郝雅賓 張愛(ài)菊 劉金殿 顧志敏

（浙江省淡水水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 浙江省淡水水產(chǎn)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所浙江研究中心，湖州 313001）

魚類資源下滑、匱乏或者小型化是當(dāng)今漁業(yè)資源面臨的重大問(wèn)題之一，究其原因主要有過(guò)度捕撈、水污染、棲息地退化、遺傳污染、氣候變化和入侵物種引進(jìn)等［1-3］，這些因素使得魚類資源保護(hù)具有挑戰(zhàn)性。水生態(tài)系統(tǒng)構(gòu)成復(fù)雜多樣，某些魚類因個(gè)體小、數(shù)量少、善隱蔽等因素難以被捕獲，且處于不同生長(zhǎng)發(fā)育階段形態(tài)上差異較大，極難鑒定，這使得魚類資源調(diào)查極為困難。傳統(tǒng)的調(diào)查主要利用拖網(wǎng)、圍網(wǎng)、電捕魚、釣魚、水聲和視覺(jué)等方法［4］來(lái)觀察魚類，不僅耗時(shí)費(fèi)力、價(jià)格不菲，而且有的方法會(huì)對(duì)魚體造成傷害［5］，同時(shí)還可能會(huì)由于采樣方式的缺陷導(dǎo)致數(shù)據(jù)不全面、不可靠。環(huán)境DNA（eDNA）是最近開發(fā)的一種高靈敏、高效率且無(wú)損傷的調(diào)查工具［6］，能夠?yàn)榻鉀Q魚類資源研究過(guò)程中存在的難題提供高效快捷的方法，且已經(jīng)達(dá)到了成熟的科學(xué)水平［7-9］。eDNA是指從生物體生活環(huán)境中直接提取到的DNA片段總和，由不同物種的DNA混合而成，主要包含生物體細(xì)胞釋放到水中的胞內(nèi)遺傳物質(zhì)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)裂解或死亡后釋放到水中的胞外DNA［10-11］。eDNA技術(shù)是指從環(huán)境樣品中直接提取DNA片段，應(yīng)用分子手段檢測(cè)eDNA中所包含識(shí)別片段，結(jié)合目標(biāo)物種或種群的特異性基因識(shí)別片段進(jìn)行比對(duì)的一種手段，其結(jié)果可用于分析目標(biāo)生物在生態(tài)系統(tǒng)中的分布特征。近幾年來(lái)，eDNA技術(shù)在魚類種類及多樣性監(jiān)測(cè)［12-15］、資源量估測(cè)［16-17］和種群分布［18］等方面都有一定的發(fā)展和應(yīng)用。隨著魚類資源的深入研究，分子技術(shù)與傳統(tǒng)的調(diào)查方法相結(jié)合的方式將成為未來(lái)該領(lǐng)域研究的一個(gè)發(fā)展趨勢(shì)。本文主要對(duì)環(huán)境DNA技術(shù)在魚類資源研究中的應(yīng)用進(jìn)行了綜述，旨為下一步開展魚類物種多樣性、資源量估算和種群分布等研究提供參考。

1 環(huán)境DNA技術(shù)的研究方法

1.1 樣品采集

依據(jù)選取的eDNA分析方法有必要選擇合適的水樣采集方式。一般的，使用采水器在不同深度的水位采集不同的水樣，采水器等設(shè)備和儲(chǔ)存容器應(yīng)無(wú)菌處理，以避免來(lái)自除取樣水體之外的其他來(lái)源的目標(biāo)DNA污染樣品。采集的水樣體積在15 mL-10 L不等（表1），而最常用的水樣體積為1 L-2 L，且同一水體中需采集多個(gè)重復(fù)樣品［19-20］。通過(guò)多次取樣的方法以增加水樣中的物種空間覆蓋度，提高物種檢出概率［10］。研究表明，水體沉積物中的eDNA比水體中的更加集中［21］，有時(shí)為了提高檢出概率，可選擇采集水域中的底泥沉積物。

