鄒華彬

(山東大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，濟南，250100)

亦采用雙指標(biāo)等級序列個性化模式識別法[29-30,33]對4種中藥紅外指紋圖譜進行了分析，當(dāng)統(tǒng)計相似尺度Pg≥Pg+1.1S～Pg≥Pg+1.3S時，可以精確鑒別4種復(fù)方，且樣品的正確識別率為90.5%～95.2%。2種理論方法的分析結(jié)果等價，皆可以將4種組成相似的生物復(fù)雜體系-中藥復(fù)方進行精確鑒別分類，且相互驗證。但2個中藥品種常數(shù)具有確定的絕對定量標(biāo)準(zhǔn)，且具有鑒別判斷的簡易性、明確的物理意義和生物學(xué)意義。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 美國NICOLET-5700-FT-IR傅立葉變換紅外光譜儀(光譜范圍4 000～400 cm-1,分辨力4 cm-1)；高速粉碎機，壓片機，分析天平(METTLE TOLEDO),靈敏度0.1 mg。

1.2 試劑 溴化鉀(分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)。

1.3 分析樣品 桂附地黃丸、明目地黃丸、金匱腎氣丸及知柏地黃丸(皆為水丸或濃縮丸)樣品如下。見表1。

本論文中所研究的4種中藥復(fù)方組成如下[40]：

桂附地黃丸：地黃、茯苓、牡丹皮、山藥、山茱萸、澤瀉、附子、肉桂。

金匱腎氣丸：地黃、茯苓、牡丹皮、山藥、山茱萸、澤瀉、附子、牛膝、車前子、桂枝。

明目地黃丸：地黃、茯苓、牡丹皮、山藥、山茱萸、澤瀉、白芍、當(dāng)歸、枸杞、蒺藜、菊花、石決明。

知柏地黃丸：地黃、茯苓、牡丹皮、山藥、山茱萸、澤瀉、黃柏、知母。

由上述4種中藥復(fù)方的組成分看，他們皆具有6種相同的草藥，金匱腎氣丸與桂附地黃丸具有7種相同的草藥。4種中藥復(fù)方之間的化學(xué)成分具有很高的相似組成，且各自的化學(xué)成分具有非常高的復(fù)雜性。因此，準(zhǔn)確鑒別它們具有極大的困難。

2 方法與結(jié)果

2.1 理論方法 2個中藥品種常數(shù)的理論推導(dǎo)根據(jù)生物體系的雙指標(biāo)信息理論方程-生物遺傳與變異信息理論方程[38]。任意2個樣品或任意樣品2個不同演化階段的遺傳與變異信息量為:

表1 4種中藥復(fù)方樣品

I=-(PglnPg+PalnPva+PblnPvb)(1)

下面列出各個變量定義見文獻[5-9]：

共有峰率Pg:2個比較的指紋圖譜a、b中的共有峰數(shù)與該2個指紋圖譜的獨立峰數(shù)Nd的比值。Pg它只是共有峰Ng的函數(shù)。簡化表示為P。該共有峰率指標(biāo)與Jaccard及Sneath、Sokal系數(shù)[41]本質(zhì)相同。

Pva:圖譜a的變異峰率。Pvb:圖譜b的變異峰率。

Pa=na/Nd,Pb=nb/Nd(5)

Pa,Pb分別是樣品a,b的變異峰占獨立峰的比例。

表2 最大信息量區(qū)間之Pg及其該區(qū)間對應(yīng)的信息量變化率

注：*對稱度為α=0.5,1時，最大信息量對應(yīng)的共有峰率Pg=0.61;△對稱度為α=0時，最大信息量對應(yīng)的供共有峰率Pg=0.70。根據(jù)圖1信息理論方程曲線，以最大信息量點對應(yīng)的Pg為中心，取其左右各變化0.05計算信息量，以直觀給出信息量的變化程度。對稱度ɑ=0，對應(yīng)的最大信息量點為Pg=0.70=70%；對稱度ɑ=0.5,1,對應(yīng)的最大信息量點皆為Pg=0.61=61%.插入Pg=0.66這個點，是為了增加數(shù)據(jù)點的密度

圖1 信息理論方程曲線

注：對稱變異曲線對稱度α=1(Pa=Pb)，非對稱變異曲線α=0.5(Pb=1/2Pa)，α=0(Pa≠0，Pb=0)

