滿 達(dá) 木其爾 白明慧 馬十月 黃樹青 金薩出茹拉 特木其樂

(內(nèi)蒙古自治區(qū)國際蒙醫(yī)醫(yī)院，呼和浩特，010065)

薩病是以突發(fā)昏厥、言語及肢體活動障礙為主要表現(xiàn)的蒙醫(yī)白脈疾病[1]。疾病在表現(xiàn)上與中醫(yī)“中風(fēng)”相似，涵蓋現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的腦梗死、腦出血等疾病。因其具有極高的致死和致殘率[2]，歷來受到醫(yī)家的高度重視。蒙醫(yī)藥歷史悠久[3]，經(jīng)典文獻(xiàn)對薩病亦有諸多論述。珍寶丸、嘎日迪十三味丸等名方是目前蒙醫(yī)臨床治療該病的主要藥物[4]，應(yīng)用上述2種藥物的臨床研究報道目前較為多見。但是，對其作用機(jī)制的研究報道較為少見，此外尚有眾多薩病方劑未見系統(tǒng)研究的報道。

基于此現(xiàn)狀，本研究對蒙醫(yī)經(jīng)典文獻(xiàn)進(jìn)行了回顧性分析。將篩選到的薩病方劑信息經(jīng)數(shù)據(jù)挖掘、網(wǎng)絡(luò)分析后得到了這些方劑較為核心的特征，經(jīng)專家討論，確定了核心配伍。進(jìn)一步對核心配伍開展網(wǎng)絡(luò)藥理分析后，得到了蒙醫(yī)薩病藥物作用機(jī)制的預(yù)測結(jié)果，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 資料來源 結(jié)合臨床與文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)目前仍以古方珍寶丸、嘎日迪13味丸為主要藥物，尚無新的自擬方的方劑信息供查詢。所以，我們系統(tǒng)查閱了蒙醫(yī)臨床著作17部，包含了《秘訣方?！贰陡事端牟俊返让舍t(yī)經(jīng)典著作。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) 納入含有完整方劑信息的臨床著作；納入疾病名稱記載為“薩病”“嘎日格病”“嘎日格阿塔病”“怒羅病”“思古德日病”者。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) 排除方劑信息不完整的著作；排除以經(jīng)典注釋為內(nèi)容的著作；排除重復(fù)記載的方劑；關(guān)聯(lián)分析時排除單味藥物組成的方劑。

1.4 數(shù)據(jù)規(guī)范 初篩共得到薩病方劑共133首，排除重復(fù)項(xiàng)及只含單味藥物的方劑，最后將114首方劑納入分析。方中涉及蒙藥192味。關(guān)聯(lián)分析時將方劑中常出現(xiàn)的“六良藥”(紅花、草果、天竺黃、白豆蔻、肉豆蔻、丁香)一并錄入為“六良藥”，最后將193味蒙藥納入分析。參照(2006年出版)教材《蒙藥學(xué)》對藥品名稱進(jìn)行規(guī)范。

1.5 數(shù)據(jù)錄入 方劑以及網(wǎng)絡(luò)藥理研究過程中的成分、靶點(diǎn)、通路等需要整理錄入的信息，均由雙人錄入EXCEL 2007軟件，核對無誤后存為后續(xù)分析軟件方便讀取的CSV格式。

1.6 數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用R 3.4.3(https://www.r-project.org/)對薩病進(jìn)行頻數(shù)、關(guān)聯(lián)分析及可視化；應(yīng)用Gephi 0.9.2(https://gephi.org/)進(jìn)行方劑復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)分析、核心方藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析及可視化；應(yīng)用Cytoscape 3.6.0(http://www.cytoscape.org/)進(jìn)行靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)分析、蛋白質(zhì)互作用網(wǎng)絡(luò)的分析及可視化。成分查找以及潛在靶點(diǎn)的評分、預(yù)測應(yīng)用BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)進(jìn)行。為求結(jié)果更加可靠，本次將評分標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置為≥80分(平臺默認(rèn)設(shè)置為≥20分)。從結(jié)果的“disease”欄中選取與蒙醫(yī)薩病有關(guān)的如Stroke、Brain ischemic insult、Ischemia reperfusion injuries等疾病的對應(yīng)靶點(diǎn)。蛋白質(zhì)互作分析平臺STRING(https://string-db.org/cgi/input.pl)用于所得靶點(diǎn)的互作用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)獲取，同時，通過該平臺獲得薩病相關(guān)信號通路信息。

