林曉燕，牟仁祥，曹趙云，曹珍珍，周 蓉 ，許 萍，陳銘學(xué)*

（1.中國水稻研究所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部稻米及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心，杭州 310006；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部稻米產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實(shí)驗(yàn)室，杭州 310006）

化學(xué)農(nóng)藥和重金屬是兩類最為普遍的土壤環(huán)境污染物，在大多數(shù)地區(qū)往往同時存在[1]。其中，重金屬鎘是土壤中具有潛在危害的重要污染物，其污染程度越來越受到關(guān)注；農(nóng)藥污染中除草劑的污染尤為突出。丁草胺為氯代乙酰胺類除草劑，是目前我國用量最大的三大除草劑之一[2-3]。由于其具有用量大、水溶性高、土壤殘留期長的特點(diǎn)，不僅影響后茬作物的生長，還不可避免地造成生態(tài)環(huán)境的污染，因此，環(huán)境中丁草胺殘留已引起人們的廣泛關(guān)注。有研究表明，微生物降解是消除環(huán)境中丁草胺的主要方式。目前，關(guān)于丁草胺的微生物降解的報道較多，多數(shù)研究集中在降解菌的篩選、鑒定、降解特性、降解酶以及丁草胺代謝途徑的研究[4-5]。關(guān)于丁草胺降解菌株的蛋白質(zhì)組學(xué)研究較少，重金屬脅迫下的蛋白質(zhì)組學(xué)研究更是鮮見報道[6]。

近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，研究微生物在重金屬及農(nóng)藥脅迫生理的分子方面的報道越來越多。目前，研究發(fā)現(xiàn)重金屬、鹽脅迫、極端高溫或低溫、化學(xué)因子及紫外線等多種逆境因子均能影響蛋白質(zhì)的正常合成，同時能夠抑制（下調(diào)）或者促進(jìn)（上調(diào)）以及誘導(dǎo)新蛋白質(zhì)的合成與表達(dá)[7-10]。蛋白質(zhì)組學(xué)能夠從生物體或細(xì)胞的整體水平上研究蛋白質(zhì)的表達(dá)和修飾狀態(tài)，它比傳統(tǒng)研究微生物脅迫生物體生理生化變化更能夠深入闡明微生物降解污染物及對環(huán)境的適應(yīng)機(jī)制，對于揭示微生物對惡劣環(huán)境適應(yīng)能力的規(guī)律具有重要的意義。

本研究通過篩選獲得一株能耐受鎘并高效降解丁草胺的菌株，通過雙向電泳技術(shù)，比較雙向電泳圖譜差異，并對差異蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定及生物信息學(xué)分析，從而探討降解菌在鎘脅迫下蛋白表達(dá)的差異，以期從細(xì)菌的蛋白質(zhì)組學(xué)水平上闡明鎘脅迫下降解菌對丁草胺降解和對鎘耐受的分子機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備及試劑

分光光度儀（UV1800，美譜達(dá)儀器公司），純水裝置（摩爾公司），超聲細(xì)胞破碎儀（浙江新芝），IPGhor等電聚焦儀（GE Healthcare），DALT-SIX SDS-PAGE電泳儀（GE Healthcare），Ettan-DALT-Six系統(tǒng)水浴循環(huán)儀，ImageScanner掃描儀（GE Healthcare），PDquest分析軟件（Bio-Rad），4800 Plus MALDI TOF/TOFTM Analyzer（ABI）。

Immobiline TM DryStrip pH 3-10 NL，24 cm 和IPG Buffer pH 3-10 NL購自GE公司；Tris-base、Urea、Thiourea、3-[（3-膽酰胺丙基）-二乙胺]-丙磺酸（CHAPS）、二硫蘇糖醇（DTT）、溴酚藍(lán)、十二烷基磺酸鈉（SDS）、碘乙酰胺（IAA）、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨（APS）、TEMED、2-D電泳樣品提取緩沖液系列、甘氨酸（Gly）、低熔點(diǎn)瓊脂糖、乙醇、冰醋酸、2-D Equilibration Buffer以及非干擾型蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；CHCA購自Sigma公司；乙腈和三氟乙酸購自Merck公司；Mass Standards Kit for the 4700 Proteomics Ana?lyzer購自ABI公司。