1.2 樣品DNA提取

通常水體中eDNA主要有離心沉淀和真空過(guò)濾兩種方法來(lái)分離（表1）。水樣采集后，應(yīng)保持樣品冷卻［31］，并盡量減少暴露于光下［32］，且在24 h內(nèi)進(jìn)行過(guò)濾或沉淀［20］，以減少DNA降解，降低物種檢出率。過(guò)濾主要是通過(guò)濾膜來(lái)進(jìn)行的，濾膜的孔徑大小不一，有 0.22 μm-1.5 μm、0.2 μm-10 μm［33］和 0.45 μm-3 μm［10］不等?？讖皆叫?，eDNA 提取的量越大，但孔徑小易堵塞濾膜，影響過(guò)濾速度［33］。一般使用2.5倍體積的無(wú)水乙醇或者0.6倍體積的異丙醇沉淀eDNA［34］，也可通過(guò)離心的方法。eDNA可通過(guò)多種方法從過(guò)濾或沉淀物中提取，可利用氯仿［35-36］和二氧化硅萃取［37］，或細(xì)胞的物理裂解［14，22］，DNA 快速提取試劑盒［38-39］等提取。

表1 環(huán)境DNA樣品的采集和處理

1.3 eDNA分析

研究表明，水樣中的大部分eDNA可能是包含在線粒體或游離的細(xì)胞內(nèi)的DNA，而不是游離DNA［33］。由于線粒體DNA拷貝數(shù)大、區(qū)分物種的保守序列較多，常優(yōu)先于核DNA進(jìn)行eDNA分析，以提高檢測(cè)概率。與核DNA比較而言，線粒體DNA很大程度上避免了環(huán)境中的DNA易降解和濃度低等因素造成的不易檢測(cè)問(wèn)題［10］。

eDNA分析通常基于帶有物種特異性遺傳標(biāo)記序列的線粒體DNA片段（80-250 bp）進(jìn)行高通量測(cè)序［5］，克隆測(cè)序分析時(shí)可以超出這個(gè)范圍。eDNA用于研究魚類資源方面，假如只調(diào)查研究某一種魚類時(shí)，則只需針對(duì)該種設(shè)計(jì)特異性高的引物，確保目標(biāo)物種的高靶特異性，沒(méi)有堿基對(duì)錯(cuò)配，以及任何緊密相關(guān)或共存物種盡可能多的錯(cuò)配［24］。假如研究一魚類群體時(shí)，則需要設(shè)計(jì)通用引物，主要包含 16s、COI、Cytb1、Cytb4 和 D-loop 等［40］， 使 環(huán)境中魚類群體的eDNA擴(kuò)增的識(shí)別片段足夠多，還需建立目標(biāo)（A）與非目標(biāo)（B）基因庫(kù)，將擴(kuò)增B超過(guò)A設(shè)定值的引物剔除，以得到具足夠通用性且一定特異性的通用引物［41］。利用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增的片段幾十到幾百bp不等（表2），獲得DNA識(shí)別片段，測(cè)序后可得到該片段的序列。PCR結(jié)果進(jìn)行凝膠電泳，顯示正確長(zhǎng)度的獨(dú)特PCR凝膠條帶為陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果，陽(yáng)性結(jié)果表明eDNA樣品中包含目標(biāo)物種的DNA，代表取樣水域中有該魚類生存；陰性結(jié)果說(shuō)明不含有來(lái)自目標(biāo)物種的DNA，代表取樣水域中沒(méi)有目標(biāo)魚類或者取樣量不足于檢測(cè)到。為了確認(rèn)陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果，至少重復(fù)兩次試驗(yàn)［25，42］。為避免影響試驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)在DNA樣品采集、提取和擴(kuò)增的試驗(yàn)過(guò)程中設(shè)置陰性對(duì)照組以避免交叉污染［22，39］。

表2 運(yùn)用環(huán)境DNA檢測(cè)魚類情況

2 環(huán)境DNA技術(shù)在魚類資源研究中的應(yīng)用

2.1 種類和物種多樣性研究

國(guó)內(nèi)外運(yùn)用eDNA技術(shù)監(jiān)測(cè)魚類種類和物種多樣性調(diào)查方面報(bào)道不少（表3）。主要包含瀕危種、稀有種和入侵種的監(jiān)測(cè)。常見(jiàn)魚類是水域中魚類群落的組成，應(yīng)用eDNA了解其資源狀況，有利于保護(hù)和開發(fā)魚類資源，有利于當(dāng)?shù)氐臐O業(yè)增殖放流工作，有利于水生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定。而瀕危或稀有魚類由于自身或人為或自然等因素導(dǎo)致其野生種群易面臨絕滅的危險(xiǎn)。一個(gè)關(guān)鍵種的滅絕可能破壞水生態(tài)系統(tǒng)中食物鏈，造成水生態(tài)系統(tǒng)的不穩(wěn)定。瀕?；蛳∮恤~類不易捕獲且生物量少，而eDNA技術(shù)可在生物量較小的情況下進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)其監(jiān)測(cè)具有重要意義。入侵魚類易造成生物多樣性喪失，早發(fā)現(xiàn)早處理是應(yīng)對(duì)生物入侵的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［44］。而在入侵前期，入侵種生物量較小，未形成種群，易低估入侵程度。因此，應(yīng)用eDNA技術(shù)對(duì)入侵種進(jìn)行早期檢測(cè)，可為生物入侵預(yù)防工作提供支持。很大程度上，水體中提取到的DNA量影響著水生系統(tǒng)中的生物多樣性檢測(cè)［45］。

