熱依拉·普拉提，黃李勇，趙 雄，依明·蘇來曼*

(1.新疆維吾爾自治區(qū)畜牧總站，烏魯木齊 830001；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052）

脂肪型脂肪酸結(jié)合蛋白(adipocyte fatty-acid binding protein，A-FABP)屬于脂肪酸結(jié)合蛋白家族。目前研究發(fā)現(xiàn)FABPs家族至少包括9種蛋白，且該家族蛋白在細(xì)胞脂肪酸代謝及轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮重要作用[1]，在哺乳動(dòng)物中，A-FABP蛋白主要在脂肪細(xì)胞中表達(dá)并參與甘油三酯的形成及脂肪沉積[2、3]。A-FABP基因多態(tài)性研究表明，雞[4]、鴨[5]、牛[6]、豬[7]的A-FABP基因多態(tài)性與肌內(nèi)脂肪沉積相關(guān)，可作為重要的候選基因進(jìn)行研究。PBDC1是含有198個(gè)氨基酸的多糖生物合成域1蛋白 （polysaccharide biosyn-thesis domain-containing1，PBDC1），分子質(zhì)量約為22.2 kDa。PBDC1基因位于小鼠染色體上,其全長(zhǎng)cDNA為597 bp[8]。前期工作研究發(fā)現(xiàn)，在丁酸鈉誘導(dǎo)MEL細(xì)胞分化的過程中PBDC1的蛋白含量逐漸下調(diào)。由此推測(cè)PBDC1蛋白可能與誘導(dǎo)的MEL細(xì)胞分化有關(guān)，而目前，關(guān)于PBDC1蛋白在動(dòng)物中多態(tài)性研究較少。鑒于A-FABP和PBDC1基因的功能和作用，將二者作為與生產(chǎn)性狀相關(guān)的候選基因來研究，對(duì)以后的動(dòng)物分子育種和標(biāo)記輔助選擇具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

巴什拜羊是上世紀(jì)初期，哈薩克族愛國(guó)人士巴什拜·喬拉克·巴平選用哈薩克羊中優(yōu)秀母羊作為母本，并嚴(yán)格選育優(yōu)良種公羊，同時(shí)導(dǎo)入野生盤羊進(jìn)行長(zhǎng)期的雜交選育而形成的優(yōu)良地方品種[9]。具有耐寒、適應(yīng)性強(qiáng)、生長(zhǎng)速度快、早熟、肉質(zhì)鮮美等特點(diǎn)。巴什拜羊原產(chǎn)于裕民縣的巴爾魯克山區(qū)[10]，現(xiàn)今主要分布在塔城地區(qū)的裕民縣、額敏縣、塔城市以及托里縣。根據(jù)2014年統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示塔城地區(qū)的巴什拜羊年底存欄總數(shù)已達(dá)150萬只[11]。目前，關(guān)于巴什拜羊生長(zhǎng)發(fā)育性狀候選基因的標(biāo)記輔助選擇研究報(bào)道較少。本研究對(duì)巴什拜羊A-FABP和PBDC1基因進(jìn)行多態(tài)性分析，探討基因多態(tài)性與生長(zhǎng)指標(biāo)的關(guān)系，期望為后期巴什拜羊分子育種提供有利的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本選擇

在新疆裕民縣巴什拜羊繁育基地隨機(jī)的選取120只年齡1.5歲的純種巴什拜羊作為試驗(yàn)羊。頸靜脈采血5 mL/只，枸櫞酸鈉抗凝，放于冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑與藥品

Tris平衡酚，無水乙醇，70%無水乙醇，2×Taq PCR MasterMix，6×Loading Buffer，核酸提取液，DL2000，ddH2O，蒸餾水，甲醛，30%非變性聚丙烯酰胺，T10E10，T10E1，瓊脂糖粉，硝酸銀，氫氧化鈉等。

