曾還雄 方霞 劉凌燕 金小寶

（廣東藥科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院 廣東省生物活性藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510006）

美洲大蠊是中國傳統(tǒng)中藥材蜚蠊的代表性蟲種，是一種世界性衛(wèi)生害蟲，可長期自由生活在污水管道和化糞池等充滿大量病原微生物的環(huán)境中，具有超強(qiáng)的繁殖力和抗病能力，這可能與其腸道內(nèi)存在大量正常菌群有很大關(guān)系［1-2］。湯歷等［3］從德國小蠊腸道分離得到具有抗真菌活性的內(nèi)生細(xì)菌，美洲大蠊和德國小蠊生活環(huán)境和生活習(xí)性相近似，提示美洲大蠊腸道也可能存在具有抗真菌活性的內(nèi)生菌群。本課題組前期從蜚蠊（美洲大蠊）腸道分離得到159 株放線菌［4］，本文擬以白色念珠菌（Candida albicansATCC10231）、紅色毛癬菌（Trichophyton rubrumATCC60836）、黑曲霉（Aspergillus nigerATCC16404）和煙曲霉（Aspergillus fumigatusATCC96918）4 種人體常見致病真菌為研究對象，采用牛津杯法和菌株對峙共培養(yǎng)法對這159 株腸道內(nèi)生放線菌進(jìn)行體外抗真菌活性篩選，并采用分子生物學(xué)方法對目標(biāo)菌株進(jìn)行分類鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 放線菌來源和供試病原真菌 159株受試放線菌均為課題組前期從蜚蠊腸道分離得到［4］，-80℃甘油保存。供試病原真菌：白色念珠菌（Candida albicansATCC10231）、紅色毛癬菌（Trichophyton rubrumATCC60836）、黑曲霉（Aspergillus nigerATCC-16404）和煙曲霉（Aspergillus fumigatusATCC96918）等人體常見致病真菌均購自廣東省微生物研究所。

1.1.2 主要試劑與儀器 Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽取試劑盒和PCR相關(guān)試劑為上海生物工程股份有限公司產(chǎn)品，各種培養(yǎng)基成分和其他試劑均為國產(chǎn)分析純。臺式高速冷凍離心機(jī)為德國Eppendorf 公司產(chǎn)品，PCR儀、電泳儀、電泳槽和GelDoc 凝膠成像系統(tǒng)均為美國Bio-Rad 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 蜚蠊腸道159 株內(nèi)生放線菌的抗真菌活性篩選 分別挑取各放線菌單菌落接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，220 r/min、28℃條件下培養(yǎng)5-7 d，收集發(fā)酵液4 000 r/min 離心 30 min，取上清液備用［5］。采用牛津杯法［6］檢測各菌株發(fā)酵液抗白色念球菌活性：將高壓滅菌的PDA培養(yǎng)基自然冷卻到45℃左右，加入適量新鮮制備的白色念珠菌混懸液，混勻后，采用雙層倒板法均勻倒入平板上使白色念珠菌菌懸液終濃度為3-5×106CFU/mL。待培養(yǎng)基冷卻后，將牛津杯均勻放在平板上，分別加入200 μL不同菌株的發(fā)酵液上清，等量液體空白培養(yǎng)基作為空白對照。28℃培養(yǎng)3-5 d后，觀察抑菌作用情況。采用菌株對峙共培養(yǎng)法［7］檢測各菌株發(fā)酵液抗紅色毛癬菌、黑曲霉、煙曲霉等真菌活性：分別將受試放線菌接種到經(jīng)高壓滅菌的PDA固體培養(yǎng)基的邊緣，28℃條件下培養(yǎng)，待其在PDA固體培養(yǎng)基上產(chǎn)生足夠量的孢子后，分別將受試真菌點(diǎn)接到培養(yǎng)基中央作為實(shí)驗(yàn)組，空白對照組不接種受試放線菌，28℃培養(yǎng)4-6 d后，觀察抗真菌情況。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 采用16S rDNA PCR對具有抗真菌活性菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定 制備具有抗真菌活性的蜚蠊腸道內(nèi)生放線菌基因組DNA，具體方法參照上海生物工程股份有限公司Ezup 柱式細(xì)菌基因組DNA抽取試劑盒說明書進(jìn)行。PCR擴(kuò)增各菌株16S rDNA基因采用通用引物［8］，正向引物 27 f為AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG，反向引物1492 r為TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T。25 μL PCR 反 應(yīng) 體系 ：Master mix 12.5 μL，正向、反向引物各1.0 μL，模板1.0 μL，ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)條件 ：95℃ 5 min ；94℃30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，共 30個循環(huán) ；72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析檢測后，委托上海生物工程有限公司進(jìn)行基因測序。

1.2.3 具有抗真菌活性菌株16S rDNA同源性比對和系統(tǒng)發(fā)育樹分析 具有抗真菌活性菌株16S rDNA PCR產(chǎn)物經(jīng)測序后，將各菌株的16S rDNA基因序列結(jié)果提交至NCBI在線數(shù)據(jù)庫，應(yīng)用Blast程序和DNAMAN 6.0軟件進(jìn)行同源性比對分析。并運(yùn)用MEGA 5.2軟件采用Neighbor Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，根據(jù)菌株間的親緣關(guān)系確定各菌株種屬分類情況［9］。

