趙婷婷 王俊剛 楊本鵬 沈林波 馮小艷 王文治 馮翠蓮 熊國如 張樹珍

（中國熱帶農業(yè)科學院熱帶生物技術研究所 中國熱帶農業(yè)科學院甘蔗研究中心 農業(yè)部熱帶作物生物學與遺傳資源利用重點實驗室，?？?71101）

植物中蔗糖轉運蛋白（Sucrose transporter，SUT）是一種蔗糖/H＋共轉運體，具備典型的12跨膜結構域，屬于易化擴散超家族（Major facilitator superfamily，MFS），利用H＋-ATP泵在細胞內外建立質子濃度梯度，進行蔗糖跨膜轉運［1］。植物中蔗糖轉運蛋白基因首先從菠菜中分離得到［2］，隨后在多種植物中分離出蔗糖轉運蛋白家族基因［3］，并進一步通過爪蟾卵母細胞電生理或酵母功能缺失突變體驗證SUTs蔗糖轉運活性［4-6］。SUT基因家族可聚類為3個亞族：SUT1、SUT2和SUT4，并在植物體內碳同化物運輸和積累中發(fā)揮重要作用［7-8］。

SUT1亞族分布于成熟葉的各級葉脈、莖及多種“庫”器官，在韌皮部蔗糖的裝載、卸載、運輸途徑中蔗糖分子的重吸收及維持濃度梯度等方面都可能發(fā)揮重要作用［9-11］。SUT2亞族受蔗糖誘導表達，結合SUT2低水平的密碼子偏好性和獨特的胞質結構等推測，其可能是質膜蔗糖信號感應元件，影響蔗糖積累［12］；SUT4亞族是定位在液泡膜上的一種H+/蔗糖同向轉運蛋白，主要進行液泡內的蔗糖輸出，維持庫端滲透壓，有利于蔗糖的進一步積累［13-17］。不同類型蔗糖轉運蛋白在植物生長發(fā)育和蔗糖積累的不同階段所起作用不同，與植物的生物量形成和蔗糖含量的關系密切［6，18］。

植物通過葉片光合作用生產的糖類分子是其自身代謝的物質基礎。這些糖類分子部分用于植物生長發(fā)育，部分在不同器官間進行分配和儲存。蔗糖是甘蔗葉光合作用的主要產物，也是碳水化合物運輸?shù)闹饕问?，同時也是甘蔗莖稈中糖分利用和積累的主要形式。由于蔗糖在長距離運輸過程中涉及多次跨膜運輸，因此，蔗糖轉運蛋白在甘蔗蔗糖轉運和積累中起重要作用。

甘蔗是多年生宿根無性繁殖作物，經多年連續(xù)宿根和無性留種生產后，多種病原物反復侵染并在甘蔗體內積累，抑制甘蔗正常生長，導致優(yōu)良品種種性退化，造成甘蔗減產達10%，有的甚至高達50%［19-20］。目前脫毒健康種苗生產技術是恢復甘蔗優(yōu)良種性最有效的技術措施，種植甘蔗脫毒健康種苗可以增產20%-40%［21-23］。從甘蔗農藝性狀上對其增產增糖機理已開展較詳細的研究［22，24］，但更進一步從蔗糖轉運方面對其增產增糖的機理研究還未見報道。本研究利用已報道的3個甘蔗蔗糖轉運蛋白基因SUT1、SUT4和SUT6為研究對象，分別從甘蔗整個生長期（苗期、分蘗期、拔節(jié)期和成熟期）對它們的表達量進行比較分析，探討經過脫毒處理后蔗糖轉運蛋白基因的表達量與增產增糖之間的相關性，從分子水平上揭示甘蔗脫毒健康種苗的增產增糖機理。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為甘蔗新臺糖22號品種腋芽脫毒種苗二代種莖苗和普通新臺糖22號種莖（對照），來源于中國熱帶農業(yè)科學院熱帶生物技術研究所甘蔗試驗地。RNA提取試劑盒購自Aidlab（艾德萊）公司；反轉錄試劑盒購自TaKaRa公司；測序載體、T4連接酶購自生工生物工程（上海）股份有限公司；SYBR?Premix ExTaqTM試劑盒購自TaKaRa公司；凝膠回收試劑盒購自購自康寧生命科學（吳江）有限公司；DNA Marker和核酸染料購于上海賽百盛基因技術有限公司；感受態(tài)細胞購自TaKaRa公司；其他生化試劑均為國產分析純或進口分裝。

