伊麗娜 張 屏 張 烜 昌妍希 杭凌宇 包保全

(1 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，呼和浩特，010100； 2 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，呼和浩特，010100)

查干湯又名四味土木香散，為蒙醫(yī)治療瘟疫熱病的經(jīng)典方和基礎(chǔ)方，由土木香、苦參、懸鉤子木和山柰四味藥材粗粉，按比例(4∶ 4∶ 2∶ 1)混合制成，1977年作為首批民族用藥載入《中華人民共和國藥典》[1]，具有清瘟解表、使“未成熟熱成熟”之功效，用于瘟病初期，發(fā)熱發(fā)冷，頭痛咳嗽，咽喉腫痛，胸脅作痛等癥[2]，經(jīng)辨證加味可形成60多方，用于不同瘟疫熱癥的治療，在蒙醫(yī)藥中具有重要的地位和作用[3-5]。方中土木香、苦參和懸鉤子木同為“促熱疾成型類”蒙藥，山柰為“祛巴達(dá)干類”蒙藥[6-7]。前期研究表明，該方不同極性提取物，具有一定程度的鎮(zhèn)痛、抗菌、抗炎作用[8-9]，并從懸鉤子木中分離得到抗炎、抗氧化活性物質(zhì)[10-11]。我們以小鼠脾淋巴細(xì)胞生長率、細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-2和干擾素-γ為指標(biāo)，考察該方對(duì)免疫功能的影響，并用拆方、提取不同極性部位以及測(cè)定主要化學(xué)成分等方法，探尋該方中免疫增強(qiáng)活性成分，為揭示該方治療瘟疫熱癥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供新的思路與方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)BALB/c純系小鼠，雌雄兼用，6～8周齡，體重20～22 g，購于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)于室溫25 ℃，SPF級(jí)環(huán)境。

1.1.2 藥物 土木香(20140101)、苦參(20140101)購于濟(jì)南人和中藥飲片有限公司，山柰(1510179)購于河北省福君堂藥業(yè)有限公司。上述藥材經(jīng)檢驗(yàn)，均符合2015年版《中華人民共和國藥典》標(biāo)準(zhǔn)。懸鉤子木藥材2015年10月野生采集自內(nèi)蒙古赤峰市巴林右旗，取其莖枝陰干。原植物經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院包保全教授鑒定，為薔薇科懸鉤子屬植物庫頁懸鉤子RubussachalinensisLeveille.，模式標(biāo)本存放于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院標(biāo)本室。

土木香內(nèi)酯(LPT2014005)、異土木香內(nèi)酯(LPT2014011)、對(duì)甲氧基桂皮酸乙酯(110835-201603)、苦參堿(110805-200508)和氧化苦參堿(110780-200506)對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所)；肉桂酸乙酯(MAYA-CR5019)對(duì)照品(浙江瑪雅試劑有限公司)。

1.1.3 試劑與儀器 刀豆蛋白(ConA)(美國Sigma公司)；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)(美國Gibco公司)；CCK-8試劑盒(日本同仁研究院)；小鼠淋巴細(xì)胞分離液、小鼠白細(xì)胞介素-2(IL-2)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑盒、小鼠干擾素-γ(IFN-γ)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑盒(達(dá)科為生物技術(shù)有限公司)；HF90二氧化碳培養(yǎng)箱(力康生物醫(yī)療科技控股有限公司)；Multiskan GO酶標(biāo)儀、SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)(美國Thermo公司)；DFC450C倒置相差顯微鏡(德國Leica公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 實(shí)驗(yàn)組加入100 μL終濃度為25.0、50.0、100.0、200.0 μg/mL的“查干湯”及其組方藥材水提物；陽性對(duì)照組加入100 μL終濃度為2.5 μg/mL的ConA，陰性對(duì)照組加入100 μL RPMI 1640培養(yǎng)基，置5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)48 h，離心收集上清，-20 ℃保存。

1.2.2 給藥方法 水提物的制備：查干湯及其組方藥材粗粉，分別加10倍量水，回流提取3次，0.5 h/次，合并提取液，濃縮，冷凍干燥，即得。

醇提物的制備：查干湯及其組方藥材粗粉，95%乙醇回流提取1次，再用75%乙醇回流提取2次，每次2 h，合并提取液，濃縮至無醇味，冷凍干燥，即得。

不同極性懸鉤子木提取物的制備：懸鉤子木醇提物，用10倍量水混懸，依次用等體積的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，減壓回收溶劑，即得。

給藥樣品的配制：上述提取物和6個(gè)指標(biāo)性成分稱重后溶解在DMSO中，配制成200.0 mg/mL的母液，用RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋至不同濃度，備用。

小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液的制備：脫頸椎處死小鼠，75%乙醇浸泡消毒，無菌條件下取出脾臟，置4～5 mL Mouse 1×淋巴細(xì)胞分離液中，輕研，200目尼龍網(wǎng)濾過。把懸有脾淋巴細(xì)胞的分離液立即轉(zhuǎn)移至離心管中，覆蓋500～1 000 μL RPMI 1640培養(yǎng)基，800×g離心30 min，吸取淋巴細(xì)胞層，再加入10 mL RPMI 1640培養(yǎng)基，顛倒洗滌，250×g離心10 min，收集細(xì)胞[12]。傾倒上清液，用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，活細(xì)胞數(shù)大于95%，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106/mL，備用。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法 將脾淋巴細(xì)胞懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μL。實(shí)驗(yàn)組分別加入100 μL終濃度為0.7、3.3、16.7、50.0、100.0、200.0 μg/mL的待測(cè)藥物，陽性對(duì)照組加入100 μL終濃度為2.5 μg/mL的ConA，陰性對(duì)照組加入100 μL RPMI 1640培養(yǎng)基，置5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μL CCK-8溶液，置5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃反應(yīng)4 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光度(A)。