1.2 供試菌株篩選及培養(yǎng)基配方

1.2.1 供試菌株篩選

5 g農(nóng)藥廠底層淤泥加入到含100 mg·L-1丁草胺的MM培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r·min-1振蕩培養(yǎng)7 d。以1%的接種量轉(zhuǎn)接到新鮮無機(jī)鹽（MM）培養(yǎng)基中，連續(xù)轉(zhuǎn)接3次（轉(zhuǎn)接培養(yǎng)基中丁草胺的濃度逐漸增大）。取200 μL菌懸液逐級稀釋并涂布在含200 mg·L-1丁草胺的MM平板上。待菌落長出后，挑選單菌落進(jìn)行劃線純化。純化獲得的菌落依次轉(zhuǎn)接到50 mL LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)到對數(shù)生長期時，轉(zhuǎn)接到50 mL含100 mg·L-1丁草胺的MM培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r·min-1振蕩培養(yǎng)3 d，測定丁草胺降解率。在此基礎(chǔ)上，篩選獲得優(yōu)勢丁草胺降解菌，并通過菌株純培養(yǎng)、提取總DNA、PCR擴(kuò)增及擴(kuò)增產(chǎn)物的序列測定，最終實(shí)現(xiàn)對篩選菌株的鑒定。

1.2.2 培養(yǎng)基配方

LB培養(yǎng)基：蛋白胨 10 g，酵母膏5 g，NaCl 10 g，加水定容到1 L，pH 7.0。固體加入1.5%的瓊脂。分裝滅菌后備用。

無機(jī)鹽（MM）培養(yǎng)基：NH3NO31.0 g，K2HPO41.5 g，KH2PO40.5 g，MgSO40.2 g，NaCl 1.0 g，加水定容到1 L，pH 7.0。分裝滅菌后備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計

將前期分離到的優(yōu)勢菌株在LB培養(yǎng)基中活化24 h后，分別以2%的接種量接種到50 mL含10 mg·L-1鎘的20 mg·L-1丁草胺的MM培養(yǎng)基及50 mL只含20 mg·L-1丁草胺的MM培養(yǎng)基（對照）中，37℃、150 r·min-1振蕩培養(yǎng)7 d后，離心收集菌體。處理和對照分別設(shè)置3個重復(fù)。

1.4 蛋白樣品的提取及定量

采用經(jīng)典的TCA/丙酮法進(jìn)行樣品中蛋白質(zhì)的提取。樣品制備方法：取菌體，加入適量蛋白裂解液；80～100 W超聲破碎3 min；4 ℃，2000 r·min-1離心 30 min，去除沉淀；加適量預(yù)冷TCA丙酮提取液（10%TCA丙酮溶液），適量的10 mol·L-1DTT使其終濃度為50 mmol·L-1，冰浴下高速勻漿1 min，-20 ℃沉淀過夜；4 ℃，12 000 r·min-1離心30 min；去除上清，沉淀中加入適當(dāng)預(yù)冷丙酮，輕輕混勻，4℃，12 000 r·min-1離心30 min，重復(fù)此步驟1～2次；將沉淀適當(dāng)晾干（不要特別的干燥），之后沉淀中加入適量蛋白裂解液溶解蛋白。

采用生工生物的非干擾型蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒（SK3071）進(jìn)行蛋白定量。

1.5 雙向電泳及凝膠圖像分析

委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行蛋白的雙向電泳及凝膠圖像分析。雙向電泳第一相等電聚焦（IEF）選用pH 3-10 NL IPG預(yù)制干膠條，蛋白上樣量是150 μg；第二相SDS-PAGE凝膠濃度為12.5%。電泳結(jié)束后，凝膠采用AgNO3染色法染色[11]。兩個樣品均設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，以獲得穩(wěn)定清晰的電泳圖譜。對脫色后凝膠進(jìn)行掃描（分辨率≥300 dpi），并使用PDquest 8.0軟件對圖像進(jìn)行分析。選取清晰、沒有重疊的各個單一蛋白質(zhì)點(diǎn)作為有效蛋白質(zhì)點(diǎn)，并將表達(dá)量倍數(shù)變化＞2或者＜0.5的蛋白質(zhì)點(diǎn)確定為差異蛋白質(zhì)點(diǎn)。

