翟曉鑫 高花 姜平 許崇波 張宗輝 李文哲 高鳳山

（1. 大連大學生命科學與技術學院，大連 116622；2. 大連醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，大連 116044；3. 韶關學院 英東生命科學學院 粵北生豬生產(chǎn)及疫病防控協(xié)同創(chuàng)新發(fā)展中心，韶關 512005）

主要組織相容性復合體（Major histocompatibility complex，MHC）是一類編碼與免疫應答直接相關的基因群，在絕大部分脊椎動物中都有表達［1-2］，MHC表達產(chǎn)物在抗原遞呈和T細胞激活中起到關鍵作用［3］。不同動物MHC有不同的命名，豬的MHC也叫做豬白細胞抗原（Swin eleukuocyte antigen，SLA）［4］。SLA分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三個基因類型，其中SLA Ⅰ類分子表達于所有有核細胞表面，屬于高度多態(tài)的糖蛋白，該類分子能夠在細胞中特異性識別經(jīng)蛋白酶體處理后的內源性抗原并可將其遞呈到細胞膜表面，進而和CD8+T淋巴細胞表面的TCR受體特異性結合，激活CD8+T淋巴細胞并啟動細胞免疫［5］。SLA Ⅰ類分子由重鏈和輕鏈組成，SLA Ⅰ重鏈基因包含3類基因即Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc，共13個基因座。其中只有Ia包含3個功能基因，分別是SLA-1、SLA-2、SLA-3。SLA-2在信號肽起始端較SLA-1、SLA-3多3個氨基酸殘基［4］。

近年來，針對多個品系豬的SLA-2基因進行了原核表達質粒的構建及體外表達，以及多肽結合等功能研究［6-12］。然而，原核表達的SLA-2多為包涵體形式，需要經(jīng)過變性和復性等繁瑣的過程才能使SLA-2形成正確的折疊［13］。由于原核細胞不具有高爾基體，所以不能進行糖基化等功能修飾。因此，相對于真核表達系統(tǒng)，經(jīng)原核細胞表達的SLA-2其空間折疊及功能必然不如真核表達系統(tǒng)的效果。目前基于真核表達水平上對人HLA-A2基因，以及小鼠H-2基因的相關研究已經(jīng)趨于成熟［14-16］，但是針對豬SLA-2基因真核表達的研究鮮有報導。

PK15細胞（Porcine kidney epithelial cells）來源于豬腎，中文名為豬腎上皮細胞，屬于真核表達系統(tǒng)常用的宿主細胞。該細胞也廣泛應用于豬瘟病毒、豬偽狂犬病病毒和豬細小病毒等的分離、體外培養(yǎng)以及相關疫苗的生產(chǎn)［17］。將不同SLA-2基因構建真核表達質粒并轉染至PK15細胞中，能夠保證SLA-2分子形成正確的折疊，從而行使正確的功能。因此可以在PK15細胞系上研究任何SLA-2基因的表達、抗原遞呈以及能夠更高效地進行抗原表位的篩選等。

實驗室前期已經(jīng)成功克隆了荷包豬SLA-2-HB01全基因［18］，本實驗在此基礎上擬將荷包豬SLA-2-HB01編碼區(qū)基因構建到真核表達載體pEGFP N3上，并轉染至PK15細胞，驗證SLA-2分子在該細胞中的表達，為后期篩選豬烈性傳染病病毒相應的抗原表位肽奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞和菌株 豬腎細胞（PK15）購自中國獸醫(yī)監(jiān)測所微生物菌種保藏管理中心（CVCC）。

荷包豬SLA-2-pMD 18-T全基因（GenBank編號：AB602431.1）質粒由大連大學生命科學與技術學院基因和蛋白質工程實驗室保存。pMD 19-T Simple Vector，Escherichia coli.Top10、Escherichia coli.DH5α菌種購自大連寶生物有限公司。pMD 19-T Simple Vector用于SLA-2-HB01基因的高效克隆。Escherichia coli.Top10感受態(tài)細胞用于擴增含有目的基因的重組質粒，以便進一步進行目的基因的克隆改造。pEGFP N3菌種購自于中國上海思享生物有限責任公司。

