伊麗娜 張 屏 張 烜 昌妍希 杭凌宇 包保全

(1 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學藥學院，呼和浩特，010100； 2 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，呼和浩特，010100)

查干湯又名四味土木香散，為蒙醫(yī)治療瘟疫熱病的經(jīng)典方和基礎方，由土木香、苦參、懸鉤子木和山柰四味藥材粗粉，按比例(4∶ 4∶ 2∶ 1)混合制成，1977年作為首批民族用藥載入《中華人民共和國藥典》[1]，具有清瘟解表、使“未成熟熱成熟”之功效，用于瘟病初期，發(fā)熱發(fā)冷，頭痛咳嗽，咽喉腫痛，胸脅作痛等癥[2]，經(jīng)辨證加味可形成60多方，用于不同瘟疫熱癥的治療，在蒙醫(yī)藥中具有重要的地位和作用[3-5]。方中土木香、苦參和懸鉤子木同為“促熱疾成型類”蒙藥，山柰為“祛巴達干類”蒙藥[6-7]。前期研究表明，該方不同極性提取物，具有一定程度的鎮(zhèn)痛、抗菌、抗炎作用[8-9]，并從懸鉤子木中分離得到抗炎、抗氧化活性物質(zhì)[10-11]。我們以小鼠脾淋巴細胞生長率、細胞因子白細胞介素-2和干擾素-γ為指標，考察該方對免疫功能的影響，并用拆方、提取不同極性部位以及測定主要化學成分等方法，探尋該方中免疫增強活性成分，為揭示該方治療瘟疫熱癥的藥效物質(zhì)基礎提供新的思路與方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級BALB/c純系小鼠，雌雄兼用，6～8周齡，體重20～22 g，購于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學實驗動物中心。飼養(yǎng)于室溫25 ℃，SPF級環(huán)境。

1.1.2 藥物 土木香(20140101)、苦參(20140101)購于濟南人和中藥飲片有限公司，山柰(1510179)購于河北省福君堂藥業(yè)有限公司。上述藥材經(jīng)檢驗，均符合2015年版《中華人民共和國藥典》標準。懸鉤子木藥材2015年10月野生采集自內(nèi)蒙古赤峰市巴林右旗，取其莖枝陰干。原植物經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學藥學院包保全教授鑒定，為薔薇科懸鉤子屬植物庫頁懸鉤子RubussachalinensisLeveille.，模式標本存放于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學藥學院標本室。

土木香內(nèi)酯(LPT2014005)、異土木香內(nèi)酯(LPT2014011)、對甲氧基桂皮酸乙酯(110835-201603)、苦參堿(110805-200508)和氧化苦參堿(110780-200506)對照品(中國藥品生物制品檢定所)；肉桂酸乙酯(MAYA-CR5019)對照品(浙江瑪雅試劑有限公司)。

1.1.3 試劑與儀器 刀豆蛋白(ConA)(美國Sigma公司)；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)(美國Gibco公司)；CCK-8試劑盒(日本同仁研究院)；小鼠淋巴細胞分離液、小鼠白細胞介素-2(IL-2)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒、小鼠干擾素-γ(IFN-γ)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒(達科為生物技術(shù)有限公司)；HF90二氧化碳培養(yǎng)箱(力康生物醫(yī)療科技控股有限公司)；Multiskan GO酶標儀、SW-CJ-2FD超凈工作臺(美國Thermo公司)；DFC450C倒置相差顯微鏡(德國Leica公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 實驗組加入100 μL終濃度為25.0、50.0、100.0、200.0 μg/mL的“查干湯”及其組方藥材水提物；陽性對照組加入100 μL終濃度為2.5 μg/mL的ConA，陰性對照組加入100 μL RPMI 1640培養(yǎng)基，置5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)48 h，離心收集上清，-20 ℃保存。

1.2.2 給藥方法 水提物的制備：查干湯及其組方藥材粗粉，分別加10倍量水，回流提取3次，0.5 h/次，合并提取液，濃縮，冷凍干燥，即得。

醇提物的制備：查干湯及其組方藥材粗粉，95%乙醇回流提取1次，再用75%乙醇回流提取2次，每次2 h，合并提取液，濃縮至無醇味，冷凍干燥，即得。

不同極性懸鉤子木提取物的制備：懸鉤子木醇提物，用10倍量水混懸，依次用等體積的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，減壓回收溶劑，即得。

給藥樣品的配制：上述提取物和6個指標性成分稱重后溶解在DMSO中，配制成200.0 mg/mL的母液，用RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋至不同濃度，備用。

小鼠脾淋巴細胞懸液的制備：脫頸椎處死小鼠，75%乙醇浸泡消毒，無菌條件下取出脾臟，置4～5 mL Mouse 1×淋巴細胞分離液中，輕研，200目尼龍網(wǎng)濾過。把懸有脾淋巴細胞的分離液立即轉(zhuǎn)移至離心管中，覆蓋500～1 000 μL RPMI 1640培養(yǎng)基，800×g離心30 min，吸取淋巴細胞層，再加入10 mL RPMI 1640培養(yǎng)基，顛倒洗滌，250×g離心10 min，收集細胞[12]。傾倒上清液，用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸細胞，臺盼藍染色計數(shù)，活細胞數(shù)大于95%，調(diào)整細胞濃度為5×106/mL，備用。