表3 江河湖泊海域中運(yùn)用環(huán)境DNA檢出的魚類

2.2 資源量估算

在漁業(yè)資源評(píng)估上，資源量基于傳統(tǒng)方法采樣很難進(jìn)行準(zhǔn)確估計(jì)的［10］，而對(duì)于那些處于受威脅和瀕危物種來(lái)說(shuō)，準(zhǔn)確和精確的資源量估計(jì)顯得至關(guān)重要［50］，這對(duì)于保護(hù)和挽救工作具有重要意義。水聲學(xué)可以估算一個(gè)水域中魚類的平均密度，但也很難得到準(zhǔn)確和精確的數(shù)據(jù)。因此，eDNA濃度與資源量之間的關(guān)系是一個(gè)相當(dāng)大的研究課題，但也存在eDNA技術(shù)對(duì)資源監(jiān)測(cè)的準(zhǔn)確性如何保證的問(wèn)題。近年來(lái)研究表明，可以從eDNA在水樣中的豐度來(lái)估計(jì)魚類的相對(duì)資源量，并發(fā)現(xiàn)資源量與eDNA濃度之間存在正相關(guān)關(guān)系［16，27］，盧珊［51］發(fā)現(xiàn) eDNA與相應(yīng)的水生動(dòng)物間存在密切的關(guān)系，但這種關(guān)系可能不適用于所有物種和環(huán)境條件［52］?？梢?jiàn)，模擬實(shí)驗(yàn)可了解某個(gè)種類的豐度與eDNA濃度的關(guān)系，從而推測(cè)其資源量與eDNA濃度的關(guān)系方程。由此，對(duì)某個(gè)自然水域中的eDNA進(jìn)行采樣分析，監(jiān)測(cè)某個(gè)種類的eDNA濃度，據(jù)模擬實(shí)驗(yàn)所得的方程來(lái)推測(cè)其在某個(gè)自然水域中的資源量。由于eDNA的來(lái)源，脫落率，降解速率，轉(zhuǎn)運(yùn)和沉降等因素，這些因素都會(huì)影響eDNA的提取，從而不表現(xiàn)出這種關(guān)系［53］。也就是說(shuō)，eDNA在水體中存在具有實(shí)時(shí)性，易影響與魚類資源量的生物關(guān)系。除此之外，在樣品處理期間錯(cuò)誤引用也可能會(huì)導(dǎo)致數(shù)量關(guān)系的分離。運(yùn)用eDNA研究魚類生物量時(shí)要注意近緣物種干擾、魚類的活動(dòng)周期以及水流速度方向等問(wèn)題。在今后的一段時(shí)間內(nèi)，資源量和eDNA濃度之間的關(guān)系可能是一個(gè)熱點(diǎn)的研究領(lǐng)域。

2.3 種群分布

傳統(tǒng)的研究方法很難精確的劃分魚類種群的分布范圍，而eDNA技術(shù)不受條件的限制，具靈敏度高、無(wú)損傷性的特點(diǎn)，只需采集水體樣本獲得DNA即可分析魚類的存在。運(yùn)用eDNA技術(shù)來(lái)分析魚類入侵種和瀕危種種群分布的報(bào)道不少，美國(guó)密歇根湖及其周邊河流中的鰱（H.molitrix）和鳙（H.nobilis）的擴(kuò)散分布范圍已經(jīng)超出了傳統(tǒng)調(diào)查方法研究劃定的區(qū)域［22］，這對(duì)入侵種的防治工作具有提示作用［25］。Takahara等［25］分析了藍(lán)鰓太陽(yáng)魚（L.macrochirus）在日本本土及周邊島嶼水域的擴(kuò)散分布趨勢(shì)情況。歐洲泥鰍（Misgurnus fossilis）不僅在丹麥現(xiàn)有分布區(qū)有分布，且在以前調(diào)查發(fā)現(xiàn)的分布區(qū)中也有其的分布蹤跡［54］。另外，入侵種克氏原鰲蝦（Procambarus clarkii）在梯田中分布情況也有報(bào)道［55］。可見(jiàn)，在種群分布確定方面，eDNA技術(shù)優(yōu)于傳統(tǒng)的調(diào)查方法，其發(fā)展和應(yīng)用將有助于本地種的監(jiān)測(cè)，也有助于對(duì)入侵種和瀕危種部分范圍進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