1.1.2 試劑 胰蛋白胨（Tryptone）、酵母提取物（Yeast extract）、 氯 化 鈉（NaCl）、Tris、 瓊 脂 糖、牛血清白蛋白Ⅴ（Albu min Bovine Ⅴ）、麗春紅、SanPrep柱式吸附柱小量質粒提取試劑盒、SanPrep柱式吸附柱DNA膠回收試劑盒、小鼠抗eGFP單克隆抗體（貨號：D199989-0100）、小鼠抗GAPDH單克隆抗體（貨號：D190636-0100）、HRP標記的山羊抗小鼠IgG（貨號：D110087-0100）以及離心管、槍頭等實驗耗材均購自上海生工生物工程有限公司；寡核苷酸的合成和DNA測序由上海生工生物有限公司完成。Phanta?Super-Fidelity DNA Polymerase、1 kb DNA Ladder、核酸染料Ultra Gelred Nucleic Acid Stain（10000×）、Lipoectine2000脂質體轉染試劑購自諾唯贊有限公司。T4 DNA Ligase、DL 2000 DNA Marker、EcoR I限制性快速內切酶、KpnI限制性快速內切酶、10×上樣緩沖液（loading buffer）均購自寶生物工程（大連）有限公司。胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基和0.25%胰蛋白酶消化液購自Gibco公司；25 cm2細胞培養(yǎng)瓶購自Corning公司，6孔、24孔、96孔培養(yǎng)板購自NEST公司。其他常見的分子生物學試劑以及化學試劑都來自天津化學試劑有限公司和北京化學試劑有限公司。超敏ECL化學發(fā)光試劑盒購自新賽美生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設計與合成 根據(jù)引物設計原則，參考GenBank（AB602431.1）上豬SLA-2-HB01全基因序列，采用Vector NTI 11.2和Primer6.0軟件相結合設計引物，根據(jù)載體pEGFP N3的結構特點，選擇的限制性內切酶為：EcoR I和KpnI。上游引物F：5′-GAATTCATGCGGGTCAGGGGCCCTCAAGCCA -3′（下劃線為EcoR I酶切位點）；下游引物R：5′-GGT ACCCACTCTAGGATCCTTGGTAAGG-3′（ 下 劃 線 為KpnI酶切位點）。由上海生工生物工程有限公司定制合成。

1.2.2 荷包豬SLA-2-HB01/ pMD 19-T Simple克隆以SLA-2-HB01/pMD 18-T質粒為模板，用Phanta?Super-Fidelity DNA Polymerase高保真酶系統(tǒng)進行PCR擴 增，PCR體 系 為 ：5×SF buffer（with 10 mmol/L MgSO4），10 μL ；dNTP Mix（10 mmol/L each），1 μL ；DMSO，1.5 μL ；SLA-2-HB01-F（10 μmol/L），2 μL ；SLA-2-HB01-R（10 μmol/L），2 μL ；SLA-2-HB01 全基因質粒，2 μL ；Phanta?Super-Fidelity DNA Polymerase（1 U/μL），1 μL ；H2O，32.5 μL。

PCR條件為：92℃，預變性2 min；92℃，10 s；58℃，30 s；72℃，30 s，30個循環(huán)；最后72℃總延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠檢測，凝膠成像儀成像。目的條帶用DNA凝膠回收試劑盒進行回收。

將膠回收的目的條帶與pMD 19 -T simple載體連接，轉化Escherichia coli. Top10，篩選陽性克隆菌并送至生物公司測序，通過雙向DNA測序確認插入完整性后，將測序正確的陽性克隆菌株命名為SLA-2-HB01/pMD 19-T Simple。

1.2.3 荷包豬SLA-2-HB01真核表達載體的構建 分別對SLA-2-HB01/pMD19-T Simple以及真核表達載體pEGFP N3質粒進行EcoR I和KpnI雙酶切，然后經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并經(jīng)DNA回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物。將兩者回收產(chǎn)物進行連接、轉化至Escherichia coli.DH5α感受態(tài)細胞中，在含有Kan+的LB平板中，37℃培養(yǎng)過夜。然后挑取單菌落至Kan+LB液體培養(yǎng)基中，37℃，12 h振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)的菌液利用限制性雙酶切分析鑒定真核重組DNA載體中是否攜帶插入片段。最后，通過對DNA測序結果進行序列分析驗證核苷酸序列的正確性。陽性重組質粒命名為 SLA-2-HB01/pEGFP N3，重組質粒SLA-2-HB01/pEGFP N3圖譜，見圖1。