2 結(jié)果

2.1 藥物頻次統(tǒng)計(jì) 192味藥物當(dāng)中出現(xiàn)頻次大于20次的前10味藥物為黑云香、麝香、白云香、訶子、石菖蒲、草烏、木香、硫磺、牛黃、決明子。見表1。

2.2 關(guān)聯(lián)規(guī)則挖掘 關(guān)聯(lián)規(guī)則分析使用R軟件的arules包來實(shí)現(xiàn)，并用arulesViz包實(shí)現(xiàn)可視化，規(guī)則挖掘的算法為Apriori算法。提取支持度(support)≥20、置信度(confidence)≥80的規(guī)則。所得規(guī)則提升度(lift)均>1。規(guī)則數(shù)據(jù)見表2，氣泡圖見圖1。

表1 薩病方劑使用頻次≥20次的藥物

表2 薩病方劑關(guān)聯(lián)規(guī)則(支持度≥20；置信度≥80)

圖1 薩病方劑關(guān)聯(lián)規(guī)則

2.3 復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)分析 將方劑成分的鄰接表載入Gephi 0.9.2，計(jì)算節(jié)點(diǎn)度(degree)并模塊化(modularity)，全部藥物可分成6個模塊。節(jié)點(diǎn)度大于100的藥物排序?yàn)椋瑚晗?石菖蒲>訶子>黑云香>白云香>紅花>草烏>木香>肉豆蔻>天竺黃>丁香>白豆蔻>牛黃。上述藥物分屬于模塊0、2、3。見圖2。分析網(wǎng)絡(luò)可見，模塊2中的重點(diǎn)藥物多為清熱、解毒、抑“赫依”藥物，如紅花、訶子、肉豆蔻等。模塊0包含黑云香、草烏、石菖蒲等藥物均為剎“粘”藥物，同時部分也有燥“黃水”功效。模塊3中主要為白云香、木香、決明子等具有燥“黃水”祛“巴達(dá)干”功效的藥物。

2.4 核心配伍的確定 結(jié)合上述分析以及前期其他相關(guān)分析以及專家討論意見，確定以麝香、黑云香、木香、訶子、石菖蒲5味藥組成的薩病核心配伍方(暫命名為Sildeg-5)[5]。該5味藥物當(dāng)中除黑云香以外的4味藥是蒙醫(yī)經(jīng)典方嘎日迪5味丸的4個組成藥物。前期研究發(fā)現(xiàn)嘎日迪5味丸在薩病方劑組方當(dāng)中有非常重要的地位，多個方劑是由其為基礎(chǔ)方而組成的。其中包括現(xiàn)臨床使用最廣泛的嘎日迪13味丸。

圖2 薩病方劑復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)

2.5 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.5.1 基于BATMAN-TCM的潛在作用靶點(diǎn)預(yù)測 將上述藥物以組合的方式錄入BATMAN-TCM的Example 2欄當(dāng)中，并設(shè)置Score cutoff為80，Adjusted P-value設(shè)置為默認(rèn)值0.05。運(yùn)行后經(jīng)篩選得到薩病相關(guān)靶點(diǎn)33個，將其錄入蛋白質(zhì)互作用分析平臺STRING。運(yùn)行后得到的網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)載入Cytoscape 3.6.0，互作用網(wǎng)絡(luò)圖見圖3、模塊化網(wǎng)絡(luò)(Gephi)圖見圖4。分析可見degree最高的節(jié)點(diǎn)為F2，其次還有AKT1、PTGS2等，且上述靶點(diǎn)均集中在模塊0當(dāng)中。分析模塊化網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)模塊0包含凝血酶原、外消旋α-絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶等10個蛋白質(zhì)。它們通過參與細(xì)胞應(yīng)對有機(jī)環(huán)狀化合物、應(yīng)對含氧化合物、細(xì)胞發(fā)育、活性氧代謝過程的調(diào)節(jié)等，涉及細(xì)胞凋亡和增殖的調(diào)控過程。模塊5包含的多巴胺受體、5-羥色胺受體等可通過刺激神經(jīng)受體-配體相互作用通路，參與陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控、胺的轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控等生物過程。模塊3主要參與激活G蛋白偶聯(lián)受體信號通路而引起的血管舒張、抑制血小板聚集、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移等過程。模塊1中的纖溶酶原激活物(t-PA)、血栓調(diào)節(jié)蛋白、整合素β2則通過補(bǔ)體和凝血級聯(lián)反應(yīng)途徑參與凝血過程的調(diào)節(jié)。

