王 葳，劉 婷，楊靜慧，劉艷軍，張桂霞，黃晗達(dá)

（天津農(nóng)學(xué)院 園藝園林學(xué)院，天津 300384）

樹莓（Rubus corchorifolius Linn.f）又名懸鉤子、覆盆子，為薔薇科懸鉤子屬的聚合漿果。樹莓果實中除含有人體所需的糖、有機酸、維生素C及礦物質(zhì)外，還富含黃酮、花青素、SOD、鞣花酸和水楊酸等多種保健成分，可以提高人體免疫力和抗氧化防衰老[1-2]，即具有營養(yǎng)和醫(yī)藥療效的雙重價值。因此，被列為世界第三代水果[3]，具有很高的開發(fā)價值。

中國樹莓屬植物種類繁多、分布復(fù)雜。但是，研究開發(fā)較少，大多數(shù)品種處于野生狀態(tài)，遺傳背景復(fù)雜，開發(fā)出來的品種較少[4]。國外樹莓以北美的加拿大和美國研究較多，也培育出了一批優(yōu)良品種。因此，了解現(xiàn)有樹莓品種的親緣關(guān)系對研究和利用樹莓屬植物種質(zhì)資源具有十分重要的意義。

利用RAPD-PCR技術(shù)對樹莓親緣關(guān)系進(jìn)行評價的方法已日趨成熟。如Graham和McNicol[5]對國外13種不同的樹莓屬植物，李媛媛等[6]對31份野生樹莓資源的親緣關(guān)系進(jìn)行了RAPD 多態(tài)性分析，分類結(jié)果與通過植物學(xué)性狀等進(jìn)行分類的結(jié)果基本一致[7]。因此，通過葉片細(xì)胞DNA的RAPD多態(tài)性分析可以比較好地了解不同品種間的親緣關(guān)系，進(jìn)行生物品種的鑒定、系譜分析及進(jìn)化關(guān)系的研究等。本研究以期對目前北方出產(chǎn)主要栽培的海爾特茲、凱歐、莎妮3個樹莓品種，與引進(jìn)的加拿大樹莓和南方黑樹莓之間的親緣關(guān)系進(jìn)行對比，以了解其習(xí)性，為生產(chǎn)和育種提供依據(jù)。

1 材料和方法

供試的5個樹莓品種分別為加拿大黑莓、凱歐、莎妮、海爾特茲和南方黑樹莓，于2011年栽植于天津市西青試驗園中，每品種栽植3行，每行12株。栽植株行距為1 m ×2 m。試驗地為黏壤土，pH值8.5，土壤含鹽量為0.25%，土壤肥力中等。實施常規(guī)管理。

基因組DNA的提取采用改良的CTAB法進(jìn)行DNA提取[8]。

試驗所用RAPD-PCR試劑盒購買于北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。體系優(yōu)化包括模板濃度的優(yōu)化和退火溫度的優(yōu)化。經(jīng)過優(yōu)化后的反應(yīng)體系為：總體積25 μL，RAPD引物1 μL，dNTP0.5μL，10×PCR buffer 2.5 μL，ddH2O19.5 μL，Taq 酶 0.5 μL，DNA 模板 1 μL。預(yù)變性：94 ℃，4 min；循環(huán)次數(shù)：42次（變性：94 ℃，30 s；退火：37 ℃，30 s；延伸：72 ℃，80 s）；延伸：72 ℃，10 min；終止溫度：4 ℃。

瓊脂糖凝膠電泳：電泳方法見表1。

表1 DNA樣品及其PCR產(chǎn)物電泳方法

RAPD條帶分析和數(shù)據(jù)處理：將電泳圖譜上同一位置的DNA條帶的有無進(jìn)行統(tǒng)計，有帶記為“1”，無帶記為“0”，形成1、0數(shù)據(jù)矩陣，計算各條引物的擴增條帶、多態(tài)性條帶以及多態(tài)性百分率[9]。根據(jù)公式GS=2NXY/(NX+NY)計算遺傳相似系數(shù)[10]，其中NX、NY是樣本X和YPCR擴增產(chǎn)物的DNA條帶總數(shù)，NXY是樣本X和YPCR擴增產(chǎn)物的共有條帶數(shù)。用NTsys2.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，生成聚類圖[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同樹莓品種RAPD-PCR擴增的引物篩選和多態(tài)性分析

