張雪萍 米麗開姆·托合提尼亞孜 童劍軍 何川川 余 娜 李有文*

(1 塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300) (2 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300)(3 塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300)

流行性乙型腦炎(epidemic encephalitis type B)是由日本乙型腦炎病毒(Japanese Encephalitis Virus, JEV)引起的一種蟲媒性人獸共患傳染病[1]。人和多種動物均可感染本病，以豬群感染最為普遍[1]。病豬多引起非化膿性腦炎，病人最主要特征是中樞神經(jīng)系統(tǒng)受害而出現(xiàn)意識障礙、驚厥等神經(jīng)癥狀[2]。本病被世界衛(wèi)生組織列為需要重點控制的傳染病。

乙型腦炎病毒是單股正鏈有囊膜的RNA病毒，屬于黃病毒科(Flaviviridae)黃病毒屬(Flavivirus)[3]。病毒顆粒為球形，20面體對稱，病毒外層有纖突。其基因組長約11 kb，編碼3個結(jié)構(gòu)蛋白(C、M、E)和7個非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)[1,3]。C蛋白為病毒的衣殼蛋白，包裹病毒基因組，對病毒基因組起保護作用[3,4]，構(gòu)成病毒衣殼，決定其形態(tài)。已有研究表明，黃病毒屬病毒的C蛋白不顯露在病毒顆粒表面，因此不能誘導(dǎo)宿主細胞產(chǎn)生病毒的中和抗體[5,6]。C蛋白主要參與病毒的組裝與復(fù)制：例如JEV復(fù)制得到的大量正鏈RNA有一半與C蛋白結(jié)合形成未成熟的病毒粒子[7]；此外C蛋白還具有非結(jié)構(gòu)蛋白的功能，研究發(fā)現(xiàn)C蛋白也是JEV感染抗病毒治療的靶位點[8]。盡管如此，C蛋白的結(jié)構(gòu)特點、作用機制及更多的生物特性還有待研究，因此本文克隆了JEV P3株的C基因，并表達了其蛋白，分析了其核苷酸和氨基酸結(jié)構(gòu)特點，為進一步研究C蛋白的其他生物學(xué)功能和作用機制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株與菌種

乙腦病毒P3株基因組cDNA由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)曹勝波教授饋贈；感受態(tài)細胞E.coliDH5α、E.coliBL21、原核表達載體pET42b保存于新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團塔里木畜牧科技重點實驗室。

1.1.2 主要藥品及試劑

2×Utaq PCR Mix (北京莊盟國際生物基因科技有限公司)，PrimeSTAR HS DNA Polymerase、dNTP、T4 DNA連接酶 (大連寶生物科技有限公司)，瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒 (北京天根生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，NdeI、XhoI(Thermo公司)，DNA 純化試劑盒 (美國Omega公司)。Western blot 用DAB顯色劑 (武漢博士德生物工程有限公司)。

1.1.3 主要使用儀器

瓊脂糖水平電泳儀(北京六一生物科技有限公司)，F(xiàn)250經(jīng)濟型加熱制冷循環(huán)器(優(yōu)萊博技術(shù)(北京)有限公司)，ZWY-103B恒溫培養(yǎng)振蕩器、ZXGP-B2160隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海智城分析儀器制造有限公司)，全自動凝膠成像分析儀、HC高電流電泳儀、T100 Thermal Cycler梯度PCR儀、 Mini-PROTEAN Tetra電泳槽、 Mini-Trans-Blot電泳轉(zhuǎn)印槽(Bio-Rad生命科學(xué)有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 原核表達載體的構(gòu)建

(1)C基因的PCR擴增

參考GenBank中乙型腦炎病毒JaOArS982 (NC001437) C基因序列，設(shè)計C基因?qū)ET42b載體的特異性引物，引物由武漢天一輝遠生物科技有限公司進行合成。如表1 (下劃線為加入酶切位點：NdeI/XhoI)。

表1 C基因特異性引物

以乙型腦炎病毒P3株基因組cDNA為模板，用C基因的特異性引物進行PCR擴增。100 μL擴增體系：模板4. 8 μL，上下游引物各2. 4 μL，5×PrimeStar Buffer 20 μL，DNTP Mixture 4 μL， PrimeSTAR HS DNA Polymerase 1.2 μL，dd H2O 65. 2 μL。擴增程序：94 ℃ 3 min、94 ℃ 30 s、57 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min、72 ℃10 min，30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后切膠純化回收(按照DNA回收試劑盒操作)。