1.2.3 檢測指標與方法 將脾淋巴細胞懸液加入96孔細胞培養(yǎng)板，每孔100 μL。實驗組分別加入100 μL終濃度為0.7、3.3、16.7、50.0、100.0、200.0 μg/mL的待測藥物，陽性對照組加入100 μL終濃度為2.5 μg/mL的ConA，陰性對照組加入100 μL RPMI 1640培養(yǎng)基，置5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μL CCK-8溶液，置5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃反應4 h，酶標儀檢測450 nm處的吸光度(A)。

淋巴細胞生長率(%)=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%(As實驗孔；Ac對照孔；Ab空白孔)。

白細胞介素-2和干擾素-γ的誘生及測定：將脾淋巴細胞懸液加入96孔細胞培養(yǎng)板，每孔100 μL。按照試劑盒說明，用ELISA測定細胞上清液中白細胞介素-2和干擾素-γ的水平[13-19]。

2 結(jié)果

2.1 水提物對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響 在一定濃度范圍內(nèi)，各樣品均能不同程度提高淋巴細胞生長率。復方、苦參、懸鉤子木和山柰水提物在0.7～200.0 μg/mL均能促進脾淋巴細胞增殖，且3個組方藥材的促增殖作用均呈劑量依賴性；土木香在0.7～50.0 μg/mL能促進脾淋巴細胞增殖，高濃度100.0、200.0 μg/mL無促增殖作用。見表1。藥物對脾淋巴細胞增殖作用強弱順序為，山柰水提物>懸鉤子木水提物>苦參水提物>復方水提物>土木香水提物(圖1)。

表1 查干湯及其組方藥材水提物對小鼠脾淋巴細胞生長率的影響

注：陰性對照細胞生長率為100%；與陰性對照組比較，*P<0.05

圖1 查干湯及其組方藥材水提物對小鼠 脾淋巴細胞增殖的影響

注：A查干湯水提物；B土木香水提物；C苦參水提物；D懸鉤子木水提物；E山柰水提物

2.2 醇提物及組方藥材中主要化學成分對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響 復方及其各組方藥材醇提物，土木香指標性成分土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯，山柰指標性成分肉桂酸乙酯和對甲氧基桂皮酸乙酯，苦參指標性成分苦參堿和氧化苦參堿，懸鉤子木石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇層粗提物，在0.7～200.0 μg/mL藥物濃度均無促進脾淋巴細胞增殖作用，各劑量組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.3 水提物對小鼠脾淋巴細胞誘生白細胞介素-2和干擾素-γ的影響 復方及其組方藥材水提物均能促進脾淋巴細胞分泌白細胞介素-2，復方、苦參和懸鉤子木水提物在50.0～200.0 μg/mL均能促進脾淋巴細胞分泌白細胞介素-2；土木香水提物在25.0～100.0 μg/mL能促進脾淋巴細胞分泌白細胞介素-2；山柰水提物在25.0～200.0 μg/mL均能促進脾淋巴細胞分泌白細胞介素-2。見表2。藥物對小鼠脾淋巴細胞分泌白細胞介素-2的影響強弱順序為，山柰水提物>苦參水提物>復方水提物>懸鉤子木水提物>土木香水提物。見圖2。

復方及其組方藥材苦參、懸鉤子木和山柰水提物在25.0～200.0 μg/mL均能促進脾淋巴細胞分泌干擾素-γ；土木香水提物對脾淋巴細胞分泌干擾素-γ水平無明顯影響。見表2。藥物對小鼠脾淋巴細胞分泌干擾素-γ的影響強弱順序為，山柰水提物>苦參水提物>復方水提物>懸鉤子木水提物>土木香水提物。見圖3。

表2 查干湯水提物對小鼠脾淋巴細胞誘生白細胞介素-2和干擾素-γ的影響

注：與陰性對照組比較，*P<0.05

3 討論

該實驗在復方、組方藥材、提取物和指標性成分層面上，研究了查干湯及其組方藥材對免疫功能的影響。結(jié)果，復方及其組方藥材的水提物均能促進脾淋巴細胞增殖，并通過分泌白細胞介素-2和干擾素-γ發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，但其醇提物、指標性成分以及懸鉤子木不同極性部位均無作用。結(jié)果表明，該方發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能的藥效物質(zhì)基礎為其中水溶性成分，應進一步對該方的水提物進行系統(tǒng)的化學成分和作用機制研究。同時，本研究為該方的傳統(tǒng)劑型“水煎劑”提供了實驗依據(jù)，為現(xiàn)代劑型開發(fā)奠定基礎。

圖2 查干湯及其組方藥材水提物對小鼠脾淋巴細胞誘生白細胞介素-2的影響

注：A查干湯水提物；B土木香水提物；C苦參水提物；D懸鉤子木水提物；E山柰水提物

圖3 查干湯及其組方藥材水提物對小鼠脾淋巴細胞誘生干擾素-γ的影響

注：A查干湯水提物；B土木香水提物；C苦參水提物；D懸鉤子木水提物；E山柰水提物

查干湯為瘟疫熱癥基礎方，方中土木香、苦參和懸鉤子木為“促熱疾成型類”蒙藥，山柰為“祛巴達干類”蒙藥。實驗表明，兩類蒙藥及其復方均能促進脾淋巴細胞增殖，具有一定的免疫增強作用，在一定程度上闡釋了治療瘟疫熱癥用蒙藥的功效主治與藥效學之間的聯(lián)系，為該類蒙藥的藥效物質(zhì)基礎研究提供新的思路與方法。