1.6 質(zhì)譜鑒定樣品制備及質(zhì)譜分析

1.6.1 膠內(nèi)酶解及Ziptip脫鹽

從凝膠上小心切下存在差異的蛋白質(zhì)點(diǎn)，進(jìn)行脫色凍干，加入5 μL 2.5～10 ng·μL-1測序級Trypsin（Pro?mega）溶液[酶與蛋白質(zhì)量比為1∶（20～100）]，37 ℃反應(yīng)過夜進(jìn)行膠內(nèi)酶解；再用Ziptip（millipore）進(jìn)行脫鹽。

1.6.2 MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析

脫鹽后樣品委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行蛋白點(diǎn)MALDI-TOF-MS質(zhì)譜鑒定。取酶解樣品2 μL，加20%乙腈復(fù)溶；取1 μL樣品，點(diǎn)于樣品靶上，讓溶劑自然干燥；取0.5 μL過飽和CHCA基質(zhì)溶液（溶劑為50%ACN，0.1%TFA）點(diǎn)至對應(yīng)靶位上并自然干燥；樣品靶經(jīng)氮?dú)獯祪艉蠓湃雰x器進(jìn)靶槽，進(jìn)行質(zhì)譜分析：激光源為355 nm波長的Nd：YAG激光器，加速電壓為2 kV，采用正離子模式和自動獲取數(shù)據(jù)的模式采集數(shù)據(jù)，PMF質(zhì)量掃描范圍為800～4000 Da，選擇信噪比大于50的母離子進(jìn)行二級質(zhì)譜（MS/MS）分析，每個樣品點(diǎn)上選擇8個母離子，二級MS/MS激光激發(fā)2500次，碰撞能量2 kV，CID關(guān)閉。

1.7 蛋白數(shù)據(jù)庫檢索及生物信息學(xué)分析

將獲得的蛋白肽質(zhì)量指紋圖譜（PMF），輸入到Mascot網(wǎng)站（http：//www.matrixscience.com/）蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，搜索與PMF相匹配的蛋白質(zhì)，并完成功能查詢，從而實(shí)現(xiàn)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的鑒定。檢索參數(shù)設(shè)置如下：Database設(shè)置為NCBInr；Taxonomy設(shè)置為Bacteria；Enzyme設(shè)置為Trypsin；Fixed Modification設(shè)置為Carbamidomethyl（C）；Variable modifications設(shè)置為Acetyl（Protein N-term），Deamidated（NQ），Dioxida?tion（W），Oxidation（M）；Missed cleavages設(shè)置為Allow up to one；Peptide mass tolerance設(shè)置為±100 mg·L-1；Fragment Mass Tolerance設(shè)置為±0.2 Da；Mass values設(shè)置為Monoisotopic。MASCOT分析中P＜0.05時，認(rèn)為蛋白鑒定結(jié)果可信。差異蛋白按照2-D電泳圖譜上的差異點(diǎn)編號、蛋白編號、蛋白名稱、所屬物種、等電點(diǎn)、分子量、覆蓋度、得分、肽段匹配數(shù)及比值等進(jìn)行整理，并進(jìn)行GO功能分析和COG功能分析，從中獲得一些感興趣的重要蛋白。

2 結(jié)果與分析

2.1 嗜溫鞘氨醇桿菌的分離鑒定

通過1.2.1中菌株的篩選獲得多株能夠耐受200 mg·L-1丁草胺菌株的純培養(yǎng)，進(jìn)一步通過丁草胺降解實(shí)驗(yàn)，最終獲得一株丁草胺高效降解菌，編號為15#。通過將15#菌株進(jìn)行純培養(yǎng)、提取菌株總DNA、16S rDNA的PCR擴(kuò)增及將擴(kuò)增產(chǎn)物送到生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行序列測定，測定結(jié)果（1437 bp）在 NCBI網(wǎng)站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）上進(jìn)行BLAST比對，該菌株與革蘭氏陰性桿菌——嗜溫鞘氨醇桿菌屬菌株（Sphingobacterium thalpophilum strain S8SF4）的同源性為99%，最終將篩選到的菌株15#鑒定為嗜溫鞘氨醇桿菌屬菌株（Sphingobacterium thalpophilum sp.），GeneBank 登錄號KJ452209。