2.4 食性分析與“三場(chǎng)一通道”監(jiān)測(cè)

eDNA技術(shù)可運(yùn)用于魚類的食性分析，近年來(lái)，eDNA也開始應(yīng)用于動(dòng)物食性的研究，但魚類食性分析的鮮有報(bào)道。食性分析的傳統(tǒng)方法主要有消化殘留物觀察法和腸道解剖法，它們都存在著局限性，依賴于觀察者對(duì)腸道內(nèi)未消化物和消化殘留物的準(zhǔn)確判斷，對(duì)于生活在水下的微小型魚類難以通過(guò)視覺(jué)觀察來(lái)了解。eDNA技術(shù)在動(dòng)植物［56-57］、浮游生物［51］、蝦類［51，55］和魚類等［22-25］監(jiān)測(cè)都有應(yīng)用的報(bào)道。因此，在食性分析時(shí)，對(duì)水生植物、浮游生物及其餌料魚類都可以應(yīng)用eDNA進(jìn)行監(jiān)測(cè)，可作為一種便捷的檢測(cè)方法；而肉食性魚類與作為餌料魚類可通過(guò)設(shè)計(jì)特異性引物加以區(qū)分開來(lái)?？梢?jiàn)，可以應(yīng)用eDNA的方法來(lái)監(jiān)測(cè)魚類腸道中餌料生物的種類，且具有無(wú)限潛力，再結(jié)合傳統(tǒng)方法，或許在全面了解魚類食性方面可取得巨大的進(jìn)展。

目前，應(yīng)用eDNA技術(shù)對(duì)定居性魚類的產(chǎn)卵場(chǎng)和洄游性魚類“三場(chǎng)一通道”監(jiān)測(cè)工作鮮有報(bào)道，魚類的“三場(chǎng)一通道”主要是指魚類產(chǎn)卵場(chǎng)、索餌場(chǎng)、越冬場(chǎng)和洄游通道，是魚類棲息生活生存的重要場(chǎng)所。漁業(yè)資源調(diào)查工作者可在魚類種群分布探究的基礎(chǔ)上，eDNA技術(shù)結(jié)合傳統(tǒng)的調(diào)查方法可否更快捷有效的對(duì)定居性魚類種群產(chǎn)卵場(chǎng)和對(duì)洄游性魚類“三場(chǎng)一通道”進(jìn)行監(jiān)測(cè)，傳統(tǒng)方法的耗費(fèi)人力物力和時(shí)間較大，應(yīng)用eDNA技術(shù)監(jiān)測(cè)“三場(chǎng)一通道”將是今后漁業(yè)資源工作者值得探索的方向。

3 展望

與基于捕獲的方法相比，eDNA技術(shù)具有高靈敏、無(wú)損傷、低成本、快捷方便等特點(diǎn)，在魚類種類監(jiān)測(cè)、魚類多樣性監(jiān)測(cè)、資源量估測(cè)和種群分布等方面已得到應(yīng)用，而將來(lái)是否可應(yīng)用于食性分析與“三場(chǎng)一通道”監(jiān)測(cè)的工作中值得探討。但目前eDNA技術(shù)還存在不足之處，如不能提供魚類的生理狀態(tài)、生長(zhǎng)發(fā)育階段等生物學(xué)特征以及魚類的種群結(jié)構(gòu)；不能提供魚類目標(biāo)種存在或不存在的實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)；環(huán)境中保存的線粒體eDNA不能在將“純種”與雜交種區(qū)分開來(lái)。雖然存在這些缺點(diǎn)，但將eDNA技術(shù)作為一種魚類資源調(diào)查評(píng)估的工具未免不可，結(jié)合傳統(tǒng)的采樣方法，如電動(dòng)捕撈、網(wǎng)捕、水聲調(diào)查等，可以有效的摸清魚類資源狀況，但eDNA技術(shù)還不能完全取代經(jīng)過(guò)時(shí)間驗(yàn)證的魚類資源評(píng)估方法。