2 結(jié)果

2.1 抗真菌活性內(nèi)生放線菌的篩選結(jié)果

159 株內(nèi)生放線菌中有45 株內(nèi)生放線菌對4 種真菌表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，其中，對黑曲霉有抑制作用的內(nèi)生放線菌有41 株，其次抗煙曲霉的為35 株，31 株對紅色毛癬菌有抑制作用，對白色念珠菌有抑制作用的內(nèi)生放線菌最少，為23 株。具抗真菌活性的45 株內(nèi)生放線菌中，10 株內(nèi)生放線菌對4 種真菌均有拮抗作用，分別是WA-1-19、WA-2-4、WA-2-5、WA2-7、WA-4-31、WA-8-44、WA11-1-1、WA11-1-3、WA12-1-13 和 WA23-4-4。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1、表1和表2。

表1 具有抗真菌活性的45株蜚蠊腸道內(nèi)生放線菌的抗真菌情況

圖1 部分蜚蠊腸道內(nèi)生放線菌體外抗真菌活性篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 抗真菌活性菌株分子生物學(xué)鑒定、同源性比對和系統(tǒng)發(fā)育樹

將各菌株16S rDNA基因序列利用NCBI在線數(shù)據(jù)庫，經(jīng)Blast程序、DNAMAN 6.0軟件和MEGA 5.2軟件進(jìn)行同源性比對以及系統(tǒng)發(fā)育樹分析。結(jié)果（表2，圖2）發(fā)現(xiàn)，共有45 株放線菌具有不同程度的抗真菌活性，分屬于8 個種屬。其中，鏈霉菌屬為優(yōu)勢菌屬有32 株，占71.11 %；其次，戈登氏菌屬有6 株，微桿菌屬有2 株，分枝桿菌屬、無色桿菌屬、小單孢菌屬、纖維微菌屬和壤霉菌屬各有1 株。

表2 具有抗真菌活性的45株蜚蠊腸道放線菌的分布情況

圖2 10株對4種真菌均具有抑制活性放線菌的16S rDNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

近年來，真菌感染日趨嚴(yán)重，特別是深部真菌感染明顯上升，已成為癌癥、艾滋病等患者主要死亡原因之一，真菌藥物研發(fā)是全球新藥研發(fā)的熱點(diǎn)之一［10］。昆蟲腸道放線菌是一類特境微生物，在長期共生和協(xié)同進(jìn)化過程中，可產(chǎn)生生物活性物質(zhì)保護(hù)宿主防御外來病原菌感染［11］。美洲大蠊生命力非常頑強(qiáng)，存在地球已達(dá)3.5億年之久［12］。美洲大蠊特殊的生活環(huán)境可能會使得其腸道內(nèi)生放線菌在種類和功能上具有豐富的多樣性，也許是良好的藥用微生物資源。

放線菌，尤其是其中的鏈霉菌屬，是臨床抗菌藥物的主要來源［13］。本研究發(fā)現(xiàn)159 株蜚蠊腸道內(nèi)生放線菌中有45 株對白色念珠菌、紅色毛癬菌、黑曲霉、煙曲霉等人體常見致病真菌具有拮抗作用，這些菌株隸屬于鏈霉菌屬、戈登氏菌屬、微桿菌屬、分枝桿菌屬、無色桿菌屬、小單胞菌屬、纖維微菌屬、壤霉菌屬等8個種屬。其中鏈霉菌屬32株，占比達(dá)71.11 %，為優(yōu)勢菌屬；鏈霉菌屬是至今放線菌中種類最多、數(shù)量最大的一個屬，是一類具有重要藥用價值的微生物，早期發(fā)現(xiàn)的抗生素絕大多數(shù)是由該屬的菌種產(chǎn)生，如抗細(xì)菌抗生素鏈霉素、紅霉素、氯霉素、四環(huán)素等，抗真菌抗生素灰黃霉素、抗霉素等［14-15］。而且這些內(nèi)生放線菌的抗真菌譜非常廣，其中，對黑曲霉具有抑制作用的內(nèi)生放線菌有41 株，對煙曲霉、紅色毛癬菌和白色念球菌具有抑制作用的菌株分別為35、31和23株。更有意義的是，菌 株 WA-1-19、WA-2-4、WA-2-5、WA2-7、WA-4-31、WA-8-44、WA11-1-1、WA11-1-3、WA12-1-13 和WA23-4-4等10株內(nèi)生放線菌同時對白色念珠菌、紅色毛癬菌、黑曲霉、煙曲霉等4種致病真菌均有較強(qiáng)的拮抗作用。推測這些放線菌，特別是其中的鏈霉菌屬可產(chǎn)生具有抗真菌活性的天然物質(zhì)，從而有助于美洲大蠊抵御外來病原真菌的侵入和定植。下一步，我們擬采用生物活性追蹤和化學(xué)分離相結(jié)合等技術(shù)方法分離抗真菌化合物，研究這些放線菌株抗真菌活性物質(zhì)基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)159 株蜚蠊腸道內(nèi)生放線菌中有45株具有抗真菌活性，諸多菌株抗真菌譜較廣，有10株內(nèi)生放線菌對4 種受試真菌均有拮抗作用。45 株具有抗真菌活性的菌株分屬于8 個種屬，提示蜚蠊腸道含有豐富的抗真菌活性放線菌資源。