李丹妮，劉云鵬

（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，沈陽 110001）

GATA1不同激酶活性突變體質(zhì)粒的構(gòu)建及蛋白表達和亞細胞定位

李丹妮，劉云鵬

（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，沈陽 110001）

目的采用大引物法構(gòu)建GATA1不同激酶活性突變體GATA1 S161A S187A （死型） 和GATA1 S161D S187D （激活型） 真核表達載體，并證實其融合蛋白在細胞內(nèi)的表達及定位，旨在進一步探討其生物學功能和潛在腫瘤治療靶點。方法以GFP-GATA1 WT為模板，采用大引物法擴增S161A S187A、S161D S187D突變體片段，雙酶切克隆至pEGFP-C1表達載體中，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293中，經(jīng)免疫印跡鑒定融合蛋白的表達。結(jié)果用大引物PCR法成功構(gòu)建GATA1不同激酶活性突變體的真核表達載體pEGFP-GATA1 S161A S187A和pEGFP-GATA1 S161D S187D，驗證了其融合蛋白表達。共聚焦激光顯微鏡技術(shù)顯示，融合蛋白主要定位于細胞核內(nèi)。結(jié)論利用大引物法成功構(gòu)建GATA1不同激酶活性突變體真核表達載體，并為進一步進行該突變體的結(jié)構(gòu)和功能研究奠定了基礎。

GATA1； PAK5； 磷酸化； 基因克??； 融合蛋白； 轉(zhuǎn)染

PAK5作為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（p21-activated kinases，PAKs） 的一員，可以磷酸化底物GATA1的Ser161和Ser187位點，并協(xié)同GATA1發(fā)揮重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。目前研究［1］發(fā)現(xiàn)，GATA1在實體瘤中高表達，如乳腺癌等。GATA1同家族成員GATA3可上調(diào)E-Ca的表達，進而抑制乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移［2-3］。

本研究利用大引物PCR法構(gòu)建不同激酶活性GATA1突變體GATA1 S161A S187A （死型） 和GATA1 S161D S187D （激活型） 真核表達載體。并證實其融合蛋白在細胞內(nèi)的表達及定位，旨在為進一步探討其生物學功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌DH5感受態(tài)為中國醫(yī)科大學分子細胞生物學教研室制備；真核表達載體 pEGFP-C1 購自美國Clontech公司，工具細胞HEK-293為中國醫(yī)科大學分子細胞生物學教研室保存。PryobestTMDNA polymerase、dNTP、DNA電泳凝膠回收試劑盒、限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ均購自日本TaKaRa公 司；DNA marker和Protein marker購 自 美 國Gen-Script公司；T4 DNA連接酶購自NEB公司；anti-GFP抗體購自美國Genscript公司；引物合成、DNA序列測定由深圳華大有限公司完成；ECL發(fā)光試劑盒購自美國Pharmacia公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 大引物PCR法對GATA1不同激酶活性的全長突變體的擴增

1.2.1 點突變引物設計：設計GATA1 S161A及GATA1 S161D擴增的PCR引物，包括GATA1上下游引物及Ser161突變點插入引物，并在上下游引物中分別加入EcoRⅠ、XhoⅠ限制性酶切位點， A，GFP-GATA1-s primer序列為5’-TGGAAGCTCGAGAC ATGGAGTTCCCA-3’； B，GFP-GATA1-a primer序 列為5’-GCCCTCTATGAATTCGTCATGAGCTGA-3’；C，GATA1S161A-a primer序列為5’-CCCCCATAAGCAG CATTGGGGACAG-3’；D，GATA1 S161D-a primer序列 為5’-CCCCCATAAGCATCATTGGGGACAG-3’。反應條件為95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.2.2 PCR擴增點突變大引物：以GFP-GATA1 WT為模板，由上游引物A和下游引物C引發(fā)第1輪PCR擴增GATA1 S161A的單突變序列大引物。以GFP-GATA1 WT為模板，由上游引物A和下游引物D引發(fā)第1輪PCR擴增GATA1 S161D的單突變序列大引物。