各類指紋峰之間的關(guān)系為:Nd=Ng+na+nb，Na=Ng+na,Nb=Ng+nb

Nd:2個相互比較的指紋圖譜的獨立峰，即指比較的2個指紋圖譜a、b中吸收峰的種類數(shù)。Na:指紋圖譜a的總指紋峰數(shù)。Nb：指紋圖譜b的總指紋峰數(shù)。na：圖譜a的變異峰數(shù)；nb：圖譜b的變異峰數(shù)。

該方程存在著2個極大值信息量，分別對應(yīng)于對稱變異Pa=Pb，α=1,共有峰率為Pg=61.0%，及極端非對稱變異，α=0,Pa≠0，Pb=0，共有峰率為69.5%。見圖1。

根據(jù)I～Pg圖，可以發(fā)現(xiàn)，對于對稱變異α=1及非對稱變異α=0.5曲線的最高點在Pg=0.610,且在Pg=0.610附近存在一個平坦區(qū)域，信息量變化不大。而對于極端非對稱變異α=0，曲線的最高點在Pg=0.695，且在Pg=0.695附近存在一個平坦區(qū)域，信息量變化很小。

當(dāng)對稱性系數(shù)α=1,α=0.5,最大信息量對應(yīng)的Pg皆為0.61，最大信息對應(yīng)的共有峰率Pg區(qū)間皆對應(yīng)于0.55～0.66。

無論在對稱變異還是非對稱變異，在最大信息量對應(yīng)的共有峰率Pg左右變化5%的范圍內(nèi)，信息量的變化皆小于2.49%，小于3%。這說明，由于各種因素導(dǎo)致的生物變異的變化相對于最大信息量點之Pg±5%的范圍內(nèi)，最大信息量變化小于2.49%，該變化范圍可以認為處于中藥品種特征的臨界變化區(qū)域。見表2。

2個樣品的共有峰率越高，相似性越大，品質(zhì)越相似。因此，根據(jù)表1，考慮到各類因素對中藥及實驗的隨機波動性影響，可以確定Pg=61%及Pg=70%作為判別生物體系的品種常數(shù)及優(yōu)化判別中藥品種的絕對理論標(biāo)準(zhǔn)，其變化區(qū)間為Pg≥(61±3)%及Pg≥(70±3)%,結(jié)合最大有效樣本數(shù)法對樣本集進行合理優(yōu)化分類[37]，同時可以避免為了追求基于經(jīng)驗知識的完全分類而形成的過度分類，如神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法中易出現(xiàn)的過度分類。

2.2 實驗方法

2.2.1 實驗條件 中藥樣品粉碎并過80目篩，60 ℃烘干2 h，<4 ℃保存。KBr壓片法測試紅外指紋圖譜。每個樣品平行測量指紋圖譜6次，每個樣品的紅外指紋圖譜峰波數(shù)是6次測量中出現(xiàn)次數(shù)的平均值。紅外指紋圖譜以約25 cm-1平滑處理，最佳靈敏度80。

2.2.2 重復(fù)性實驗和穩(wěn)定性實驗 樣品S20平行測量6次，任意4次測量指紋圖譜中每個吸收峰波數(shù)的平均值構(gòu)成組合數(shù)值指紋圖譜。他們之間的最低共有峰率為93%，具有優(yōu)良的重復(fù)性。原藥粉末在<4 ℃下保存，具有良好的穩(wěn)定性。

2.3 指紋圖譜測定與實驗數(shù)據(jù)分析

2.3.1 指紋圖譜測定 根據(jù)實驗條件，測試4類42個中藥復(fù)方原藥粉末的紅外指紋圖譜。見圖2～5。由圖2～5可見，4種復(fù)方中藥原藥粉末的紅外指紋圖譜具有很高的相似性及復(fù)雜性，極難憑觀察直觀鑒別4類中藥原藥粉末的紅外指紋圖譜。必須用數(shù)理分析方法對其指紋圖譜數(shù)據(jù)進行分析，以得到嚴(yán)謹精確的品質(zhì)鑒別結(jié)果。

圖2 桂附地黃丸和金匱腎氣丸原藥粉末紅外指紋圖譜疊加圖

注：在1 600 cm-1處由下至上分別為桂附地黃丸S1,S3,S8,S10,金匱腎氣丸S11,S14,S18

圖3 明目地黃丸和知柏地黃丸原藥粉末紅外指紋圖譜疊加圖

注：在1 600 cm-1處由下至上明目地黃丸S24,S26,S32,知柏地黃丸S34,S38,S42

圖4 桂附地黃丸，金匱腎氣丸，明目地黃丸,知柏地黃丸原藥粉末紅外指紋圖譜疊加圖

注：在1 600 cm-1處由下至上分別為桂附地黃丸S1,S3,S8,S10,金匱腎氣丸S11,S14,S18，明目地黃丸S24,S26,S32,知柏地黃丸S34,S38,S42