圖1 SLA-2-HB01/pEGFP N3重組表達質粒示意圖

1.2.4 PK15細胞轉染 在25 cm2的細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)PK15細胞，并將PK15細胞傳代兩次以上，加入1.5 mL 0.25%的胰蛋白酶消化液消化細胞并計數(shù)，在6孔板中每孔接種3×105個細胞，24 h之后細胞密度達到80%左右，用Lipoectine2000脂質體轉染試劑轉染SLA-2-HB01/pEGFP-N3真核重組質粒。轉染30 min前，將細胞培養(yǎng)基換成1.5 mL Opti-MEM I培養(yǎng)基，分別用250 μL Opti-MEM I培養(yǎng)基稀釋2 μg重組真核表達質粒和2 μL Lipoectine2000脂質體轉染試劑，室溫靜置5 min?；旌螸ipoectine2000和質粒的稀釋液共500 μL，輕輕混勻，室溫靜置20 min。向6孔細胞培養(yǎng)板中的每個孔中加入預混液500 μL，并前后輕輕搖動6孔細胞培養(yǎng)板使預混液與孔中的培養(yǎng)基混勻。細胞在CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)6 h后，將含有轉染試劑的培養(yǎng)基去除，加入1.5 mL新鮮的DMEM培養(yǎng)基。轉染24 h后，用500 μg/mL G418抗性篩選。

1.2.5 單克隆轉染細胞系培養(yǎng) 用含500 μg/ mL G418抗性培養(yǎng)基持續(xù)篩選已轉染的細胞系15 d后，加入2 mL 1×PBS清洗細胞，重復一次，加入1.5 mL 0.25%胰蛋白酶消化液消化15 min，收集細胞，將細胞濃度稀釋至7-8 cells/mL，共10 mL，接種至96孔板，每孔加入100 μL培養(yǎng)基。細胞在96孔板中培養(yǎng)3 d后，標記出96孔板中生長的單細胞，細胞在96孔板中培養(yǎng)8 d后，標記的單克隆細胞形成細胞團，100 μL 1×PBS清洗單克隆細胞，加入30 μL 0.25%胰蛋白酶消化液原孔消化10 min，并加入70 μL含10%血清DMEM培養(yǎng)基重懸細胞并轉移至24孔板中培養(yǎng)。培養(yǎng)8 d左右，待細胞基本鋪滿孔板時用200 μL 0.25%胰蛋白酶消化液消化細胞15 min，重懸細胞，轉入6孔板中繼續(xù)擴大培養(yǎng)。3-4 d的細胞將鋪滿整個6孔板，轉入100 mm細胞培養(yǎng)皿中繼續(xù)擴大培養(yǎng)，隨后一半細胞用于凍存，一半細胞繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.6 單克隆轉染細胞系鑒定 待細胞生長狀態(tài)穩(wěn)定后，分別取正常PK15細胞、轉染pEGFP N3空載質粒的PK15細胞以及轉染SLA-2-HB01/pEGFP N3質粒PK15細胞，分別提取細胞全蛋白進行鑒定，具體操作如下：收集各種細胞于滅菌EP管中，利用1×PBS洗兩遍后，根據(jù)細胞量加入100-500 μL裂解液，用槍吹打5-8次后，放在冰上并用搖床搖晃15 min，中間彈動2次，使細胞充分裂解。裂解完畢后，利用4℃離心機，12 000 r/min，離心10 min，使細胞碎片全部沉到離心管底部。將上清吸入到新的離心管中，利用BCA法［19］檢測蛋白濃度后，將蛋白制成終濃度為10 μg/μL的溶液，取10 μL樣品進行SDS-PAGE檢測。

蛋白樣品進一步轉印到PVDF膜后，經(jīng)1×麗春紅染色后參考marker切割目的條帶和內參GAPDH，5% BSA室溫封閉1 h，含目的條帶的膜加入1∶5 000稀釋的小鼠抗eGFP單克隆抗體，含GAPDH條帶的膜加入1∶8 000稀釋的小鼠抗GAPDH單克隆抗體，4℃孵育過夜，去除一抗，經(jīng)1×TBST洗滌4次后加入1∶8 000稀釋的HRP標記的山羊抗小鼠IgG，室溫搖床上孵育1 h，1×TBST洗滌4次，采用ECL顯色試劑盒進行顯色，以檢測EGFP及EGFP融合基因的表達。