1.2.3 利用大引物PCR擴增全長突變體：分別以擴增出的GATA1 S161A和GATA1 S161D的單突變序列作為引物，與另一外側(cè)引物B用于第2輪PCR反應，共同擴增GATA1 S161A和GATA1 S161D全長突變體。

1.2.4 設計點突變引物：設計 GATA1 S187A 及GATA1 S187D 擴增的 PCR 引物。引物 E，GATA1 S187A-a primer 序列為 5’-GCTTGGGAGCGGAATAG G-3’；F，GATA1 S187D-a primer序列為5’-GCTTGGG ATCGGAATAGG-3’。再分別以 GATA1 S161A 和GATA1 S161D全長突變體為模板，采用相同的大引物PCR法最后擴增出含雙突變位點的終產(chǎn)物GATA1 S187A S161A和GATA1 S187D S161D。用大引物PCR法擴增GATA1 S161A S187A和 GATA1 S161D S187D的全長突變體，并將其克隆至pEGFP-C1表達載體中。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒測序并轉(zhuǎn)染到工具細胞HEK-293中，提取細胞蛋白進行Western blotting檢測。利用共聚焦激光掃描顯微鏡分別觀察pEGFP-GATA1 S161A S187A 和pEGFP-GATA1 S161D S187D在工具細胞HEK-293的細胞內(nèi)定位。

1.3 電泳及載體回收

PCR產(chǎn)物含雙突變位點的終產(chǎn)物GATA1 S187A S161A 和GATA1 S187D S161D，即目的片段的純化。1%瓊脂糖凝膠電泳（90 V，30 min），紫外燈下根據(jù)DNA分子量標準選取目的片斷并切下，按照TaKaRa瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒的操作步驟回收目的片段?；厥蘸箅娪敬_定濃度?；厥誴EGFP載體以及PCR含雙突變位點的終產(chǎn)物GATA1 S187A S161A和GATA1 S187D S161D。37 ℃酶切過夜，電泳。反應體系包括EGFP，PCR 產(chǎn)物24 μ L，10×H 緩沖液3 μ L，EcoRⅠ1.5 μ L，XhoⅠ 1.5 μ L。

1.4 連接和轉(zhuǎn)化

上述雙酶切產(chǎn)物經(jīng)過純化（ 其中載體酶切產(chǎn)物割膠回收，PCR片段酶切后純化步驟與上述PCR產(chǎn)物純化步驟相同） ，在T4 DNA連接酶作用下，室溫2 h或16 ℃連接過夜。連接體系為載體1.5 μ L，GATA1 S187A S161A/S161D 7 μ L，10×T4 DNA 連接酶緩沖液1 μ L，T4 DNA 連接酶0.5 μ L。取上述連接液5 μ L轉(zhuǎn)化到預先制備的DH5α化學感受態(tài)細胞中，冰浴30 min，42 ℃水浴60 s，冰中放置2～3 min，加入250 μ L 37 ℃預溫的無抗LB培養(yǎng)基，37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)1 h，最后均勻涂于平板，37 ℃溫箱培養(yǎng)12～16 h。挑選單菌落接種到3 mL相關抗性的LB培養(yǎng)基中，于37 ℃225 r/min搖菌過夜。

1.5 制備質(zhì)粒

將菌液倒入1.5 mL EP管中，4 ℃ 12 000 r/min離心1 min。離心結(jié)束盡可能吸干培養(yǎng)液。將細菌沉淀重懸于100 μ L冰預冷的溶液Ⅰ中，渦旋使沉淀充分溶解。向EP管中加入200 μ L新配制的溶液Ⅱ，快速顛倒2次，然后置于冰上。用150 μ L預冷的溶液Ⅲ，蓋緊瓶口，反復顛倒數(shù)次，冰上放置5 min。4 ℃ 12 000 r/min 離心10 min，上清轉(zhuǎn)移至新EP管中。加入與上清等體積的酚/氯仿，渦旋15 s，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min。小心吸取上層水相于新管中，加入2倍體積 （約700 μ L） 無水乙醇，30 μ L 3M NaAC于室溫沉淀核酸，振蕩混合，室溫5 min。4℃ 12 000 r/min離心10 min。棄上清，加入1 mL 70%乙醇洗滌沉淀，4℃12 000 r/min離心5 min。棄上清，室溫干燥5～10 min，用30 μ L RNAse水重新溶解沉淀，溫和振蕩，-20 ℃保存。