圖5 桂附地黃丸，金匱腎氣丸，明目地黃丸,知柏地黃丸原藥粉末紅外指紋圖譜疊加圖

注：2 900 cm-1處由下至上桂附地黃丸S1,S3,S8,S10,金匱腎氣丸S11,S14,S18明目地黃丸S19,S24,S26,S32,知柏地黃丸S34,S37,S38,S42

2.3.2 實驗數(shù)據(jù)分析 采用Shapiro-Wilk檢驗方法，確定每個樣品的組合指紋圖譜峰及42個樣品的共有峰及變異峰。以任一樣品為標(biāo)準(zhǔn)，計算其他樣品與該樣品的共有峰率，并按共有峰率由高到低的方法排序，構(gòu)成樣本及其對應(yīng)的共有峰率的符號-數(shù)值二元序列，即雙指標(biāo)序列。根據(jù)得到的2個中藥品種理論判別標(biāo)準(zhǔn)Pg=61.0%,Pg=69.5%，結(jié)合群體特征序列最大有效樣本數(shù)法[38]：

Y:群體特征序列最大有效樣本數(shù);Nci:第i個樣本的核心特征序列中的樣本數(shù)；Nri:第i個樣本的關(guān)聯(lián)序列中的樣本數(shù)；M：群體樣本總數(shù)。Y反映了群體分類中有效分類程度，Y越大說明品質(zhì)聚分類越清晰，關(guān)聯(lián)序列中的樣本數(shù)越少，核心特征序列中的樣本數(shù)越多，越接近理想聚分類。

分別在Pg≥(61±3)%,Pg≥(70±3)%優(yōu)化Pg，得到4個品種的整體優(yōu)化特征序列，即樣品清晰分類且具有最大有效樣本數(shù)，以實現(xiàn)4種中藥復(fù)方6種兩兩配對關(guān)系的精確鑒別。

當(dāng)Pg≥61%，Pg≥72%時4種中藥經(jīng)過優(yōu)化的特征序列。見表3。

采用鑒別標(biāo)準(zhǔn)Pg≥61%，由每個樣品的特征序列看，下列5個藥品配對可以得到精確鑒別：桂附地黃丸-金匱腎氣丸；桂附地黃丸-明目地黃丸；金匱腎氣丸-明目地黃丸；金匱腎氣丸-知柏地黃丸；明目地黃丸-知柏地黃丸。

而桂附地黃丸-知柏地黃丸二者的特征序列交疊嚴(yán)重，無法清晰區(qū)分二者。因而無法得到準(zhǔn)確鑒別。

表3 4種中藥經(jīng)過優(yōu)化的特征序列

注：a.核心特征序列；b,關(guān)聯(lián)序列，該序列部分中的樣品不屬于核心特征序列樣品對應(yīng)的類。每個樣品的特征序列由核心特征序列+關(guān)聯(lián)序列構(gòu)成。c,特征序列中的斜黑體部分，表示當(dāng)鑒別標(biāo)準(zhǔn)Pg≥72%時4種中藥的特征序列，而每個樣本的整個序列表示Pg≥61%時4種中藥的特征序列

當(dāng)Pg≥72%時，S35，S37的特征序列中，關(guān)聯(lián)序列等于或長于核心特征序列，因而無法正確識別，其余40個樣品得到正確的品種判別，正確識別率為40/42=95.2%,錯誤識別率為2/42=4.8%。不僅上述5個藥品對得到精確鑒別，在此情況下，桂附地黃丸-知柏地黃丸也得到精確鑒別。對于桂附地黃丸-知柏地黃丸配對，依據(jù)非對稱變異品種常數(shù)Pg=70(69.5)%，結(jié)合群體特征序列最大有效樣本數(shù)法[37]，在不同Pg條件下，優(yōu)化分類樣品，所得結(jié)果見表4。

