā)性肝癌有效治療方法，其發(fā)生、治療、預后及進展等始終是醫(yī)學研究熱點和重點［1-2］。大鼠具有基因與人類高度同源、生存能力強、成本低等特點，因此大鼠肝癌模型是研究肝癌相關問題的重要工具［3］。大鼠肝癌模型主要有自發(fā)性肝癌模型、誘發(fā)性肝癌模型、移植肝癌模型及轉基因肝癌模型［4］。自發(fā)性肝癌可高度模擬人類肝癌發(fā)生、發(fā)展及相關基因改變，但成瘤時間長、成瘤率低、個體差異較大［5］，除非有特殊要求，一般很少應用。誘導性肝癌模型主要用于化學物質致癌性及肝癌發(fā)生背景等相關研究［6］，但成瘤數(shù)量不可控、位置不確定性、成瘤周期較長等使應用受限［5］。隨著一系列肝癌細胞系培育，McA-RH7777和 N1S1細胞移植性肝癌模型在肝癌治療研究中得到廣泛應用［7］。近年以經導管動脈化療栓塞術（TACE）為代表的腔內介入術對外科不可切除肝癌的治療效果顯著［8］，介入術治療肝癌實驗研究逐漸增多［9-10］。 小鼠和裸鼠體積小、血管細，作為肝癌模型用于肝癌介入治療研究難度較大，而相關大鼠肝癌模型構建研究鮮見報道。本研究采用改良方法較高效地構建出上述兩種適用于肝癌介入治療研究的大鼠原位種植性肝癌模型，并通過彩色超聲、增強CT、MR等影像學檢查手段實現(xiàn)診斷和監(jiān)測。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

在生物安全柜（美國Thermo Fisher科技公司）中，將McA-RH7777肝癌細胞（美國菌種保藏中心ATCC，上海苰順生物工程公司）和N1S1肝癌細胞（ATCC，北京中原領先科技公司）復蘇后，分別置于含10%胎牛血清和1%雙抗的Dulbecco極限必需培養(yǎng)基（DMEM）和Iscove改良Dulbecco培養(yǎng)基（IMDM）中于37℃、5%CO2孵育箱（美國Thermo Fisher科技公司）培養(yǎng)。約4 d，貼壁細胞（McA-RH7777細胞）用胰酶消化后和懸浮細胞（N1S1細胞）（圖1）分別用磷酸緩沖液（PBS）提取制成細胞懸液。

圖1 10倍光學顯微鏡下觀察兩種細胞

1.2 McA-RH7777和N1S1肝癌模型構建

本實驗獲得解放軍總醫(yī)院倫理委員會審核并批準。20只無特定病原體（SPF）級Sprague-Dawley（SD）大鼠（雄性，12 周齡，350～400 g）由解放軍總醫(yī)院動物實驗中心（合格證：SCXK 2016-0006）提供，隨機分為McA-RH7777組和N1S1組，每組10只。大鼠稱重、腹腔注射3%戊巴比妥（0.2 mL·100 g-1）麻醉后，腹部備皮，消毒，鋪巾；沿胸骨柄下方腹中線切一長1～1.5 cm切口，暴露肝左中葉；1 mL注射器于肝中葉中下部斜向上方向進針約0.5 cm深度，緩慢注入 0.2 mL 細胞懸液[（4～5）×106U·mL-1]，肝臟表面肉眼可見一近似圓形透明凸起，凸起點所在位置即建模成功后肝癌所在大體位置，隨后固定注射器2 min讓肝癌細胞沉淀，防止撤針時肝癌細胞從注射點大量流出，導致肝癌細胞種植于肝外部位；撤針后棉球壓迫進針點5 min，防止腫瘤細胞從穿刺點流出，導致腫瘤肝外生長；待注射部位停止出血后，3.0 F縫合線分層縫合切口，并肌內注射青霉素（20萬U/只，山東魯抗醫(yī)藥公司）和地塞米松（2.5 mg/只，河南潤弘制藥公司）。術后連續(xù)3 d按上述劑量腹腔注射青霉素和地塞米松，以抗感染和免疫抑制治療。兩組大鼠按照上述步驟分別注入McA-RH7777細胞和N1S1細胞。