2.5.2 蛋白質(zhì)富集通路分析 上述潛在靶點(diǎn)富集的通路共有28條，其中p值最小的通路當(dāng)中有14個基因富集在KEGG pathway ID為has04080的神經(jīng)活性配體-受體相互作用信號通路上。其次還有鈣離子信號通路、多巴胺能神經(jīng)突觸、含血清素神經(jīng)突觸等通路。見圖5、6。

圖3 Sildeg-5治療薩病靶點(diǎn)互作用網(wǎng)絡(luò)

圖4 Sildeg-5治療薩病靶點(diǎn)模塊化網(wǎng)絡(luò)

圖5 Sildeg-5治療薩病預(yù)測通路

2.5.3 藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 本方與靶點(diǎn)對應(yīng)成分共有58個，將藥物成分及其預(yù)測靶點(diǎn)資料以鄰接表形式載入軟件，我們得到了Sildeg-5治療薩病成分-靶點(diǎn)及藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。分析可見該網(wǎng)絡(luò)具有少數(shù)成分對應(yīng)多個靶點(diǎn)、少數(shù)靶點(diǎn)對應(yīng)多個成分的蒙藥多成分、多靶點(diǎn)特征。從網(wǎng)絡(luò)可見麝香藥物成分17β-雌二醇在藥物成分當(dāng)中節(jié)點(diǎn)度最高、涉及靶點(diǎn)眾多，節(jié)點(diǎn)度為10。此外麝香成分?jǐn)?shù)雖少于木香，但其預(yù)測作用靶點(diǎn)卻是方中最多的。而靶點(diǎn)當(dāng)中雌激素受體、磷酸二酯酶3A、阿片受體、鹽皮質(zhì)激素受體在網(wǎng)絡(luò)當(dāng)中具有較為重要的地位，其節(jié)點(diǎn)度分別為17、15、11、9。見圖7-9。

圖6 Sildeg-5治療薩病靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)

圖7 Sildeg-5治療薩病成份-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

3 討論

臨床中薩病仍以缺血性腦卒中為主，其次為出血性卒中。卒中后的神經(jīng)損傷是一個多層次、多種途徑參與的復(fù)雜過程。既往單一靶點(diǎn)的干預(yù)并未得到令人滿意的治療效果，從而使得神經(jīng)血管單元(Neurovascular Unit，NVU)的概念被提出[6]。蒙藥多組分、多靶點(diǎn)的作用機(jī)制恰好符合NVU的概念及其基于NVU的治療理念。

圖8 Sildeg-5治療薩病藥物-成份-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

圖9 Sildeg-5治療薩病藥物成分-靶點(diǎn)數(shù)量對照

本方組成為蒙醫(yī)經(jīng)典方嘎日迪5味丸當(dāng)中的四味藥物-石菖蒲、麝香、木香、訶子另加黑云香共5味。石菖蒲即為蒙藥“烏木黑哲格蘇”，有助胃火、消食、開胃、止腐、殺粘、排黃水功效?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)其有效成分可能通過抑制細(xì)胞色素C和Caspase-3的激活[7]、抑制受損神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平增高[8]、穩(wěn)定細(xì)胞線粒體膜電位[9]、抑制BAX基因表達(dá)，增強(qiáng)BCl-XL基因表達(dá)等途徑對缺血再灌注損傷等神經(jīng)損傷具有保護(hù)作用[10]。本方當(dāng)中石菖蒲成分對應(yīng)的潛在靶點(diǎn)有磷酸二酯酶3A(PDE3A)、電壓門控鉀通道亞家族成員5(KCNA5)、γ-氨基丁酸A型受體γ2亞基(GABRG2)、γ-氨基丁酸受體亞基a5(GABRA5)、雌激素受體(ESR1)、乙酰膽堿酯酶(ACHE)6個靶點(diǎn)。分析發(fā)現(xiàn)PDE3A不僅對應(yīng)石菖蒲的成分，同時還受麝香、木香、黑云香成分的調(diào)控。PDEs能夠通過催化細(xì)胞內(nèi)的cGMP和cAMP水解而影響生物體的代謝功能，包括與薩病有直接關(guān)聯(lián)的抑制血小板聚集過程。磷酸二酯酶抑制劑潘生丁、西洛他唑以及其受體拮抗劑噻氯吡啶、氯吡格雷均作為抗血小板聚集藥物而應(yīng)用于卒中臨床[11-18]。民族藥方面也有相關(guān)研究報道，如譚萍等[19]研究發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物中槲皮素能抑制血小板PDE3活性，具有抗血小板聚集作用。