表4 4種復(fù)方非對稱變異常數(shù)Pg=(70±x*)%的優(yōu)化結(jié)果

x*，x=-1,0,1,2,5

由表4結(jié)果知，當(dāng)Pg≥69%～75%時，桂附地黃丸-知柏地黃丸藥品對皆可得到精確鑒別。但Pg≥72%時，有效樣本數(shù)最大，分類最合理，而Pg≥75%時，雖然樣本的正確識別了100%，但有效樣本數(shù)最小，說明過度分類，并不合理。通過對實驗測量的指紋圖譜數(shù)據(jù)進行詳細分析，可以發(fā)現(xiàn)評判這4類中藥的品種標(biāo)準(zhǔn)可以確定為Pg≥61%，Pg≥72%。見表5。

表5 4種復(fù)方配對遵從的品種常數(shù)Pg(%)

在上述相似尺度下，6對中藥配對皆可得到準(zhǔn)確判別分類，樣品正確識別率95.2%，具有最大有效樣本數(shù)。在類的層次上，類的正確識別率為100%。

3 討論

中藥品種的科學(xué)鑒別是中藥現(xiàn)代研究的核心課題之一。只有在科學(xué)上絕對保證品種鑒別的可靠性，才能保證療效的可靠性，為中醫(yī)藥正名，并為中醫(yī)藥的現(xiàn)代深化科學(xué)研究奠定不可動搖的基礎(chǔ)。目前的中藥品種鑒別都基于經(jīng)驗知識，即使是眾多的模式識別理論方法，也是基于經(jīng)驗知識或?qū)W習(xí)樣本獲得經(jīng)驗參量，這些方法皆無法得到不可懷疑的結(jié)論。本研究根據(jù)生物體系共有遺傳變異信息理論方程確定了2個中藥品種常數(shù)Pg=61%，Pg=70%，在科學(xué)上提出了2個判別中藥品種的絕對理論定量標(biāo)準(zhǔn)?；谒鼈兘⒌?個品種判別理論標(biāo)準(zhǔn)Pg≥(61±3)%及Pg≥(70±3)%，對4種組成相似的中藥復(fù)方的6種配對進行了精確鑒別。結(jié)合文獻[37-39]可以證明，基于生物遺傳與變異信息理論方程在2種變異狀態(tài)取得最大信息量所對應(yīng)的共有峰率[37]，確實可以反映生物體系的本質(zhì)相似特征。該理論方法無需任何經(jīng)驗知識、主觀設(shè)定參數(shù)，只需依據(jù)實驗測量值，結(jié)合最大有效樣本數(shù)法就可實現(xiàn)對某些中藥這類生物復(fù)雜體系的精確鑒別及模式識別。最大有效樣本數(shù)法可以防止其他模式識別方法容易產(chǎn)生的過度擬合分類現(xiàn)象，而保證給出最優(yōu)合理結(jié)果。這也證明，在生物體系中同樣存在如同物理學(xué)、化學(xué)中的精確定理定律，有待人們?nèi)グl(fā)現(xiàn)。

依據(jù)生物遺傳與變異信息理論推導(dǎo)的2個中藥品種絕對定量標(biāo)準(zhǔn)而不是依據(jù)經(jīng)驗標(biāo)準(zhǔn)對中藥精確鑒別，這應(yīng)是生物體系中藥鑒別理論方法的一個重要突破。該理論方法亦具有巨大的簡易性，且也應(yīng)適用于任意生物體系的精確分類鑒別。另一方面，作者多年的系統(tǒng)實驗研究及理論研究發(fā)現(xiàn)，基于生物體系的紅外、液相指紋圖譜信息及分子種類信息對生物體系進行鑒別、分類、聚類及模式識別研究，結(jié)果較基于成分的含量信息更可靠。因為這些信息主要反映的是生物體系的物質(zhì)結(jié)構(gòu)信息，結(jié)構(gòu)決定功能，結(jié)構(gòu)決定品種特性。理論上，這2個品種常數(shù)適用于基于紅外指紋圖譜、液相指紋圖譜、分子種類信息的生物體系品種的絕對定量鑒別。

目前的中醫(yī)藥研究，主要聚焦于其中的化學(xué)成分、功效研究，對中醫(yī)藥數(shù)理基礎(chǔ)理論研究工作缺乏應(yīng)有的重視。要使以幾千年經(jīng)驗為基礎(chǔ)的中醫(yī)藥演化至以數(shù)理理論為基礎(chǔ)的現(xiàn)代科學(xué)，發(fā)現(xiàn)其中的精確科學(xué)原理，用于更好地指導(dǎo)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究，還有漫漫之路有待探索。但這是能夠發(fā)揚光大祖國中醫(yī)藥學(xué)的必由之路。

致謝：本文部分數(shù)據(jù)取自我的研究生韓智峰、張新玲的畢業(yè)論文。