1.2 方法

1.2.1 田間試驗設計和管理 田間試驗地點在海南省臨高縣皇桐鎮(zhèn)甘蔗試驗基地進行。土壤為紅壤、肥力中等。采用隨機區(qū)組排列，設2個處理，分別種植脫毒種苗和普通種苗，每個處理設3次重復。株距為0.5 m，行距1.2 m，5行區(qū)，每行長10.0 m，小區(qū)試驗面積60 m2，每行下種20段雙芽苗，3面設保護行。田間管理參照文獻［22］的方法進行。

1.2.2 樣品采集 分別選取10個生長一致的試驗植株，在苗期、分蘗期、拔節(jié)期和成熟期進行取樣，每個樣品取3個重復，甘蔗未成熟葉片為0葉，成熟葉片為+3葉，莖稈節(jié)段的計算是生長點向下計算甘蔗莖節(jié)數(shù)，拔節(jié)期分別取（1-3、4-5和7-8、10-11、13-14、16-17、19-20和 22-23莖節(jié)），成熟期分別取幼莖（1-3、4-5和7-8、10-11、13-14、16-17、19-20、22-23、29-30 和 36-37 莖節(jié)）。

1.2.3 總RNA提取、檢測與反轉錄 參照王俊剛等［25］方法進行甘蔗總RNA提取和檢測。cDNA合成按照反轉錄試劑盒說明書進行，各材料起始總RNA模板用量一致。

1.2.4 引物設計 根據(jù)NCBI公布的甘蔗轉運蛋白基因SUT1（GenBank登錄號AY780256.1）和SUT4（GenBank登錄號GQ485583.1）序列利用Primer5設計 引 物（SUT1-F ：5′-GTTCCTGCTACCCAAGAT-3′，SUT1-R ：5′-CCTCTTCTTATTCTGTTCAA-3′；SUT4-F ：5′-GCCCAGACAACCCAGGAGAGAC-3′，SUT4-R：5′-CAGAGGTGAATCCAAGGACGACAG-3′）；SUT6引物參照Zhang等［26］方法設計（SUT6-F：5′-CATGGTCGTCTGATCGATGTT-3′，SUT6-R ：5′-ACCACAAATCCGGCGATAG-3′）， 內 參GADPH引物參考 Iskandar等［27］方法設計（GAPDH-F：5′-CACGGCCACTGGAAGCA-3′，GAPDH-R ：5′-TCCTCAGGGTTCCTGATGCC-3′）。

1.2.5 qPCR 擴 增 參 照 SYBR?Premix ExTaqTM試劑盒說明書配制PCR反應體系，每個處理設3個重 復，qPCR反 應 體 系 ：2×SYBRPremixExTaqTM10 μL、上下游引物（濃度為 4 μmol/L）各 2 μL、50×ROX Reference Dye 0.4 μL、 模 板 cDNA 1 μL，ddH2O補足20 μL。反應程序為試劑盒推薦程序，并在Mx3005PTM（Roche）上完成擴增。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 用2-ΔΔCt法計算相對定量值［28］。內參基因為甘蔗GADPH。

2 結果

2.1 RNA純度鑒定結果

甘蔗總RNA經瓊脂糖凝膠電泳檢測，28S和18S條帶清晰可見，無明顯降解現(xiàn)象；A260/A280比值為1.8-1.9，RNA純度與濃度均滿足于下一步實驗要求。

2.2 苗期甘蔗SUT的表達分析

通過對甘蔗苗期SUT的Q-PCR檢測分析，結果（圖1）顯示，不同家族的SUT在未成熟和成熟葉片中都有表達。在未成熟葉片中，與對照相比，SUT1表達量提高2.7倍，SUT4表達量提高2.9倍，SUT6表達量提高2.3倍，而在成熟葉片中，SUT1表達量降低2倍左右，SUT4表達量降低2倍左右，SUT6表達量提高3.4倍。