蛋白質(zhì)互作用網(wǎng)絡(luò)當(dāng)中與PDE3A關(guān)系最緊密的為AKT1，AKT1也是蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)之一。AKT是一種處于P13K/Akt信號通路核心部位的絲氨酸/蘇氨酸激酶，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、生長、抑制細(xì)胞凋亡等作用，AKT1為其中一種亞型。近年來的一系列研究發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt信號通路與腦缺血損傷有密切的關(guān)系[13，16]，中醫(yī)藥領(lǐng)域亦不乏相關(guān)研究[14-15，17-18]，但尚缺少蒙醫(yī)藥在這一方面的研究報道。本研究數(shù)據(jù)可見AKTI其對應(yīng)的成分為22,23-二氫豆甾醇(β-谷甾醇)。β-谷甾醇廣泛存在與多種植物當(dāng)中，因其具有抗癌、抗炎、抗氧化、降血脂、抑制血小板聚集等多種作用而受到關(guān)注[20-21]。此外β-谷甾醇尚具有植物雌激素樣作用，其作為弱激動劑，可作用于雌激素受體(ESR)，而ESR又與腦損傷的神經(jīng)保護(hù)密切相關(guān)[22]。

本方當(dāng)中β-谷甾醇來源于蒙藥木香。木香的蒙藥名稱為“如達(dá)”，蒙醫(yī)認(rèn)為如達(dá)具有祛巴達(dá)干、調(diào)和氣血、調(diào)和體素、止痛等功效。方中其成分最多且對應(yīng)的靶點(diǎn)也僅次于麝香，當(dāng)中不僅有前述關(guān)鍵靶點(diǎn)AKT、PDE,還有腦缺血損傷后神經(jīng)保護(hù)相關(guān)蛋白NR3C2、GRIN2B、ESR1等。研究發(fā)現(xiàn)鹽皮質(zhì)激素(NR3C2)除在腎臟表達(dá)外還在人的大腦中有高表達(dá)。其受體拮抗劑可通過防止內(nèi)皮功能紊亂、氧化應(yīng)激以及血管重塑等途徑而可能對腦卒中有干預(yù)作用[23]。GRIN2B是配體門控離子通道-N-甲基-D-天冬氨酸(NMDAR)中的主要功能亞單位。神經(jīng)元細(xì)胞在持續(xù)缺血缺氧情況下釋放谷氨酸等興奮性氨基酸，通過對細(xì)胞膜上的NMDA通道的激活，進(jìn)而介導(dǎo)Ca2+大量內(nèi)流，形成細(xì)胞內(nèi)鈣超載，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡，也就是所謂的“興奮性毒性”。根據(jù)NMDR受體亞型學(xué)說，GRIN2A負(fù)責(zé)激動神經(jīng)細(xì)胞的成活信號系統(tǒng)，而GRIN2B則負(fù)責(zé)激活死亡信號系統(tǒng)[24]。不過，GRIN2B的激活還只是這一信號系統(tǒng)的啟動階段，此后還有諸多下游信號蛋白參與細(xì)胞的死亡過程，包括本方靶點(diǎn)之一的一氧化氮合酶(NOS)[25]。