(2)C基因與質(zhì)粒的酶切與純化

取C基因20 μL，pET42b質(zhì)粒15 μL分別于兩個離心管，分別加通用10xBuffer 4 μL，NdeI2 μL，XhoI2μL，加入水至40 μL，充分混勻后，放入37℃ 水浴鍋中酶切3～4 h。酶切產(chǎn)物利用DNA純化試劑盒純化，保存?zhèn)溆谩?/p>

(3) C基因與原核表達載體的連接與鑒定

將酶切純化的C基因5 μL與載體1 μL于同一離心管中，加T4連接酶1 μL，10xT4buffer 1 μL，加水2 μL，于16 ℃水浴連接8～10 h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)DH5α并涂板培養(yǎng)12～14 h，挑菌搖菌，做菌液PCR鑒定，PCR陽性菌提取質(zhì)粒，并做雙酶切(NdeI/XhoI)鑒定，質(zhì)粒送武漢天一輝遠生物有限公司測序鑒定。

1.2.2 P3株C基因核苷酸及推測的氨基酸序列分析

C基因的測序結(jié)果利用軟件DNAMAN和DNASTAR進行核苷酸同源性比較和遺傳進化關(guān)系分析。并推測其氨基酸序列，做蛋白二級結(jié)構(gòu)分析和分子量預(yù)測。

1.2.3 C蛋白表達及鑒定

(1)C蛋白的表達

取經(jīng)鑒定構(gòu)建正確的質(zhì)粒1 μL，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)BL21，挑取單菌落后按正常蛋白電泳鑒定的方法鑒定，具體參考張孝忠等[9]的操作方法。

(2)Western Blot檢測

對C基因的表達產(chǎn)物進行SDS-PAGE電泳。將膠塊鏟下，切成合適大小，置于用TBST Buffer浸泡濾紙上，其上蓋同樣大小的用TBST Buffer浸泡NC膜，其上再加濾紙。然后置轉(zhuǎn)膜儀中，調(diào)電壓至120 V，電泳30 min，將蛋白轉(zhuǎn)至NC膜上。以His單抗為一抗，RHP標(biāo)記的羊抗鼠抗體為二抗，用Western blot的常規(guī)操作方法進行檢測，具體參考張孝忠等[9]的操作方法。

2 實驗結(jié)果

2.1 C基因的擴增

JEV P3株C基因的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測的結(jié)果如圖1，C基因大小約381 bp，與理論大小相符。

圖1 C基因PCR擴增

2.2 C基因的克隆與鑒定

構(gòu)建的JEV C基因的克隆經(jīng)菌落PCR鑒定，得到約381 bp的條帶，初步鑒定克隆成功；其質(zhì)粒做NdeI/XhoI雙酶切鑒定，得到了約5 000 bp與381 bp(如圖2 )的兩條帶，與理論相符，說明成功構(gòu)建了C基因的表達載體PET42b-JEV-C；質(zhì)粒測序結(jié)果表明JEV P3株C基因與參考株同源性97%以上，且表達框正確。

圖2 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定

2.3 JEV-C基因及其遺傳進化特性分析

P3株C基因全長381 bp (如表2)，與對照J(rèn)aOArS982同源性為97. 64%，其AT含量有50. 66%，序列中含有4個酶切位點(如表2左側(cè)畫橫線處)。

表2 JEV-C的核苷酸序列及氨基酸序列

根據(jù)P3株的測序結(jié)果，與GenBank中發(fā)表的JEV-C的序列做遺傳進化分析。對C基因進行遺傳進化樹分析(如圖3)，發(fā)現(xiàn)C基因雖然形成5個分支，但各分支之間差異較小，親緣性較近，說明JEV的C基因比較保守，這與其在病毒繁殖中重要的生物學(xué)功能相一致。P3株的C基因位于第IV組，遺傳距離約1. 5。

圖3 C基因遺傳進化樹

2.4 P3株C蛋白特性及二級結(jié)構(gòu)分析

利用DNASTAR軟件分析JEV P3株C基因編碼127個氨基酸(如表2)，分子量大小13 KDa；從氨基酸組成上，25個強酸性氨基酸 (K,R)，5個強堿性氨基酸 (D, E)，53個疏水性氨基酸(A, I, L, F, W, V)，18個兩性氨基酸 (N, C, Q, S, T, Y)，等電點為11. 89，在中性環(huán)境中帶正電。C蛋白的二級結(jié)構(gòu)分析 (圖4) 發(fā)現(xiàn)C蛋白主要由β片層結(jié)構(gòu)和α螺旋結(jié)構(gòu)構(gòu)成，中間有少量的β轉(zhuǎn)角相連接。整個蛋白親水性一般，有較強的抗原性。