2.2 雙向電泳圖譜分析

雙向電泳后的凝膠圖進(jìn)行圖像采集后，利用PD?Quest 8.0圖像分析軟件對凝膠圖像進(jìn)行差異比對分析，每個處理的3塊膠圖分別來自于3個獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)試驗(yàn)。只有那些重復(fù)性好（3塊膠上均出現(xiàn)）、蛋白的豐度比即差異倍數(shù)＞2或者＜0.5，且經(jīng)統(tǒng)計檢驗(yàn)P-value＜0.05的顯著性差異的蛋白點(diǎn)才可以認(rèn)定為差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)。通過只加丁草胺和丁草胺-鎘復(fù)合處理組之間的差異比對分析，共鑒定到差異表達(dá)蛋白點(diǎn)93個（圖1），其中上調(diào)蛋白共49個，占差異蛋白總數(shù)的52.7%，下調(diào)蛋白44個，占差異蛋白總數(shù)的47.3%。

2.3 差異蛋白點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定

分析2個處理2-D圖譜共得到差異蛋白質(zhì)點(diǎn)93個，分別將選出的23個重復(fù)性好且最為明顯的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)從凝膠上取下，經(jīng)胰蛋白酶膠內(nèi)酶解消化后，利用MALDI-TOF-MS技術(shù)對其進(jìn)行質(zhì)譜檢測，質(zhì)譜檢測得到的肽質(zhì)量指紋圖譜（PMF）數(shù)據(jù)和二級質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)結(jié)合形成混合譜，再用Mascot（http：//www.matrixscience.com/）軟件對數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索。結(jié)果顯示，在23個重復(fù)性好且最為明顯的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)中，成功鑒定出15個差異蛋白點(diǎn)，其中上調(diào)蛋白8個，占差異蛋白的53.3%，均為鎘脅迫下蛋白表達(dá)量明顯增加的蛋白，下調(diào)蛋白7個，占差異蛋白的46.7%，均為鎘脅迫下蛋白表達(dá)量明顯減少的蛋白，相關(guān)信息見表1。對于鑒定到的蛋白，可以通過NCBI數(shù)據(jù)庫和Uni?Prot數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）進(jìn)一步查詢，也可以通過 BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）比對得到同源或功能相似的蛋白，從而進(jìn)行后續(xù)的生物信息學(xué)分析。

2.4 蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量（MW）和等電點(diǎn)（pI）的分布

蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量（MW）和等電點(diǎn)（pI）含有生物學(xué)與病理學(xué)中生物標(biāo)記物和信號分子的重要信息，所以在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量（MW）和等電點(diǎn)（pI）分布引起廣泛關(guān)注。成功鑒定的15個差異蛋白點(diǎn)，其等電點(diǎn)（PI）和分子量變化如圖2所示。等電點(diǎn)在3～4之間沒有蛋白點(diǎn)的分布，等電點(diǎn)在6～7之間的蛋白數(shù)目最多（5個），占鑒定到的差異蛋白總量的33.3%；等電點(diǎn)在7～8之間的蛋白數(shù)目最少（1個），占總蛋白的6.7%；等電點(diǎn)在4～5與5～6區(qū)段的蛋白數(shù)目和9～10區(qū)段的蛋白數(shù)目一致，均為2個，占總蛋白的13.3%。差異蛋白分子量分布差別較大，差異蛋白主要集中在分子量范圍為10 kDa～20 kDa之間的區(qū)間，該區(qū)間蛋白數(shù)量為8個，占鑒定到的差異蛋白總量的53.3%，其他分子量區(qū)間差異蛋白數(shù)量均很少，其中分子量在30 kDa～40 kDa之間差異蛋白數(shù)為2個，占總差異蛋白總數(shù)的13.3%，其他區(qū)段差異蛋白數(shù)均為1個，分別占總差異蛋白的6.7%。

圖1 鎘脅迫下丁草胺降解菌總蛋白的雙向電泳圖譜Figure 1 2-D electrophoresis of protein extracted from butachlor-degradation bacteria under cadmium stress

