張麗麗 李 雁

（黑龍江省中醫(yī)藥科學院，黑龍江 哈爾濱 150036）

冠心病是冠狀動脈粥樣硬化使血管狹窄或阻塞，從而導致心肌缺血缺氧或心肌壞死的臨床綜合證［1-2］。本病多發(fā)于50歲以上人群，男性多于女性，病理基礎是由于冠狀動脈粥樣硬化或斑塊不穩(wěn)定，使血流減少，出現(xiàn)心肌缺血為主要特征的臨床綜合征，它涵蓋了從不穩(wěn)定心絞痛到ST段抬高性心肌梗死和心肌缺血所致心臟性猝死的一系列臨床急癥［3］。中醫(yī)學認為冠心病屬于“真心痛”“胸痹”“胸痛”范疇，是痰濁血瘀證的起始階段，由于津血同源，痰瘀相關；痰可致瘀，痰常夾瘀。津、血均為水谷精微化生而來，津液凝煉化濁可變?yōu)樘?，血液運行不暢可化為瘀；飲食失調(diào)，脾胃損傷，運化失司，導致濕濁內(nèi)生，濕濁久聚生痰。痰濁又可阻滯氣機，致脈絡不通，氣血運行不暢，引發(fā)血瘀［4］。因此，心肌缺血是痰濁血瘀的早期階段。心肌缺血再灌注中凋亡的發(fā)生是導致心肌損傷的重要機制之一［5］。心梗后細胞凋亡使心肌細胞數(shù)量持續(xù)減少，膠原支架斷裂，心肌細胞代償性肥大，心室壁變厚、擴張，心功能障礙，最終導致心力衰竭。B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）是細胞凋亡基因的調(diào)控者，以線粒體為調(diào)控凋亡單位，Bcl-2為抗調(diào)蛋白，其同源二聚體X蛋白（Bax）為促凋亡蛋白，Bcl-2/bax的比例常被衡量凋亡水平［6］。當Bcl-2/Bax基因表達降低時，線粒體通透性改變，進而細胞色素釋放，凋亡誘導因子等可溶性膜間隙蛋白被釋放，Survivin表達水平降低，啟動Caspase級聯(lián)反應和不依賴Caspase途徑的方式參與凋亡的發(fā)生［7］。加味溫膽方出自《醫(yī)宗金鑒》，由半夏、陳皮、茯苓、甘草、膽南星、竹茹、蒼術、延胡索、丹參、川芎、赤芍、牛膝、黃芪、節(jié)菖蒲組成，具有降低心肌耗氧量、舒張外周血管阻力的功效，具有化痰、祛除痰飲、解郁散結 、止痛消炎的療效，同時還能改善缺血心肌氧的供求平衡，提高心肌作功效率［8］。本研究擬探討加味溫膽方對心肌缺血（痰濁血瘀證）大鼠細胞凋亡及 Bcl-2、Bax、Survivin、Caspase-3蛋白及基因表達的影響，為心肌缺血（痰濁血瘀證）的治療提供理論及臨床依據(jù)?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級SD雄性大鼠100只，體質(zhì)量（234.76±11.03）g，黑龍江省中醫(yī)藥科學院實驗動物中心提供，許可證號：SYXK（黑）2016-0009。動物自由攝取飼料、自由飲水，自動控制晝夜循環(huán)（12/12 h），室溫（26.0±3.0）℃。每周稱質(zhì)量1次。

1.2 儀器及試劑 加味溫膽方組成：由半夏12 g，陳皮 20 g，茯苓 20 g，甘草 10 g，膽南星 15 g，竹茹 20 g，蒼術 15 g，延胡索 20 g，丹參 20 g，川芎 20 g，赤芍15 g，牛膝 15 g，黃芪 30 g，節(jié)菖蒲 15 g。由黑龍江省中醫(yī)藥科學院制劑室加工而成，制作工藝為標準制干浸膏，每克干浸膏相當于生藥8.62 g；根據(jù)成人劑量公式換算，大鼠用藥量為成人的13.14倍，將藥粉溶入蒸餾水，以10.0 mL/kg體質(zhì)量灌胃，將藥液濃度配制成為 10.0 g/mL。 Bcl-2、Bax、Survivin、Caspase-3 Elisa試劑盒（規(guī)格為96反應單位，編號kit09874、kit32942、kit87643）購自上海邦奕生物科技有限公司；Bcl-2、Bax、Survivin、Caspase-3（規(guī)格為 10 mL，編號 45098、34509、23489、10987、09876、43098、54091、09765）一抗、二抗購自上海信帆生物科技有限公司；DAB顯色試劑盒（規(guī)格為5mL，編號9098）、熱電MK3酶標儀均購自南京森貝伽生物科技有限公司；Qiagen 205311逆轉錄試劑盒、ABI：4472908染料法實時熒光定量試劑盒、購自寶生物工程（大連）有限公司；實時熒光定量Bio-Rad PCR FX653儀購自美國BIO-RAD公司。

1.3 分組與造模 根據(jù)體質(zhì)量隨機分為5組：空白組、模型組、加味溫膽方低劑量組（5.0 mg/kg）、加味溫膽方中劑量組 （10.0 mg/kg）、加味溫膽方高劑量組（20.0 mg/kg），每組20只?？瞻捉M普通飼料喂養(yǎng)，每日0.9%氯化鈉注射液灌胃。模型組、加味溫膽方各劑量組高脂飼料配方（膽固醇1%，蛋黃粉15%，豬油15%，基礎飼料69%）。模型組每日0.9%氯化鈉注射液灌胃；根據(jù)預試驗獲得大鼠加味溫膽方的藥物半數(shù)有效量（ED）約為800 mg/kg，取大鼠加味溫膽方ED的1/4（20.0 mg/kg）、1/8（10.0 mg/kg）、1/16（5.0 mg/kg）作為加味溫膽方高劑量組、加味溫膽方中劑量組、加味溫膽方低劑量組，連續(xù)灌胃7周，每周記錄體質(zhì)量，調(diào)節(jié)并維持給藥量；在第49天施冠狀動脈結扎術，麻醉后開胸，暴露心臟，于冠狀動脈左前降支完全結扎，心電圖監(jiān)測，以ST段弓背向上抬高評價結扎是否成功。