1.6 酶切鑒定及測序

利用EcoRⅠ和XhoⅠ對所提取的質(zhì)粒進行雙酶切，酶切后電泳，根據(jù)片斷的大小來確定是否連接正確。送基因檢測公司進行測序。

2 結(jié)果

2.1 大引物法擴增GATA1 S161A S187A 和GATA1 S161D S187D雙突變?nèi)L片段

使用大引物PCR法對GATA1 S161A S187A和GATA1 S161D S187D雙突變?nèi)L突變體進行擴增。首先以GFP-GATA1 WT為模板，進行第1輪大引物PCR，PCR擴增GATA1 （1-161aa） S161A/D大引物片段，得到長度約500 bp的2條帶 （圖1） 。應用PCR產(chǎn)物GATA1 （1-161aa） S161A/D作為上游大引物與GATA1下游引物進行PCR，PCR擴增GATA1 S161A/D單突變點全長片段，得到長度1 200 bp的全長產(chǎn)物（圖2） 。以GATA1 S161A/D為模板，進行第2輪大引物PCR， PCR擴增 GATA1 S161A/D （1-187aa） S187A/D大引物片段，得到長度約500 bp的2條帶 （圖3） ，應用PCR產(chǎn)物GATA1 （1-161aa） S161A/D作為上游大引物與GATA1下游引物進行PCR，PCR擴增GATA1 S161A/D S187A/D雙突變點全長片段，得到長度1200bp的全長產(chǎn)物 （圖4） 。

圖1 PCR擴增hGATA1 S161A/D上游大引物Fig.1 PCR amplification of the hGATA1 S161A/D upstream primers

圖2 PCR擴增hGATA1 S161A/D全長突變體Fig.2 PCR amplification of the hGATA1 S161A/D full-length mutant

圖3 PCR擴增hGATA1 S161A/D S187A/D上游大引物Fig.3 PCR amplification of the hGATA1 S161A/D S187A/D upstream primers

圖4 PCR擴增hGATA1 S161A/D S187A/D 全長突變體Fig.4 PCR amplification of the hGATA1 S187A/D full-length mutant

2.2 GATA1不同激酶活性突變體的真核表達載體的構(gòu)建和鑒定

將重組質(zhì)粒pEGFP-C1-GATA1 S161A/D S187A/D雙突變點全長經(jīng)EcoRI/ XhoI雙酶切后得到了約4 700 b和1 200 bp左右的2條帶 （圖5） 。經(jīng)過測序分析，外源序列在NCBI-Blast比對結(jié)果證實雙點突變成功。

圖5 重組質(zhì)粒hGATA1 S161A/D S187A/D酶切結(jié)果Fig.5 Identification of hGATA1 S161A/D S187A/D using restriction enzymes

2.3 真核表達載體的蛋白表達

將構(gòu)建的真核表達質(zhì)粒 pEGFP-C1-GATA1 S161A/D S187A/D雙突變點全長轉(zhuǎn)染到HEK-293細胞系中，48 h以后將提取的蛋白經(jīng)10% SDS-PAGE凝膠電泳，Western blotting 檢測到了融合pEGFP-C1-GATA1 S161A/D S187A/D蛋白的表達 （圖6） 。分子量約為70×103，為質(zhì)粒本身的GFP標簽分子量（24×103～26×103） 和GATA1 S161A/D S187A/D分子量 （42×103） 之和，說明融合蛋白表達。

圖6 融合蛋白GFP-GATA1 S161A/D S187A/D的表達Fig.6 Expression of GFP-GATA1 S161A/D S187A/D

2.4 pEGFP-GATA1 S161A S187A 和pEGFP-GATA1 S161D S187D在細胞內(nèi)的定位

共聚焦激光顯微鏡技術(shù)顯示pEGFP-GATA1 S161A S187A 和pEGFP-GATA1 S161D S187D蛋白主要定位于細胞核內(nèi)。見圖7。