表1 差異蛋白點(diǎn)的鑒定結(jié)果Table 1 Identification of the differential protein points

圖2 差異蛋白等電點(diǎn)和分子量分布Figure 2 Isoelectric point and molecular weight distribution of difference proteins

2.5 差異蛋白的生物信息學(xué)分析

Gene Ontology（簡稱GO）已經(jīng)成為生物信息領(lǐng)域中一個極為重要的方法和工具。本文針對鑒定出的所有蛋白進(jìn)行了GO功能注釋分析（圖3）。由圖3可以看出，這15個差異表達(dá)蛋白參與了4個生物學(xué)過程，分別為代謝過程（40%）、生物合成過程（33.3%）、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)（13.3%）和蛋白折疊等細(xì)胞過程（20%）；細(xì)胞組分類別分析發(fā)現(xiàn)，這15個差異表達(dá)蛋白可以定位到細(xì)胞膜、細(xì)胞周質(zhì)間隙、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞外膜等，其中能夠定位到細(xì)胞和細(xì)胞膜的差異表達(dá)蛋白所占比例分別為53.3%和40%，兩者所占的比例之和為93.3%；分子功能類別共分為4個亞類，其中催化和結(jié)合亞類所占比例最高，均占差異表達(dá)蛋白的40%，轉(zhuǎn)移活性和電子載體活動分別為13.3%和6.7%。

為了更加深入地了解鑒定到的差異蛋白的生物學(xué)功能，我們還對所鑒定到的15個差異表達(dá)蛋白通過NCBI網(wǎng)站中的BLAST與COG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，得到相應(yīng)的注釋結(jié)果，從而進(jìn)行蛋白相鄰類的聚簇（Cluster of orthologous groups of proteins，簡稱COG）功能分類（圖4）。由圖4可見，15個差異蛋白按功能分為E、M、U、I、C、J、R、P、O和 S共10組，分別為氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、細(xì)胞壁/膜/生物起源、細(xì)胞內(nèi)的販運(yùn)、分泌和囊泡運(yùn)輸、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、能量產(chǎn)生和轉(zhuǎn)換、翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物遺傳、通用功能預(yù)測、無機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、翻譯后修飾、蛋白轉(zhuǎn)角和伴侶功能以及未知功能。其中，具有能量產(chǎn)生和轉(zhuǎn)換功能的蛋白最多，占差異表達(dá)蛋白總量的20%；其次為脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、通用功能預(yù)測、翻譯后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化和伴侶功能的蛋白，分別占差異表達(dá)蛋白總量的13.3%；這4類蛋白數(shù)量占有COG注釋蛋白數(shù)量的60%。

3 討論

圖3 差異蛋白表達(dá)的GO分析（包括分子功能、細(xì)胞組成和生物過程）Figure 3 The GO enrichment analysis of differences expressed proteins（molecular function；cell component；biological process）

圖4 差異蛋白點(diǎn)的COG注釋圖Figure 4 COG annotation diagram of the differential protein points