2.3 分蘗期SUT表達分析

圖1 苗期甘蔗中蔗糖轉運蛋白基因相對表達量

通過對甘蔗分蘗期SUT的Q-PCR檢測分析（圖2）。與對照相比，SUT1在分蘗期脫毒健康種苗未成熟和成熟葉片中表達量分別提高7.9倍和6.0倍；SUT4在分蘗期脫毒健康種苗未成熟和成熟葉片中表達量分別提高5.7倍和2.3倍；SUT6在分蘗期脫毒健康種苗未成熟和成熟葉片中表達量分別提高4.5倍和3.6倍。

圖2 分蘗期甘蔗中蔗糖轉運蛋白基因相對表達量

2.4 拔節(jié)期SUT表達分析

通過對甘蔗拔節(jié)期SUT的Q-PCR檢測分析（圖3）。與對照相比，SUT1在拔節(jié)期脫毒健康種苗葉片和莖稈中的相對表達量無明顯差異，其中在19-23節(jié)中降低1倍，而在莖稈中隨節(jié)間成熟度的增加其表達量有逐漸降低的趨勢，但其表達量低于對照；SUT4在拔節(jié)期脫毒健康種苗未成熟葉片中的表達量略高于對照，在莖稈中隨著莖節(jié)成熟度的增加其表達量逐漸降低，然而在1-11莖節(jié)中其表達量被上調，1-3莖節(jié)中表達量明顯高于對照，達到6.5倍；SUT6在拔節(jié)期脫毒健康種苗未成熟葉片中的表達量比對照高3.8倍，但在成熟葉片中其表達量無明顯差異，同樣隨著莖節(jié)成熟度的增加表達量逐漸降低，在1-11莖節(jié)中被上調表達，在1-3莖節(jié)中其表達量明顯高于對照，達到8.5倍，在13莖節(jié)后其表達量與對照沒有差異。

2.5 成熟期SUT的表達分析

通過對甘蔗成熟期SUT的Q-PCR檢測分析（圖4）。成熟期脫毒健康種苗葉片中SUT1、SUT4和SUT6表達量高于對照，其中SUT1在未成熟葉片中相對表達量比對照高7.2倍，在成熟葉片中其相對表達量比對照高10.4倍，在1-3莖節(jié)中其相對表達量比對照高15.8倍，隨莖桿節(jié)間成熟度增加，其相對表達量逐漸降低，在10-37莖節(jié)中無明顯差異；其中SUT4在未成熟葉片中相對表達量比對照高8.3倍，在成熟葉片中其相對表達量比對照高10.0倍，在1-3莖節(jié)中其相對表達量比對照高10.2倍，4-5莖節(jié)中其相對表達量比對照高5.2倍，在之后的莖節(jié)中表達量無明顯差異；SUT6在未成熟葉片中相對表達量比對照高7.1倍，在成熟葉片中其相對表達量比對照高10.2倍，在1-3莖節(jié)中其相對表達量比對照高15.4倍，4-5莖節(jié)中其相對表達量比對照高2.2倍，在之后的莖節(jié)中表達量無明顯差異。

圖3 拔節(jié)期甘蔗中蔗糖轉運蛋白基因相對表達量

圖 4 成熟期甘蔗中蔗糖轉運蛋白基因相對表達量

3 討論

甘蔗脫毒種苗比常規(guī)種苗出苗快、生長快、分蘗苗多，有效莖多，蔗株高，增產效益明顯，同時還能夠增加蔗株的蔗糖含量，提高單位面積的經濟效益。目前，在基因水平上將脫毒健康種苗與為未脫毒苗進行比較的相關研究已有些報道［25，29-31］，但還沒有蔗糖轉運蛋白（SUT）方面的報道。SUT是蔗糖運輸和積累過程中的關鍵轉運蛋白，其轉運活性對蔗糖的最終積累量起著重要的作用［32-34］。SUT亞族基因在不同植物中的時空表達模式存在差異，功能也不同［35-36］。甘蔗常用栽培品種是異源多倍體且遺傳背景復雜，SUT家族基因在不同生長時期時空表達模式不同，推測它們對甘蔗產量形成和糖分積累的影響也不同［34，36-37］。