1.1.3 試驗(yàn)儀器

電子天平：瑞士梅特勒-托利多公司；DYY-6C型電泳儀：北京市六一儀器廠；TGL-16M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)：湘儀公司；TGL-16M微量高速離心機(jī)：湘儀公司；Biometra梯度PCR儀：德國(guó)Biometra公司；凝膠成像儀：美國(guó)Bio-Rad；HS-3垂直混合器：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；WD-9405B型水平搖床：北京市六一儀器廠；立式高壓滅菌鍋：博迅實(shí)業(yè)有限公司；旋渦混合儀：滬西分析儀器廠；微量進(jìn)樣器：上海高鴿工貿(mào)有限公司；移液器：上海萬島儀器科技有限公司微波爐：Galanz公司；低溫冰箱：海爾集團(tuán)；冰柜：海爾集團(tuán)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的提取

采用酚-氯仿抽提法，抽提巴什拜羊血液中基因組DNA，溶于配好的T10E1溶液中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物的設(shè)計(jì)與合成

參考 Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)所公布的綿羊 A-FABP基因序列 （NC_019466.2）、PBDC1基因序列（NC_019484.2），利用Premier5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列見表1。由上海生物工程有限公司進(jìn)行引物合成。

表1 引物序列信息

1.2.3 PCR擴(kuò)增體系與反應(yīng)條件

PCR 反應(yīng)體系 20 μL：PCR MasterMix10 μL，DNA 模板（100 ng/uL）1 μL，上、下游引物（10 pmol/uL）各 0.5 μL，加 ddH2O 至 20 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性 5 min，94 ℃變性 30 s，退火 30 s（退火溫度見表 1），72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min，4℃保存，產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 PCR-SSCP檢測(cè)

參考周延清[12]等的方法對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行SSCP分析，并判定各種基因型。

1.2.5 DNA測(cè)序

選取不同基因型的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果運(yùn)用Chromas軟件和DNAMAN軟件進(jìn)行分析

1.2.6 體尺指標(biāo)測(cè)定

參照《羊生產(chǎn)學(xué)》的方法[13]，對(duì)試驗(yàn)羊的體長(zhǎng)、體高、體重、管圍及胸圍進(jìn)行實(shí)地測(cè)量，并記錄測(cè)量數(shù)據(jù)。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

運(yùn)用軟件PIC-CALC與POPGENE32計(jì)算巴什拜羊A-FABP、PBDC1基因的基因型頻率、等位基因頻率、有效等位基因數(shù)(Ne)、多態(tài)信息含量(PIC)、雜合度(He)和純合度(Ho)。運(yùn)用Microsoft Excel 2003對(duì)巴什拜羊體重、體高、管圍、體長(zhǎng)等數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析；運(yùn)用SPSS 21.0軟件中的方差分析對(duì)個(gè)體基因型與巴什拜羊的體尺數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，以“最小二乘均值士標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA檢測(cè)

1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的DNA樣品，結(jié)果如圖1所示，基因組DNA條帶清晰，酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果顯示DNA OD260/OD280值在1.6～1.8，表明基因組DNA的純度比較好，可用于續(xù)試驗(yàn)。

2.2 巴什拜羊A-FABP、PBDC1基因的PCR檢測(cè)

1.5%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)A-FABP、PBDC1基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果如圖2、3、4所示，PCR擴(kuò)增得到清晰明亮的單一條帶，且擴(kuò)增片段分別為157 bp、117 bp、234 bp與預(yù)期結(jié)果一致，符合SSCP試驗(yàn)要求。

圖1 巴什拜羊基因組DNA檢測(cè)結(jié)果

圖2 A-FABP基因外顯子2 PCR檢測(cè)結(jié)果

圖3 A-FABP基因外顯子3 PCR檢測(cè)結(jié)果

圖4 PBDC1基因外顯子1 PCR檢測(cè)結(jié)果

2.3 SSCP檢測(cè)結(jié)果

對(duì)A-FABP和PBDC1基因各引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行SSCP檢測(cè)。在A-FABP基因的外顯子2擴(kuò)增片段上存在2種基因型，分別定義為GG型和GA型（圖5），而在外顯子3擴(kuò)增片段上未檢測(cè)到多態(tài)性存在（圖6）；在PBDC1基因的外顯子2擴(kuò)增片段上存在2種基因型，分別定義為AA型和AB型（圖7）。