與傳統(tǒng)的研究微生物脅迫的生理生化變化相比，蛋白質(zhì)組學(xué)從生物體或者細(xì)胞的整體水平上研究蛋白質(zhì)在脅迫情況下的表達(dá)和修飾狀態(tài)，能夠從更深層次揭示微生物對環(huán)境的適應(yīng)機(jī)制，具有重要的理論意義。本文采用雙向電泳這一經(jīng)典技術(shù)研究了鎘脅迫下丁草胺降解菌降解丁草胺的蛋白質(zhì)組學(xué)研究。通過前期的篩選，我們獲得了一株能夠高效降解丁草胺的嗜溫鞘氨醇桿菌菌株（Sphingobacterium thalpophi?lum sp.），該菌在丁草胺降解試驗(yàn)中表現(xiàn)優(yōu)異（結(jié)果未在本文列出）。通過只加丁草胺處理和丁草胺-鎘復(fù)合處理組之間的2D電泳圖譜進(jìn)行差異比對分析，我們共鑒定到差異表達(dá)蛋白點(diǎn)93個（圖1），其中上調(diào)蛋白共49個，均是在鎘脅迫下通過誘導(dǎo)表達(dá)從而導(dǎo)致蛋白含量增加；93個差異蛋白點(diǎn)中，鑒定到的下調(diào)蛋白共44個，均在只加丁草胺處理的2D電泳膠圖上較為明顯，說明在鎘的脅迫下這些蛋白的表達(dá)受到一定程度的抑制。為了進(jìn)一步明確差異蛋白的性質(zhì)，對差異蛋白進(jìn)行了質(zhì)譜分析。由表2也可以看出，丁草胺單獨(dú)處理及丁草胺-鎘復(fù)合處理的樣品經(jīng)質(zhì)譜鑒定到的差異蛋白表達(dá)水平有上調(diào)也有下調(diào)，其中8個蛋白在丁草胺-鎘復(fù)合處理后的菌株中表現(xiàn)上調(diào)，7個蛋白在加鎘處理后的菌株中表達(dá)量下降。但是鑒定到的這15個蛋白不論是表達(dá)量增加還是減少，在鎘脅迫下依然能夠顯著表達(dá)，說明這些差異蛋白同時也是鎘耐受蛋白。這與Silver[12]所報道的細(xì)菌中存在多種抗金屬的基因，當(dāng)受到外界重金屬脅迫時，能夠編碼對金屬產(chǎn)生耐性的蛋白的結(jié)論相吻合。

本文分別對鑒定到的15個差異蛋白分別進(jìn)行了GO功能注釋分析和COG功能分類。本文中鑒定到的位于細(xì)胞質(zhì)中差異點(diǎn)編號為30和5017的co-chap?eroneGroES（蛋白編號為A0A0M7GIQ5和A0A255QDH8）以及差異點(diǎn)編號為5016的無機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白copper chaperone PCu（A）C蛋白分別屬于分子伴侶蛋白的一種，在鎘脅迫下其表達(dá)量明顯上調(diào)（分別是只加丁草胺處理的蛋白表達(dá)量的9.28、8.33倍和11.62倍）。其中，兩種co-chaperone GroES蛋白能夠在Mg-ATP的作用下輔助位于質(zhì)體的伴侶蛋白Cpn60與底物的結(jié)合并抑制ATP酶活性。Copper chaperone PCu（A）C蛋白經(jīng)功能分析后發(fā)現(xiàn)，該蛋白主要參與無機(jī)離子的轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝，因此，加鎘處理菌株中該蛋白表達(dá)上調(diào)。有研究表明，分子伴侶蛋白往往具有多種功能，如脅迫保護(hù)防止交聯(lián)聚沉，轉(zhuǎn)運(yùn)，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，組裝細(xì)胞骨架，通常是在應(yīng)激反應(yīng)情況下產(chǎn)生的。近年來的研究表明在正常生長條件下，這類蛋白仍少量存在，對蛋白跨膜運(yùn)輸，結(jié)構(gòu)折疊也有重要作用。當(dāng)受到重金屬脅迫時，該類蛋白表達(dá)量會增加，過量表達(dá)水平與脅迫程度呈正相關(guān)[13]。微生物在長期的進(jìn)化過程中，形成了自己獨(dú)特的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)以響應(yīng)外界環(huán)境的脅迫，從而產(chǎn)生了一些響應(yīng)脅迫的蛋白質(zhì)。在鑒定到的所有上調(diào)蛋白中，相對于單獨(dú)丁草胺處理，加鎘處理后上調(diào)幅度最大的為光合系統(tǒng)Ⅰ葉綠體脫輔基蛋白PSⅠP700（差異點(diǎn)編號為9012，蛋 白 編 號 為 A0A0M7HIV1，差 異 倍 數(shù) 為149.08），GO功能注釋分析發(fā)現(xiàn)該蛋白為一種外膜蛋白，分子功能為氧化脅迫的信號肽，結(jié)合COG功能分類分析推測該蛋白在鎘由細(xì)胞外向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)過程中起了關(guān)鍵作用，是菌株響應(yīng)鎘脅迫的敏感蛋白，與菌株抗鎘密切相關(guān)。在鑒定到的上調(diào)蛋白中，還有一個在鎘脅迫后蛋白表達(dá)量顯著增加，且增加程度僅次于光合系統(tǒng)Ⅰ葉綠體脫輔基蛋白PSⅠP700的蛋白（蛋白編號為A0A0D6IIE6，差異點(diǎn)編號為9011），該蛋白為功能未知蛋白，在鎘存在時其表達(dá)水平是單一丁草胺處理菌株中的77.67倍，推測鎘的存在刺激了該蛋白的表達(dá)，說明該蛋白與菌株抗鎘之間存在著某種密切聯(lián)系，該蛋白同樣作為鎘脅迫的敏感蛋白，也是值得我們深入研究的蛋白之一。