1.2.7 統(tǒng)計學處理 采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析Western雜交條帶累積光密度值（IOD），并計算出目的蛋白相對光密度值（SLA-2-HB01-EGFP的IOD值與GAPDH的IOD值之比）然后采用GraphPad Prism 5分析軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。

2 結果

2.1 荷包豬SLA-2-HB01/pMD 19-T Simple克隆

PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳后經(jīng)凝膠成像儀成像，結果（圖2-A）顯示目的條帶大小約為1 100 bp，與理論值1 104 bp相符。經(jīng)單菌落PCR后，瓊脂糖電泳檢測到擴增條帶大小約1 100 bp（圖2-B），與理論設計值1 104 bp相符。

圖2 荷包豬SLA-2-HB01/pMD 19-T Simple克隆

2.2 荷包豬SLA-2-HB01真核表達載體鑒定

2.2.1 限制性雙酶切鑒定重組表達質粒SLA-2-HB-01/pEGFP N3 利用EcoR I和KpnI對重組表達質粒SLA-2-HB01/pEGFP N3進行雙酶切鑒定，0.8%瓊脂糖電泳檢測，顯示插入片段大約1 000 bp，與理論設計值1 092 bp相符（去掉部分酶切位點），見圖3。

圖3 限制性雙酶切鑒定SLA-2-HB01/pEGFP N3重組真核表達質粒

2.2.2 序列分析 SLA-2-HB01/pEGFP N3 經(jīng)核酸序列測定后，通過NCBI網(wǎng)站進行了Blast，結果（圖4）顯示，SLA-2-HB01/pEGFP N3重組真核表達質粒中SLA-2-HB01基因序列與原序列100%同源。

2.3 熒光倒置顯微鏡檢測轉染SLA-2-HB01/pEGFP N3質粒的PK15細胞

SLA-2-HB01/pEGFP N3質粒轉染PK15細胞48 h后，通過熒光倒置顯微鏡觀察細胞內綠色熒光蛋白的表達情況，結果經(jīng)Image-Pro Plus軟件分析顯示（圖5），大約40%的PK15細胞出現(xiàn)了綠色熒光，主要分布在細胞漿區(qū)域。

2.4 熒光鑒定單克隆細胞系

經(jīng)G418篩選出的陽性單細胞擴大培養(yǎng)接種于6孔板中，熒光顯微鏡觀察接種后第1、2、4天PK-15細胞熒光，結果（圖6）顯示陽性單克隆細胞經(jīng)擴大培養(yǎng)后表達有EGFP的PK-15細胞占到99%以上。

2.5 Western Blotting檢測轉染SLA-2-HB01/pEGFP N3質粒的PK15細胞中SLA-2-HB01-EGFP融合蛋白的表達情況

分別提取正常PK15細胞、轉染pEGFP N3空載質粒的PK15細胞以及轉染SLA-2-HB01/pEGFP N3質粒PK15細胞總蛋白，以正常PK15細胞總蛋白作為空白對照，以轉染pEGFP N3空載質粒的PK15細胞總蛋白作為陰性對照，通過Western blotting檢測融合蛋白的表達，結果（圖7）顯示轉染SLA-2-HB01/pEGFP N3質粒PK15細胞中融合蛋白得到了高表達，分子量大小為70 kD。

3 討論

近年來，豬源烈性傳染病廣泛存在，而且很難對其進行防治，原因是烈性傳染病一般禁止用免疫效果較好但存在二次感染危險的活毒疫苗，而允許使用的滅活疫苗雖然能起到一定的免疫保護作用，但不能徹底消滅病毒感染［20］。以CTL多肽表位為基礎的表位疫苗有助于對豬烈性傳染病的預防及控制，目前大量實驗室也開展了相關研［21-22］。在眾多CTL多肽表位中，相較于MHC分子體外結合篩選以及MHC四聚體篩選的多肽而言，細胞自然遞呈的多肽無疑是最理想的。