圖5 A-FABP基因外顯子2分型圖

圖6 A-FABP基因外顯子3分型圖

圖7 PBDC1基因外顯子1分型圖

2.4 測(cè)序結(jié)果分析

選擇A-FABP和PBDC1基因擴(kuò)增的不同類型的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，A-FABP測(cè)序結(jié)果與Genbank上發(fā)表的綿羊A-FABP基因序列（NC_019466.2）進(jìn)行多序列比較，結(jié)果顯示A-FABP基因存在一處突變，在3159bp處存在G→A的突變。結(jié)果如圖8、9所示。氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，A-FABP基因在3159bp處存在G→A突變并未使氨基酸發(fā)生改變，此位點(diǎn)的突變?yōu)橥x突變；PBDC1測(cè)序結(jié)果與Genbank上發(fā)表的綿羊PBDC1基因序列 （NC_019484.2）進(jìn)行多序列分析比較，發(fā)現(xiàn)PBDC1基因存在一處突變，在170bp處發(fā)生A堿基缺失，結(jié)果如圖10、11所示。氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，PBDC1基因在170bp處發(fā)生A堿基缺失，使蘇氨酸產(chǎn)生移碼突變。

圖8 A-FABP基因的測(cè)序結(jié)果

圖9 基因型測(cè)序峰圖

圖10 PBDC1基因的測(cè)序結(jié)果

圖11基因型測(cè)序峰圖

2.5 基因群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

2.5.1 A-FABP基因群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

2.5.1.1 A-FABP基因的基因頻率和基因型頻率 由表2可知，在檢測(cè)的巴什拜羊群體中，A-FABP基因存在GG型和GA型2種基因型，基因型頻率為0.700和0.300。G、A基因頻率為0.850和0.150。G為優(yōu)勢(shì)等位基因。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，A-FABP基因在巴什拜羊群體中處于哈代溫伯格平衡(P＞0.05)。

表2 A-FABP基因的基因型頻率和等位基因頻率

2.5.1.2 A-FABP基因的遺傳參數(shù)值 由表3可知，A-FABP基因在巴什拜羊群體中的基因純合度是0.745，基因雜合度是0.255，有效等位基因數(shù)是1.342，多態(tài)信息含量為0.222，為低度多態(tài)位點(diǎn)。

表3 A-FABP基因的基因純合度、雜合度、有效等位基因和多態(tài)信息含量

2.5.1.3巴什拜羊A-FABP基因不同基因型與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析 由表4可知，在巴什拜羊群體中，GA型個(gè)體的胸圍、體重和體長(zhǎng)均顯著高于GG型個(gè)體（P＜0.05），GA型個(gè)體和GG型個(gè)體的體高和管圍等指標(biāo)差異不顯著（P＞0.05）。因此，初步推測(cè)A-FABP基因在3159bp處的突變有可能作為一種遺傳標(biāo)記，通過對(duì)優(yōu)勢(shì)基因型的選擇，加快對(duì)巴什拜羊育種的遺傳改良。

表4 A-FABP基因不同基因型與巴什拜羊生長(zhǎng)性狀的關(guān)系（平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤）

2.5.2 PBDC1基因群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

2.5.2.1 PBDC1基因的基因頻率和基因型頻率 由表5可知，在檢測(cè)的巴什拜羊群體中，PBDC1基因存在AA型和AB型2種基因型，基因型頻率為0.717和0.283。A、B基因頻率為0.858和0.142。A為優(yōu)勢(shì)等位基因。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，PBDC1基因在巴什拜羊群體中處于哈代溫伯格平衡(P＞0.05)。