如前所述，雌激素受體(ESR1/2)參與介導(dǎo)17β雌二醇等雌激素對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用，其機(jī)制可能有拮抗NMDA受體介導(dǎo)興奮性氨基酸毒性作用、抗氧化應(yīng)激、抗炎、抑制β-淀粉樣蛋白沉積等[26]。回顧預(yù)測數(shù)據(jù)可見雌激素受體可受方中多種成分調(diào)節(jié)，其中目前已明確的對應(yīng)成分(Known Target in DrugBank,KEGG,TTD)為來自麝香的17β雌二醇。麝香是一種名貴藥材，蒙醫(yī)認(rèn)為其有殺粘、燥黃水、解毒、開竅之功效，是薩病方劑網(wǎng)絡(luò)當(dāng)中degree最高的藥物。本次預(yù)測研究過程中，麝香貢獻(xiàn)了14個成分、涉及25個靶點(diǎn)，其中17β雌二醇的degree最高。除上述機(jī)制以外，17β雌二醇可能的神經(jīng)保護(hù)途徑還與抑制DKK-1的表達(dá)和激活Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)[27]。

此外，訶子、黑云香在蒙醫(yī)方劑當(dāng)中是應(yīng)用較為廣泛的藥物。訶子，蒙醫(yī)謂其“藥中之王”，有祛“邪病”、解毒、調(diào)三根、止瀉功效。研究發(fā)現(xiàn)，訶子具有抗炎、抗病毒、抗氧化、抗癌等藥理作用[28]。本研究發(fā)現(xiàn)訶子成分Linoleic Acid(亞油酸)對應(yīng)靶點(diǎn)前列腺素內(nèi)過氧化物酶2(PTGS2)的評分高達(dá)686分。已知PTGS2可引起炎性反應(yīng)并介導(dǎo)炎性細(xì)胞毒性，急性腦缺血事件中，PTGS2可從神經(jīng)元、血管、血腦屏障幾個層面參與中樞神經(jīng)損傷[29]。另外訶子的靶點(diǎn)也包括與腦缺血損傷密切相關(guān)的胺類受體5-羥色胺受體(HTR2A、HTR1A)和多巴胺受體(DRD2、DRD3)。HTR、DRD也作為神經(jīng)活性配體-受體互作用通路上的重要蛋白質(zhì)而成為多種藥物的靶點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)多巴胺受體參與卒中后穩(wěn)定血腦屏障的過程[30]，DRD2激動劑則具有廣泛的抗凋亡性質(zhì)[31]、參與神經(jīng)再生和血管新生作用[32]。黑云香(目前制劑應(yīng)用沒藥)是薩病方及網(wǎng)絡(luò)當(dāng)中節(jié)點(diǎn)度僅次于麝香的藥物。黑云香具有殺粘、鎮(zhèn)刺痛、消腫等功效。蒙醫(yī)薩病急性期尤其昏迷患者可應(yīng)用黑云香鼻熏治療，方劑分析還發(fā)現(xiàn)其他薩病的鼻熏劑當(dāng)中，黑云香也與石菖蒲配伍而作為核心藥物來應(yīng)用。本次其預(yù)測靶點(diǎn)有阿片受體、t-PA、γ-氨基丁酸受體、血管緊張素Ⅱ受體等。其中成分Cinnamaldehyde(肉桂醛)與阿片受體結(jié)合的評分高達(dá)373分、Eugenol(丁香酚)與阿片受體結(jié)合的評分114分，這一結(jié)果與黑云香鎮(zhèn)痛作用高度吻合，也側(cè)面說明本次預(yù)測研究的可靠性。前期尚未見黑云香在薩病治療當(dāng)中單獨(dú)或入方應(yīng)用時其作用機(jī)制方面的報道，本研究得到的潛在靶點(diǎn)可為進(jìn)一步研究其作用機(jī)理提供一定參考。黑云香靶點(diǎn)當(dāng)中t-PA(t-PA)存在于神經(jīng)血管單元的微小血管和星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突觸膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元當(dāng)中[33]，t-PA除溶栓作用外,還能在病理狀態(tài)下通過激活MMPs以及其他信號通路釋放其神經(jīng)毒性作用,損傷血腦屏障(BBB)加重NVU的損傷[34-35]。

本研究初步預(yù)測Sildeg-5可能從神經(jīng)血管單元的各個層面干預(yù)薩病病理過程。其通過多成分、多靶點(diǎn)以及多條通路干預(yù)薩病治療的機(jī)理仍有待于進(jìn)一步挖掘研究并要通過實(shí)驗(yàn)過程來驗(yàn)證。