本實驗將編碼荷包豬MHCⅠ類分子重鏈的基因SLA-2-HB01編碼區(qū)構建到了真核表達載體pEGFP N3上，并借助脂質體轉染試劑成功地轉染到PK15細胞中，使荷包豬的MHCⅠ類分子能夠在PK15細胞中過表達，目的是建立外源SLA-2-HB01在PK15細胞上的抗原遞呈研究體系，并為后續(xù)的抗原遞呈及多肽表位篩選提供研究平臺。

本次實驗選擇荷包豬SLA-2-HB01基因為研究對象，基于荷包豬品種特殊，具有耐粗飼、抗病能力強、肉質鮮美等特點，并且具有很好的科學研究價值［23］。前期研究發(fā)現(xiàn)荷包豬的SLAⅠ類基因進化較為原始，SLA-2-HB01重鏈基因編碼區(qū)共1 095個堿基，編碼364個氨基酸，相較于SLA-1-HB01以及SLA-3-HB01，SLA-2-HB01重鏈基因信號肽起始位置多3個氨基酸，鑒于基因的特殊性，課題組首先選取了SLA-2-HB01進行研究。

本次實驗的一個關鍵之處在于能否成功構建SLA-2-HB01/pEGFP N3質粒，在構建的重組SLA-2-HB01/pEGFP N3質粒中，SLA-2-HB01與EGFP基因共用一個CMV啟動子，最終表達為融合蛋白（EGFP在SLA-2-HB01分子重鏈的羧基端）。因此，在進行引物設計時需要將SLA-2-HB01中的終止密碼子“UGA”去除以保證翻譯到該位點時不發(fā)生終止，繼續(xù)向下游的EGFP進行翻譯。在測序結果中我們能夠看到位于SLA-2-HB01編碼區(qū)3′末端的“TGA”已經(jīng)成功去除（圖4），同時也沒有發(fā)生移碼突變，保證了SLA-2-HB01-EGFP融合蛋白能夠正確翻譯。EGFP是能夠增強熒光特性的綠色熒光蛋白，其空間結構較為緊密，呈桶狀［24］。該結構特征一方面有助于保護EGFP的整體構象，使其熒光特性不受連接的其他大分子的影響，另一方面EGFP如此緊密的空間結構也保證了不影響與其連接的大分子（本實驗中的SLA-2-HB01分子）的正確折疊以及在PK15細胞中的正常轉運等［25］。

圖4 Blast分析SLA-2-HB01/pEGFP N3序列

圖5 熒光倒置顯微鏡檢測轉染SLA-2-HB01/pEGFP N3質粒的PK15細胞（×200）

圖6 熒光鑒定陽性單克隆細胞系

圖7 Western Blotting檢測SLA-2-HB01-EGFP融合蛋白在PK15細胞中的表達情況

本次實驗的另一個關鍵之處是能否檢測到PK15細胞中外源的SLA-2-HB01分子重鏈的表達情況，實驗選用的真核表達載體pEGFP N3自帶編碼綠色熒光蛋白的基因，通過熒光倒置顯微鏡可以初步觀察到PK15細胞中表達了綠色熒光蛋白（圖5），跟蹤檢測陽性單克隆細胞在擴大培養(yǎng)過程中綠色熒光蛋白的表達情況，發(fā)現(xiàn)綠色熒光較篩選前覆蓋率得到提升，達到99%（圖6-F），并且主要分布在細胞漿中（圖6-G），這與經(jīng)典的MHC相關理論是相符的。我們進一步通過Western Blotting檢測了PK15細胞中SLA-2-HB01-EGFP融合蛋白的表達情況，陰性對照組中EGFP蛋白條帶位于30 kD附近（EGFP分子量為30 kD），而轉染組中EGFP條帶位于70 kD附近，又因為SLA-2-HB01分子量為40 kD，因此能夠判斷在轉染組中EGFP融合著SLA-2-HB01分子表達。另外相較于空白組，轉染組中目的基因有很強的陽性表達（P＜0.01），進一步驗證了SLA-2-HB01基因在PK15細胞中得到表達。

4 結論

本實驗成功構建了SLA-2-HB01/pEGFP N3重組質粒，并在PK15細胞中表達，為研究外源性SLA-2-HB01在PK15細胞中的抗原遞呈規(guī)律及表位篩選奠定基礎。