圖7 pEGFP-GATA1 S161A/D S187A/D 在HEK293細胞內(nèi)的定位 ×40Fig.7 Localization of pEGFP-GATA1 S161A/D S187A/D in HEK293 cells ×40

3 討論

PAKs是一類保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，通過其下游眾多的激酶底物和結(jié)合蛋白參與眾多的生物學功能，如細胞運動、細胞生存、細胞周期、血管生成、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移［4-7］，在多種惡性腫瘤，如乳腺癌、卵巢癌、胃癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、甲狀腺癌和胰腺癌中呈現(xiàn)過表達或高活性［8-10］。是腫瘤細胞信號網(wǎng)絡的關鍵調(diào)節(jié)因子。PAK5作為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可以磷酸化底物GATA1的Ser161和Ser187位點。本研究利用高效精準的大引物法構(gòu)建了pEGFP-GATA1 S161A S187A（死型） 和pEGFP-GATA1 S161D S187D （激活型） 2種不同激酶活性的突變體質(zhì)粒，而前期研究［11］也已發(fā)現(xiàn)磷酸化的GATA1可以招募更多的HDAC3/4至E-鈣黏蛋白啟動子區(qū)，抑制其轉(zhuǎn)錄進而下調(diào)E-鈣黏蛋白，導致乳腺癌細胞發(fā)生上皮間質(zhì)化，表明GATA1依賴PAK5的磷酸化在乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。

目前已建立的多種以PCR為基礎的定點突變及產(chǎn)生重組體的方法體系中，應用較普遍的是重疊延伸PCR、大引物PCR和重組PCR法。其中，大引物PCR法由KAMMANN等［12］于1989年提出，隨后經(jīng)SARKAR等［13］加以改進。大引物PCR定點突變技術(shù)因簡便實用而應用廣泛。改進后的整個過程只需要3種擴增引物進行2次PCR反應。大引物為PCR擴增的產(chǎn)物，因長度遠長于普通意義的引物而得名。大引物PCR突變法以第1次PCR擴增純化產(chǎn)物作為第2次PCR擴增的大引物，第1輪PCR反應由誘變引物和相應的外側(cè)引物共同引起擴增，這一輪PCR擴增所得到的突變體經(jīng)純化后作為大引物又與另一外側(cè)引物用于第2輪PCR反應，最后擴增出含突變位點的終產(chǎn)物。

本研究通過大引物法，經(jīng)過雙輪PCR，成功構(gòu)建了位置相距較遠的雙點突變hGATA1 S161A/D S187A/D突變體質(zhì)粒。并進一步將重組質(zhì)粒pEGFP-C1-GATA1 S161A/D S187A/D雙突變點全長經(jīng)EcoRⅠ/XhoⅠ雙酶切后得到了約4 700 bp和1 200 bp左右的2條帶，獲取GATA1不同激酶活性突變體的真核表達載體并驗證。成功印證其表達后，利用共聚焦激光顯微鏡技術(shù)闡釋出pEGFP-GATA1 S161A S187A和pEGFP-GATA1 S161D S187D蛋白主要定位于細胞核內(nèi)。有利于進一步深入分析GATA1與其他蛋白的相互作用的磷酸化位點以及生物學行為的闡釋。而大引物PCR法對于全長突變體質(zhì)粒的構(gòu)建，以及進一步研究具體磷酸化位點的重要意義和生物學功能的闡明則至關重要。

［1］ SCHRANTZN，DA SILVA CORREIA J，F(xiàn)OWLER B，et al. Mechanism of p21-activated kinase 6-mediated inhibition of androgen receptor signaling［ J］. J Biol Chem，2004，279（ 3） ，1922-1931.DOI：10.1074/jbc.M311145200.

［2］ KEXIN X，HERMELA S. Regulation of androgen receptor transcriptional activity and specificity by RNF6-induced ubiquitination［J］.Cancer Cell，2009，15（ 4） ：270-282.DOI：10.1016/j.ccr.2009.02.021.