淋巴細(xì)胞生長率(%)=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%(As實(shí)驗(yàn)孔；Ac對(duì)照孔；Ab空白孔)。

白細(xì)胞介素-2和干擾素-γ的誘生及測(cè)定：將脾淋巴細(xì)胞懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μL。按照試劑盒說明，用ELISA測(cè)定細(xì)胞上清液中白細(xì)胞介素-2和干擾素-γ的水平[13-19]。

2 結(jié)果

2.1 水提物對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響 在一定濃度范圍內(nèi)，各樣品均能不同程度提高淋巴細(xì)胞生長率。復(fù)方、苦參、懸鉤子木和山柰水提物在0.7～200.0 μg/mL均能促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖，且3個(gè)組方藥材的促增殖作用均呈劑量依賴性；土木香在0.7～50.0 μg/mL能促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖，高濃度100.0、200.0 μg/mL無促增殖作用。見表1。藥物對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖作用強(qiáng)弱順序?yàn)?，山柰水提?懸鉤子木水提物>苦參水提物>復(fù)方水提物>土木香水提物(圖1)。

表1 查干湯及其組方藥材水提物對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞生長率的影響

注：陰性對(duì)照細(xì)胞生長率為100%；與陰性對(duì)照組比較，*P<0.05

圖1 查干湯及其組方藥材水提物對(duì)小鼠 脾淋巴細(xì)胞增殖的影響

注：A查干湯水提物；B土木香水提物；C苦參水提物；D懸鉤子木水提物；E山柰水提物

2.2 醇提物及組方藥材中主要化學(xué)成分對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響 復(fù)方及其各組方藥材醇提物，土木香指標(biāo)性成分土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯，山柰指標(biāo)性成分肉桂酸乙酯和對(duì)甲氧基桂皮酸乙酯，苦參指標(biāo)性成分苦參堿和氧化苦參堿，懸鉤子木石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇層粗提物，在0.7～200.0 μg/mL藥物濃度均無促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖作用，各劑量組與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 水提物對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞誘生白細(xì)胞介素-2和干擾素-γ的影響 復(fù)方及其組方藥材水提物均能促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素-2，復(fù)方、苦參和懸鉤子木水提物在50.0～200.0 μg/mL均能促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素-2；土木香水提物在25.0～100.0 μg/mL能促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素-2；山柰水提物在25.0～200.0 μg/mL均能促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素-2。見表2。藥物對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素-2的影響強(qiáng)弱順序?yàn)?，山柰水提?苦參水提物>復(fù)方水提物>懸鉤子木水提物>土木香水提物。見圖2。

復(fù)方及其組方藥材苦參、懸鉤子木和山柰水提物在25.0～200.0 μg/mL均能促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞分泌干擾素-γ；土木香水提物對(duì)脾淋巴細(xì)胞分泌干擾素-γ水平無明顯影響。見表2。藥物對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌干擾素-γ的影響強(qiáng)弱順序?yàn)?，山柰水提?苦參水提物>復(fù)方水提物>懸鉤子木水提物>土木香水提物。見圖3。

表2 查干湯水提物對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞誘生白細(xì)胞介素-2和干擾素-γ的影響

注：與陰性對(duì)照組比較，*P<0.05

3 討論

該實(shí)驗(yàn)在復(fù)方、組方藥材、提取物和指標(biāo)性成分層面上，研究了查干湯及其組方藥材對(duì)免疫功能的影響。結(jié)果，復(fù)方及其組方藥材的水提物均能促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖，并通過分泌白細(xì)胞介素-2和干擾素-γ發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，但其醇提物、指標(biāo)性成分以及懸鉤子木不同極性部位均無作用。結(jié)果表明，該方發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)為其中水溶性成分，應(yīng)進(jìn)一步對(duì)該方的水提物進(jìn)行系統(tǒng)的化學(xué)成分和作用機(jī)制研究。同時(shí)，本研究為該方的傳統(tǒng)劑型“水煎劑”提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為現(xiàn)代劑型開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

圖2 查干湯及其組方藥材水提物對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞誘生白細(xì)胞介素-2的影響

注：A查干湯水提物；B土木香水提物；C苦參水提物；D懸鉤子木水提物；E山柰水提物

圖3 查干湯及其組方藥材水提物對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞誘生干擾素-γ的影響

注：A查干湯水提物；B土木香水提物；C苦參水提物；D懸鉤子木水提物；E山柰水提物

查干湯為瘟疫熱癥基礎(chǔ)方，方中土木香、苦參和懸鉤子木為“促熱疾成型類”蒙藥，山柰為“祛巴達(dá)干類”蒙藥。實(shí)驗(yàn)表明，兩類蒙藥及其復(fù)方均能促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖，具有一定的免疫增強(qiáng)作用，在一定程度上闡釋了治療瘟疫熱癥用蒙藥的功效主治與藥效學(xué)之間的聯(lián)系，為該類蒙藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供新的思路與方法。