表5 PBDC1基因的基因型頻率和等位基因頻率

2.5.2.2 PBDC1基因的遺傳參數(shù)值 由表6可知，PBDC1基因在巴什拜羊群體中的基因純合度是0.757，基因雜合度是0.243，有效等位基因數(shù)是1.321，多態(tài)信息含量為0.214，為低度多態(tài)位點(diǎn)。

表6 PBDC1基因的基因純合度、雜合度、有效等位基因和多態(tài)信息含量

2.5.2.3 巴什拜羊PBDC1基因不同基因型與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析 由表7可知，在巴什拜羊群體中，AB型個(gè)體的體重、體長(zhǎng)均顯著高于AA型個(gè)體（P＜0.05），AB型個(gè)體和AA型個(gè)體的胸圍、體高和管圍等指標(biāo)差異均不顯著（P＞0.05）。因此，初步推測(cè)PBDC1基因在170bp處表現(xiàn)的多態(tài)有可能作為一種遺傳標(biāo)記。

表7 PBDC1基因不同基因型與巴什拜羊生長(zhǎng)性狀的關(guān)系（平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤）

3 討 論

3.1 A-FABP、PBDC1基因群體遺傳特征分析

純合度、雜合度、多態(tài)信息含量、有效等位基因數(shù)等指標(biāo)可以從不同方向不同角度反映群體的遺傳變異的程度。群體的雜合度與遺傳多樣性密切相關(guān)，當(dāng)群體的遺傳變異較大時(shí)群體雜合度越高，說明遺傳多樣性比較豐富，選擇潛力就越大。在本試驗(yàn)中，A-FABP和PBDC1基因在巴什拜羊群體中的基因純合度分別0.745和0.757，基因雜合度分別為0.255和0.243，多態(tài)信息含量為0.222和0.214，且均為低度多態(tài)位點(diǎn)。表明A-FABP和PBDC1基因所發(fā)生的突變?cè)诎褪舶菅蛉后w中遺傳變異較小。

3.2 A-FABP、PBDC1基因多態(tài)性與生長(zhǎng)性狀的相關(guān)分析

近幾年，有較多的研究報(bào)道關(guān)于A-FABP基因多態(tài)性，Yan等[14]對(duì)新西蘭8個(gè)綿羊品種的A-FABP基因進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)8處變異位點(diǎn)。Xu等[15]研究發(fā)現(xiàn)中國(guó)3個(gè)地方品種綿羊A-FABP基因在內(nèi)含子1區(qū)域內(nèi)存在A到G的突變Smith等[16]研究發(fā)現(xiàn)澳州美利奴羊A-FABP基因變異與羊毛性狀質(zhì)量有關(guān)。王卓等[6]對(duì)秦川牛A-FABP基因進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)第1內(nèi)含子的突變位點(diǎn)與大理石花紋、嫩度、背膘厚等存在相關(guān)性，第4外顯子的GG基因型個(gè)體的嫩度、大理石花紋、背膘厚等指標(biāo)均顯著高于CC基因型個(gè)體。Cho等[17]研究發(fā)現(xiàn)A-FABP基因外顯子2的突變與牛的背部脂肪厚度有相關(guān)性。劉艷妍[18]等對(duì)秦川牛的A-FABP基因的多態(tài)性及其與肉用性狀的研究發(fā)現(xiàn)A-FABP基因5'側(cè)翼區(qū)的突變對(duì)肉牛的產(chǎn)肉性狀影響較大，外顯子2的SNPs與屠宰率、嫩度、胴體長(zhǎng)和眼肌面積有相關(guān)性，外顯子3的SNPs與眼肌面積有相關(guān)性，A-FABP基因的3'側(cè)翼區(qū)突變與牛胴體深有相關(guān)性。本研究以巴什拜羊?yàn)檠芯繉?duì)象，對(duì)AFABP基因的外顯子2和外顯子3區(qū)域進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在A-FABP基因的第3外顯子區(qū)域內(nèi)未檢測(cè)到突變，而在A-FABP基因的第2外顯子區(qū)域內(nèi)檢測(cè)到多態(tài)性，存在2種基因型，分別定義為GG型和GA型，基因型頻率分別是0.700和0.300。測(cè)序結(jié)果顯示A-FABP基因在3159bp處存在G到A的突變，且該突變?yōu)橥x突變。大量研究反應(yīng)出，同義突變可以通過改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)等方式影響基因的表達(dá)、改變基因的翻譯效率、改變mRNA穩(wěn)定性和定位，最終引起表型數(shù)據(jù)存在差異[19-21]。周明亮等[22]研究顯示，IGF-I外顯子3區(qū)域內(nèi)A→G并未引起氨基酸改變，但該SNP位點(diǎn)與綿羊斷奶日增重和綿羊出生后的斷奶體重存在顯著相關(guān)。本試驗(yàn)結(jié)果也表明GA型個(gè)體的胸圍、體重、體長(zhǎng)均顯著高于GG型個(gè)體（P＜0.05），初步推測(cè)A-FABP基因外顯子2的3159bp處存在的多態(tài)通過對(duì)優(yōu)勢(shì)基因型的選擇，有可能作為一種遺傳標(biāo)記，可加快對(duì)巴什拜羊育種的遺傳改良。