試驗以20條10堿基引物對5個不同品種樹莓基因組DNA進(jìn)行了隨機引物的多態(tài)性擴增，從中選取了7條多態(tài)性高、重復(fù)性好的引物用于本試驗，分別是B4、B8、B10、B11、B15、B17、B18。結(jié)果發(fā)現(xiàn)7條引物對不同品種樹莓基因組DNA進(jìn)行擴增所得條帶的相對分子質(zhì)量集中在120 bp～2 000 bp之間，共擴增出65條帶，其中有60條多態(tài)性條帶，多肽率達(dá)到了92.3%。平均每條引物擴增條帶數(shù)為9.29條，平均多態(tài)性條帶數(shù)為8.57條，表明多態(tài)性較好。不同引物擴增出的條帶數(shù)和多態(tài)性條帶數(shù)及多肽百分率各不相同，B11號引物擴增出的條帶數(shù)最多，為11條；其次是B15號引物，擴增出10條；再次是B4、B10、B17、B18引物，均擴增出9條；最低為B8號引物，擴增出8條，而且7對引物所產(chǎn)生的多態(tài)性都非常豐富，其中B8、B10、B15號引物的多態(tài)性條帶達(dá)到了100%，B17號引物的多態(tài)性條帶最低為77.8%。以上數(shù)據(jù)表明各品種樹莓在RAPD分子水平上具有豐富的多態(tài)性（圖1和表2）。

圖1 不同品種樹莓基因組DNA的擴增結(jié)果

表2 RAPD引物對各品種樹莓葉片DNA的擴增條帶統(tǒng)計

2.2 不同樹莓品種的聚類分析及親緣關(guān)系

UPGMA聚類分析的結(jié)果表明（圖2），試驗中5個樹莓品種的DNA在遺傳距離為0.75的位置上可以聚為3類，其中，加拿大黑莓樹莓為第一類，南方黑樹莓為第二類，其他3個品種（海爾特茲、凱歐、莎妮）樹莓為第三類。表3顯示，5個品種中凱歐和莎妮的親緣關(guān)系最近，遺傳相似系數(shù)為0.933，加拿大黑莓與凱歐、莎妮的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，遺傳相似系數(shù)分別為0.600、0.533，與海爾特茲的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，遺傳相似系數(shù)只有0.400。海爾特茲與凱歐和莎妮的親緣關(guān)系較近，遺傳相似系數(shù)分別為0.800、0.867，與南方黑樹莓的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，遺傳相似系數(shù)為0.600；南方黑樹莓與凱歐和莎妮的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，遺傳相似系數(shù)分別為為0.571、0.500。

圖2 不同品種樹莓聚類圖

表3 不同品種樹莓遺傳相似系數(shù)矩陣

2.3 不同樹莓品種的植株形態(tài)結(jié)構(gòu)差異與親緣關(guān)系的比較

RAPD的分析結(jié)果為加拿大樹莓與其他品種的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，其次是南方黑樹莓，其余3個品種親緣關(guān)系較近，又以凱歐和莎妮親緣關(guān)系較近，這與其植株形態(tài)結(jié)構(gòu)差異大有較好的一致性。就形態(tài)特征而言，加拿大黑莓植株較為直立型，而其他4種樹莓都是匍匐型；加拿大黑莓和南方黑樹莓沒有刺，其他3種樹莓均有密度不同的刺。南方黑樹莓與莎妮和凱歐相比，其葉片較薄，普通的背腹型葉片。而莎妮和凱歐為等面葉，具有典型的旱生植物葉片的結(jié)構(gòu)。另一個試驗顯示，凱歐和莎妮這2個品種形態(tài)上、解剖結(jié)構(gòu)上也十分相似[12]。

3 結(jié) 論

RAPD多態(tài)性分析結(jié)果其葉片的形態(tài)特征和解剖結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果有較好的一致性。