已有研究表明不同類型SUT基因在甘蔗不同蔗糖積累階段發(fā)揮不同作用［37-38］。本研究對甘蔗脫毒健康種苗中的3種蔗糖轉運蛋白基因的表達進行分析發(fā)現(xiàn)與常規(guī)種苗相比SUT1、SUT4和SUT6均存在不同程度的上調表達，特別是在快速生長代謝旺盛部位，并且在成熟期葉片和蔗糖快速積累莖節(jié)中SUTs的大幅上調表達促進蔗糖的運輸、分配、利用，并可能最終提高脫毒健康種苗的產量和糖含量。然而在甘蔗不同生長時期脫毒健康種苗中SUT1、SUT4和SUT6差異表達模式不同。

在脫毒健康種苗的苗期和分蘗期葉片中3種SUT表達存在差異，并且分別在成熟葉片和未成熟葉片的表達差異也不同，SUT1和SUT4在脫毒健康種苗苗期未成熟葉片、分蘗期未成熟葉片和成熟葉片中表達高于對照；SUT6在苗期和分蘗期葉片中的表達高于對照。表明不同SUT在這兩個時期葉片蔗糖運輸及分配中發(fā)揮不同作用，推測苗期成熟葉片中SUT1和SUT4下調表達，其葉片糖分積累減弱，有利于蔗糖運輸，而未成熟葉片中上調表達，有利于蔗糖利用；SUT6上調表達，能夠促進這兩個時期葉片的快速生長和糖分的運輸，推測SUT1和SUT4參與調控蔗糖積累，而SUT6可能調控蔗糖的運輸，這在其他植物同源蔗糖轉運蛋白研究中也得到類似的結果［39-40］。

同時在拔節(jié)期脫毒健康種苗中SUT1的表達沒有變化，表明脫毒處理對拔節(jié)期SUT1的表達影響不大，而SUT4和SUT6在未成熟莖節(jié)中明顯上調表達。幼嫩莖節(jié)中蔗糖運輸和代謝最活躍，蔗糖的高效運輸有利于莖節(jié)的快速生長和糖分積累，由此推測拔節(jié)期SUT4和SUT6的上調表達有利于促進甘蔗產量形成及糖分積累。趙婷婷等［37］也發(fā)現(xiàn)SUT4表達量與糖分的積累呈正相關，表明SUT4對甘蔗蔗糖的快速運輸和積累起著重要的作用。

成熟期脫毒健康種苗葉片和莖稈中不同SUT表達模式基本一致，SUT1、SUT4和SUT6在葉片和未成熟莖節(jié)中上調表達，而在成熟莖節(jié)中表達量沒有差異，表明蔗糖轉運蛋白能夠有效提高葉片中蔗糖的轉運效率，促進葉片中蔗糖的輸出和未成熟莖節(jié)中蔗糖的分配及利用，進而促進蔗糖的積累。莖稈的成熟主要體現(xiàn)在莖節(jié)蔗糖的含量的升高，此時，蔗糖轉運蛋白表達量的增加，有利于蔗糖積累，促進莖稈的成熟，從而提高莖稈中的蔗糖含量。在水稻中通過提高蔗糖轉運蛋白的表達量能夠增加其產量［12，41］，進一步表明通過改變蔗糖轉運蛋白的表達，能夠影響碳的分配，從而提高作物的產量。甘蔗脫毒健康種苗能夠有效提高甘蔗產量和糖分，本研究表明不同類型蔗糖轉運蛋白基因的表達與其產量和糖分增加相關，對蔗糖轉運蛋白基因功能的更進一步研究將有助于揭示脫毒健康種苗的增產增糖機理。

4 結論

在甘蔗脫毒健康種苗中，SUT1、SUT4和SUT6在不同生長時期的組織中均上調表達，初步推測甘蔗進行脫毒處理能夠上調葉片和未成熟莖節(jié)中SUT的表達，促進蔗糖利用及積累，進而提高蔗莖的產量和糖含量。