差異點(diǎn)編號為8515的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（蛋白編號為A0A0D6IPR6）主要參與降解菌株對丁草胺的代謝，鎘脅迫情況下該蛋白的表達(dá)水平為下調(diào)，說明降解菌株對丁草胺的代謝受到一定程度的抑制。該結(jié)論與王金花[14]的推測相一致。GMC氧化還原酶廣泛存在于原核生物和真核生物中，主要作用是參與碳水化合物的代謝。差異點(diǎn)編號為7807的GMC氧化還原酶蛋白（蛋白編號為A0A0D6IPR6）在處理中也表現(xiàn)為下調(diào)，同樣說明鎘脅迫下鈣蛋白的表達(dá)受到一定程度的抑制。

另外，在GO分析和COG分析中，我們還發(fā)現(xiàn)，所有參與代謝的蛋白中大多數(shù)蛋白在鎘脅迫下均表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)，只有蛋白編號為D4FMF4的蛋白為嗜熱家族（PfpI）蛋白（差一點(diǎn)編號為108）表現(xiàn)為上調(diào)，說明該蛋白能夠在鎘脅迫下抗鎘的同時參與丁草胺的代謝。通過查閱文獻(xiàn)，我們發(fā)現(xiàn)該類蛋白具有多種生物學(xué)功能，最典型的就是抗氧化應(yīng)激功能，隨著氧化應(yīng)激的積累，該蛋白對氧化應(yīng)激的敏感性隨之增高，從而蛋白表達(dá)水平上調(diào)。關(guān)于其抗氧化的機(jī)制，相關(guān)研究表明有以下幾種方式：自身構(gòu)型改變、分子伴侶作用、通過保護(hù)線粒體功能抵抗氧化應(yīng)激以及調(diào)控抗氧化應(yīng)激相關(guān)基因等[15]。該蛋白以及其抗氧化機(jī)制也是一個非常值得深入研究的課題。

4 結(jié)論

（1）篩選到一株鎘脅迫下丁草胺高效降解菌株15#，經(jīng)16S rDNA基因測序及序列比對分析，該菌株鑒定為革蘭氏陰性桿菌——嗜溫鞘氨醇桿菌（Sphin?gobacterium thalpophilum sp.），GeneBank登錄號KJ452209。

（2）通過不同處理間的雙向電泳圖譜差異比對分析，共鑒定到差異表達(dá)蛋白點(diǎn)93個，其中上調(diào)蛋白49個，下調(diào)蛋白44個。在重復(fù)性好且差異最為明顯的23個蛋白質(zhì)點(diǎn)中，利用MALDI-TOF-MS技術(shù)成功鑒定出15個差異蛋白，其中8個為上調(diào)蛋白，7個為下調(diào)蛋白，且這些蛋白的等電點(diǎn)主要分布在6～7之間，分子量范圍主要集中在10 kDa～20 kDa之間的區(qū)間。

（3）鑒定到的15個蛋白在鎘處理下均能顯著表達(dá)，說明這些差異蛋白同時也是鎘耐受蛋白。這15個蛋白總共分為兩大類，一類為參與丁草胺代謝的蛋白，另一類為響應(yīng)鎘脅迫敏感蛋白及在抗鎘情況下參與丁草胺代謝的蛋白。

（4）分析發(fā)現(xiàn)，鎘脅迫下上調(diào)幅度最大的兩個敏感蛋白（蛋白編號分別為A0A0M7HIV1和A0A0D6IIE6）以及抗鎘脅迫的同時參與丁草胺代謝的蛋白（蛋白編號為D4FMF4），均為今后延續(xù)性研究中需要重點(diǎn)研究的三個蛋白。