［3］ KATSUMURA KR，BRESNICK EH，GATA FACTOR MECHANISM GROUP. The GATA factor revolution in hematology［ J］. Blood，2017，129（ 15） ：2092-2102. DOI：10.1182/blood-2016-09-687871.

［4］ WELLS CM，JONES GE. The emerging importantce of group Ⅱ PAKs［J］. Biochem J，2010，425（ 3） ：465-473. DOI：10.1042/BJ20091173.

［5］ POONAM RM，LI DQ，MURRAY B，et al. PAK signaling in oncogenesis［ J］. Oncogene，2009，28（ 28） ：2545-2555. DOI：10.1038/onc.

［6］ DUMMLER B，OHSHIRO K，KUAMR R，et al. Pak protein kinases and their role in cancer［ J］. Cancer Metast Rev，2009，28（ 1/2） ：51-63. DOI：10.1007/s10555-008-9168-1.

［7］ YE DZ，F(xiàn)IELD J. PAK signaling in cancer［ J］. Cell Logist，2012，2（2）：105-116. DOI：10.4161/cl.21882

［8］ ISSACS JT，ISAACS WB. Androgen receptor outwits prostate cancer drugs［ J］. Nat Med，2004，10（ 1）：26-27. DOI：10.1038/nm0104-26.

［9］ YANG F，LI X，SHARMA M，et al. Androgen receptor specifically interacts with a novel p21-activated kinase PAK6［ J］. J Biol Chem，2001，276（ 18 ） ：15345-15353. DOI：10.1074/jbc.M010311200.

［10］ LEE SR，RAMOS SM，KO A. AR and ER interaction with a p21-activated kinase（ PAK6）［J］. Mol Endocrinol，2002，16（ 6） ：85-99.DOI：10.1210/mend.16.1.0753.

［11］ YANG LI，QIANG KE. GATA1 induces epithelial-mesenchymal transition in breast cancer cells through PAK5 oncogenic signaling［J］. Oncotarget，2015，6（ 6） ：4345-4356. DOI：10.18632/oncotarget.2999.

［12］ KAMMANN M，LAUFS J，GRONENBORN B. Rapid insertional mutagenesis of DNA by polymerase chain reaction（ PCR）［ J］.Nucleic Acids Res，1989，17（ 13） ：5404.

［13］ SARKAR G，SOMMER SS. The“ megaprimer” method of site-directed mutagenesis［ J］. Biol Techniques，1990，8（ 4） ：404-407.

Construction，Protein Expression，and Subcellular Localization of Various Kinase Mutant Plasmids of GATA1

LI Danni，LIU Yunpeng
（Department of Oncology，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveThe GATA1 mutant GATA1 S161A S187A （death type） and GATA1 S161D S187D （activated） eukaryotic expression vectors were constructed using the large primer method，and，to explore their biological function and potential tumor treatment targets，the expression and localization of the fusion protein in cells were confirmed.MethodsS161A，S187A，S161D，and S187D mutants were amplified by GFP-GATA1 WT，which served as the template. The recombinant plasmid was cloned into a pEGFP-C1 expression vector and transfected into HEK293 cells by immunoblotting expression of the fusion protein.ResultsThe eukaryotic expression vectors pEGFP-GATA1 S161A S187A and pEGFP-GATA1 S161D S187D were successfully constructed using the high primer PCR method，and expression of the fusion protein was verified. Confocal laser microscopy showed that the fusion protein was mainly located in the nuclei of HEK293 cells.ConclusionA eukaryotic expression vector of a GATA1 mutant was successfully constructed using the large primer method. This work lays the foundation for further studies on the structure and function of the mutant.

GATA1； PAK5； phosphorylation； gene cloning； fusion protein； transfect

R730.23；Q782

B

0258-4646 （2018） 01-0022-05

http://kns.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20171220.1425.012.html

10.12007/j.issn.0258-4646.2018.01.006

國家自然科學基金 （81372546）

李丹妮 （1989-） ，女，助教，碩士.

劉云鵬，E-mail：lypcmu@163.com

2017-05-16

網(wǎng)絡出版時間：2017-12-20 14:26

（編輯 于 溪）