PBDC1是作為一種新發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)，目前關(guān)于PBDC1的研究相對(duì)較少，且關(guān)于PBDC1基因多態(tài)性的研究還未見報(bào)道。本研究以巴什拜羊?yàn)檠芯繉?duì)象，對(duì)PBDC1基因的多態(tài)性進(jìn)行初步探索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PBDC1基因在第1外顯子的170bp處發(fā)生A堿基缺失，存在2種基因型：AA型和AB型，基因型頻率分別是是0.717和0.283。且AB型個(gè)體的體重和體長(zhǎng)均顯著高于AA型個(gè)體（P＜0.05），AB型個(gè)體與AA型個(gè)體的管圍、體高和胸圍等指標(biāo)差異不顯著（P＞0.05）。因此，可以初步推測(cè)PBDC1基因外顯子1的170bp處表現(xiàn)的多態(tài)性，可作為影響巴什拜羊生長(zhǎng)性狀的一種遺傳標(biāo)記。

4 結(jié)論

本研究采用PCR-SSCP和DNA測(cè)序技術(shù)對(duì)巴什拜羊A-FABP、PBDC1等基因進(jìn)行遺傳多態(tài)性檢測(cè)，并與巴什拜羊的生長(zhǎng)性狀進(jìn)行相關(guān)性分析，探尋可用于巴什拜羊早期選育的分子遺傳標(biāo)記，結(jié)論如下：（1）A-FABP基因外顯子2有多態(tài)性，存在2種基因型：GG和GA，測(cè)序結(jié)果顯示在A-FABP基因外顯子2的3159bp處存在G到A的突變，且該突變?yōu)橥x突變。巴什拜羊的不同基因型之間體長(zhǎng)、體重、胸圍等指標(biāo)差異顯著。巴什拜羊A-FABP基因外顯子2的3159bp處表現(xiàn)的多態(tài)有可能作為一種遺傳標(biāo)記。巴什拜羊A-FABP基因外顯子3經(jīng)多態(tài)性檢測(cè)未檢測(cè)到多態(tài)性。（2）PBDC1基因在第1外顯子的170bp處發(fā)生A堿基缺失，存在2種基因型：AA型和AB型，且AB型個(gè)體的體重和體長(zhǎng)均顯著高于AA型個(gè)體（P＜0.05），因此，可以初步推測(cè)PBDC1基因外顯子1的170bp處表現(xiàn)的多態(tài)性，可作為影響巴什拜羊生長(zhǎng)性狀的一種遺傳標(biāo)記。