1.3 影像學檢查

術后7 d，采用Sonix Touch彩色超聲儀（加拿大Ultrasonix醫(yī)療公司）淺表部位探頭檢測肝臟腫瘤。增強CT檢查采用Somatom Emotion型16排螺旋CT機（德國Siemens公司），24 G靜脈留置針（德國B.Braun公司）穿刺尾靜脈，碘普羅胺注射液（德國Bayer公司）0.5 mL于0.9%氯化鈉溶液稀釋1.5～2倍（掃描參數(shù)：130 kV，44 mA，動脈期 3～4 s，延遲期13～17 s，層厚 3.0 mm，螺距 0.75～0.95，矩陣 512×512）。MR檢查采用1.5 T超導型MR掃描儀（美國通用公司），小柔線圈，快速自旋回波（FSE）序列T1加權成像（TR 400～500 ms，TE 15 ms，矩陣 256×192）和T2脂肪抑制序列掃描（TR 4 500～5 000 ms，TE 102 ms，矩陣 256×256），肝臟軸位掃描野（FOV）均為8～10 cm，層厚3.0 mm、層間距0 mm。記錄模型鼠體重，腫瘤最大長徑（a）和最大橫徑（b），體積（V）計算公式：V＝a×b2/2。

1.4 腫瘤大體形態(tài)觀察與病理學檢查

影像學檢查篩選出建模成功大鼠，腹腔注射過量（3～4 mL）10%水合氯醛處死大鼠，觀察兩種腫瘤大體形態(tài)特征，同時對兩種腫瘤作常規(guī)蘇木精-伊紅（HE）染色，進行病理學檢查。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，率的比較采用卡方檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般狀況

兩組大鼠術前術后飲食和活動正常。McARH7777 組（n＝10）大鼠術前平均體重（382.00±16.02）g，術后7 d死亡2只，8只影像學診斷全部成瘤，體重減輕（50.00±24.93） g，建模成功率為80%；N1S1 組（n＝10）大鼠術前平均體重（373.30±11.60）g，術后7 d死亡1只，9只全部成瘤，體重減輕（36.44±7.75）g，建模成功率為90%。兩組肝癌模型構建成功率差異無統(tǒng)計學意義（P＝0.86）。

2.2 影像學表現(xiàn)

MR檢查顯示，兩組大鼠肝中葉有單個腫瘤形成，均為 T1低信號，T2高信號（圖 2）；McA-RH7777組腫瘤最大橫徑為（10.20±3.46） mm，體積為（316.43±265.84）mm3；N1S1組腫瘤最大橫徑為（7.98±2.03） mm，體積為（188.58±137.47） mm3。

圖2 McA-RH7777和N1S1肝癌MR檢查影像

彩色超聲檢查顯示，兩組腫瘤均為強回聲結節(jié)，部分內部呈低回聲；多普勒分析顯示腫瘤存在血液供應（圖3）。

圖3 McA-RH7777和N1S1肝癌彩色超聲檢查影像

CT平掃未見兩組腫瘤病灶（圖4①④）；增強掃描腫瘤呈“快進快出”特點，兩組腫瘤病灶動脈期邊緣強化呈高信號，內部壞死呈低信號（圖4②⑤），靜脈期有明顯廓清現(xiàn)象（圖4③⑥）。

2.3 腫瘤大體形態(tài)

病理檢查結果與上述3種影像檢查結果一致，肝中葉注射瘤細胞處均形成單一腫瘤，其中McARH7777肝癌外觀呈團塊狀，N1S1肝癌呈結節(jié)狀（圖 5）。

2.4 病理學檢查

圖4 McA-RH7777和N1S1肝癌增強CT檢查影像

圖5 McA-RH7777和N1S1肝癌形態(tài)特征

術后7 d HE染色結果顯示，McA-RH7777肝癌為高分化肝細胞癌，腫瘤細胞類圓形或多邊形，大小不一，癌細胞呈結節(jié)狀排列；N1S1肝癌為低分化肝細胞癌，癌細胞多邊形，胞質豐富，核大深染，癌細胞排列呈小梁狀。兩種癌細胞均存在壞死現(xiàn)象，McA-RH7777肝癌細胞壞死數(shù)較多于N1S1肝癌細胞（圖 6）。