圖4 C蛋白二級結(jié)構(gòu)分析

2.5 C蛋白的表達與檢測

質(zhì)粒pET42b-JEV-C在大腸桿菌BL21中蛋白表達結(jié)果顯示：C基因以包涵體形式表達了大小13 KDa的蛋白 (如圖5)，與理論值相符；以His單抗進行Western blot檢測結(jié)果 (如圖6) 說明C蛋白與His標(biāo)簽確實進行了融合表達，且表達結(jié)果正確。

圖5 C蛋白表達檢測

圖6 C蛋白的Western blot 鑒定

3 討論

JEV能夠引起包括人等多種動物神經(jīng)系統(tǒng)的疾病，是引起公共衛(wèi)生安全事件的主要病原之一。

JEV基因組是一條線形RNA正鏈，由5’非編碼區(qū)，蛋白編碼區(qū)和3’非編碼區(qū)組成，蛋白編碼區(qū)只有一個開放閱讀框編碼一個多聚蛋白，在宿主細胞和病毒編碼的蛋白酶共同作用下，將多聚蛋白切割成3個結(jié)構(gòu)蛋白和7個非結(jié)構(gòu)蛋白[10,11]。C蛋白是多聚蛋白N端的第一個蛋白，也是其中最小的一個蛋白，只有127aa，對病毒的組裝和結(jié)合病毒RNA不被降解有重要作用。本研究對JEV P3株C蛋白的二級結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)其中間為一長的α螺旋結(jié)構(gòu)(49-99aa)，其中含有大量兩性氨基酸，而兩端由多個β片層結(jié)構(gòu)構(gòu)成(如圖4)，富含荷電氨基酸，有利于結(jié)合病毒RNA。這個結(jié)果與Pareek等的研究結(jié)果一致。Pareek等研究發(fā)現(xiàn)C蛋白N端39aa，C端23aa對病毒的組裝無影響， N端16aa的缺失突變不影響病毒的組裝[12]，說明衣殼中環(huán)化序列不影響基因組的包裝或病毒的組裝，但影響病毒RNA 的復(fù)制。

JEV侵入宿主細胞之后，在酸性胞質(zhì)中E蛋白結(jié)構(gòu)改變釋放出病毒基因組，病毒基因組被運送到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中進行復(fù)制，合成病毒多聚蛋白和增殖RNA，C蛋白與新合成的RNA結(jié)合成未成熟的病毒粒子通過高爾基體成熟后釋放出細胞，整個過程均在細胞質(zhì)中進行[13]。翟永貞等構(gòu)建了融合表達GFP的JEV-C重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的CHO細胞，在細胞質(zhì)和細胞膜中發(fā)現(xiàn)較顯著綠色熒光[8]，證明C蛋白可能確實與病毒的組裝有關(guān)，也說明病毒的增殖是在細胞質(zhì)中進行的。但是有研究證明JEV-C蛋白可以特異性的和核仁蛋白B23結(jié)合，并且發(fā)現(xiàn)JEV-C蛋白與B23的結(jié)合位點是氨基端殘基Gly42和Pro43(表2右側(cè)劃橫線處)，說明JEV-C是可以進入細胞核的，并且其42、43位的氨基酸是重要的結(jié)合位點[14]。同時，Ma等[15]對JEV-C蛋白變異株(42、43位的甘氨酸和脯氨酸被丙氨酸替代)研究發(fā)現(xiàn)在核仁中找不到C蛋白，這一結(jié)果進一步證明該位點對C蛋白定位于細胞核作用重大。更多研究證明JEV-C蛋白在細胞核的定位對于臨床上病毒性腦炎的發(fā)病機制有著重要的意義[16]，也說明C蛋白除了作為結(jié)構(gòu)蛋白之外還有更多非結(jié)構(gòu)蛋白的生物學(xué)功能。本研究構(gòu)建了pET42b-JEV-C的原核表達質(zhì)粒，并成功表達C蛋白，說明JEV-C能夠在大腸桿菌中較好表達，為進一步研究C蛋白的結(jié)構(gòu)及其他生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。