圖6 HE染色結果

3 討論

移植性鼠肝癌模型相比其它鼠肝癌模型，具有腫瘤位置可控、數(shù)量可調、成瘤時間短等優(yōu)點，是肝癌研究的重要工具。移植性肝癌分為異種移植和同種移植，異種移植通常將人源性肝癌細胞或其它異源性肝癌細胞接種至免疫缺陷型裸鼠皮下，在轉化醫(yī)學領域中應用廣泛［11-12］；同種移植通常將鼠源性肝癌細胞接種至鼠體內，構建肝癌模型。同種移植性肝癌模型高度模擬肝癌免疫機制及腫瘤微環(huán)境改變［13］，是研究肝癌治療的主要工具。隨著醫(yī)學進步，介入技術在臨床上已廣泛應用于肝癌治療［14］。因此，大鼠原位型肝癌模型是肝癌介入治療實驗研究的理想模型［15］。Jin 等［16］通過將癌細胞種植于裸鼠皮下獲得瘤組織，隨后在Wistar大鼠肝臟內種植瘤塊方法構建CBRH-7919肝癌細胞原位肝癌模型，但該方法操作復雜，建模需時4周，周期較長。本研究通過向SD大鼠肝臟直接注射瘤細胞聯(lián)合腹腔注射地塞米松方法，成功構建了McA-RH7777和N1S1兩種大鼠原位型肝癌模型。該方法與瘤塊埋植法相比，操作簡單便捷，省略瘤組織培養(yǎng)過程，且成瘤時間短，構建相似大小腫瘤模型僅需約1周時間，即在建模成功率相當情況下大大縮短了建模周期。Guo等［17］將 McA-RH7777細胞和 N1S1細胞注入SD大鼠肝臟，7 d后成功構建兩種大鼠肝癌模型，但成功率僅為75%。本研究通過改良方法構建SD大鼠肝癌模型，7 d后達到相似大小腫瘤體積，而建模成功率提高至85%（17/20）。此外，通過改良法構建的兩種腫瘤模型高度模擬人類肝癌惡變質，McA-RH7777肝癌模型于建模第10日左右出現(xiàn)肝外轉移，N1S1肝癌模型則于建模第14日左右出現(xiàn)肝外轉移，轉移常見部位為胃腸道、腹腔及淋巴結；同時，腫瘤轉移伴隨一系列腫瘤相關性并發(fā)癥，如食欲下降、體重減輕、精神萎靡、癌性腹水等。

此外，本研究采用臨床上常用影像學檢查手段對構建的兩種原位型肝癌模型進行診斷篩查，結果顯示McA-RH7777和N1S1兩種肝癌模型影像學表現(xiàn)與人類肝癌影像學表現(xiàn)相似。因此認為，可通過影像學檢查觀察兩種肝癌模型腫塊治療效果。本研究總結認為，3種影像學檢查手段中彩色超聲最為便捷，可用于初步篩查腫瘤模型構建是否成功，判斷腫瘤血供情況，同時初步判斷腫瘤大?。籑R檢查最為準確，通過T1和T2加權成像即可實現(xiàn)肝癌診斷，且可準確測量腫瘤大小，是治療后定期觀察腫瘤大小變化的首選檢查工具；CT平掃不易診斷體積較小大鼠腫瘤，須行增強CT掃描，而動脈期捕抓時間較短，對比劑有一定肝、腎毒性等缺點，因此除特殊需要，一般不建議通過增強CT評價腫瘤大小。本研究兩組大鼠種瘤7 d后，通過體重減輕程度、MR測量肝癌體積大小、彩色超聲和增強CT分析模型血供以及肝癌大體形態(tài)、出現(xiàn)轉移時間觀察，組織病理學檢測，得出McA-RH7777肝癌比N1S1肝癌生長更迅速，血供更豐富，惡性程度更高。這一結論與Guo等［17］對兩種腫瘤組織病理檢測后得出的結論一致。

本研究采用改良法成功高效地構建了兩種SD大鼠原位肝癌模型，建模過程有幾點經驗和教訓：①注射細胞懸液時斜向上方向進針可改變進針角度，有效防止撤針后進針點大量出血。②應確保注射細胞懸液時肉眼可觀察到肝臟表面有水腫凸起出現(xiàn)，切記不能將肝臟表面撐破，否則會引起腫瘤細胞流出肝外；依據(jù)凸起點可初步確定成瘤位置，為后續(xù)影像學檢查提供初檢位置。③地塞米松注射量應個體化。實驗中大鼠死亡原因很可能是地塞米松注射劑量過高，致使大鼠免疫力下降，最后死亡。

綜上所述，本研究采用改良法成功構建SD大鼠原位McA-RH7777團塊狀肝癌模型和N1S1結節(jié)狀肝癌模型，具有降低種瘤難度，簡化操作步驟，實現(xiàn)高效快速建模，縮短實驗周期的特點，并通過彩色超聲、MR、增強CT成功診斷和評價腫瘤，為腫瘤介入治療研究提供了一種可選擇的實驗工具。