1.4 標本采集與檢測 1）大鼠心肌凋亡細胞檢測。試驗結束后，頸椎脫臼處死大鼠，取心臟組織（剩余心臟組織-80℃冰箱保存），進行常規(guī)染色切片，末端脫氧核苷酸轉移酶（TdT酶）介導的帶熒光的dUTP缺口末端標記法（TUNEL）檢測心肌凋亡細胞；MOTIC IMAGES AOVANCED3.2圖像分析系統(tǒng)檢測的平均光密度和目標總面積。2）免疫組化法測定Bcl-2、Bax、Survivin、Caspase-3蛋白在心臟中的表達。5 μm的石蠟組織切片脫蠟，0.1 mol/L檸檬酸修復抗原，室溫5 min后，3%的H2O2液常溫阻斷內(nèi)源性過氧化氫酶活性30 min，微波修復抗原，PBS 常規(guī)沖洗，1%的 Bcl-2、Bax、Survivin、Caspase-3 抗體工作液（稀釋濃度 1∶200），4 ℃過夜，加入二抗（IgG），室溫60 min，加鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木素復染，（40%、60%、80%、90%、95%、100%）梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片。 Bcl-2、Bax、Survivin、Caspase-3 蛋白主要定于細胞核，呈棕黃色。3）大鼠心臟Bcl-2、Bax、Survivin、Caspase-3蛋白及mRNA表達的檢測。將保存在-80℃冰箱中的心臟組織取出解凍。稱取0.2 g心臟組織，加入少量液氮，在微波碾磨儀（5000 r/s）中迅速將其碾碎至粉末狀；將組織粉末轉入1 mL Eppendorf管中，加入 1.2 mL PBS（pH7.4），充分振蕩混勻，2 000 g，4℃，離心20 min。仔細收集上清液。獲取心臟組織勻漿后，采用ELISA法檢測心臟組織中的Bcl-2、Bax、Survivin、Caspase-3蛋白表達量。提取心臟組織總RNA并檢測RNA純度和濃度。UltraSYBR One Step RNA PCR Kit說明對待測基因進行Real-time PCR反應。引物序列及RT-PCR反應體系見表1，表2。

表1 Bcl-2、Bax、Survivin、Caspase-3 引物序列

表2 RT-PCR反應體系

1.5 統(tǒng)計學處理 應用Epidata、SPSS19.0統(tǒng)計軟件。凋亡光密度及面積、Bcl-2、Bax、Survivin、Caspase-3 蛋白及mRNA表達以（±s）表示，分析前進行正態(tài)檢驗，若滿足正態(tài)性，采用LSD-t兩兩檢驗，若不滿足正態(tài)性，數(shù)據(jù)轉換后再進行LSD-t兩兩檢驗，檢驗水準α為0.05。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠心肌病理組織比較 見圖1?？瞻捉M心肌纖維排列整齊，間質(zhì)血管無改變，未見心肌細胞變性、壞死。模型組心肌纖維波浪樣改變、斷裂，心肌細胞肥大，空泡變性。加味溫膽方低劑量組見心肌纖維波浪樣改變較強，心肌細胞空泡變性。加味溫膽方中劑量組見心肌纖維中等程度波浪樣改變，心肌細胞中度肥大。加味溫膽方高劑量組心肌纖維排列紊亂輕微，未見心肌斷裂，心肌細胞輕度肥大。

圖1 各組大鼠心肌病理組織比較（HE染色，200倍）

2.2 各組大鼠心肌細胞凋亡光密度及面積比較 見表3，圖2。與空白組比較，模型組及加味溫膽方組各劑量大鼠心肌細胞凋亡光密度及面積均升高（P<0.05）；與模型組比較，加味溫膽方組各劑量大鼠心肌細胞凋亡光密度及面積均降低，且隨著加味溫膽方組給藥劑量的增加，凋亡光密度及面積逐漸下降，劑量-效應關系明顯（P<0.05）。正常細胞核染藍色，凋亡細胞核呈棕色，各組心肌凋亡數(shù)目與凋亡光密度及面積符合。

表3 各組大鼠心肌細胞凋亡光密度及面積比較（±s）

表3 各組大鼠心肌細胞凋亡光密度及面積比較（±s）

與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與加味溫膽方低劑量組組比較，▲P＜0.05；與加味溫膽方中劑量組組比較，＃P＜0.05。下同

組 別 n 光密度 面積（μ m 2）空白組 2 0 0.2 8 2 9±0.1 3 4 9 3.1 6 6 4±0.1 3 5 6模型組 2 0 0.3 8 5 9±0.1 7 3 6* 1 2.3 3 1 1±1.3 0 0 1*加味溫膽方低劑量組 2 0 0.3 5 7 5±0.1 1 0 5*△ 8.9 3 4 7±0.1 8 9 1*△加味溫膽方中劑量組 2 0 0.3 3 7 3±0.0 0 9 8*△▲ 6.8 1 3 5±0.1 9 3 4*△▲加味溫膽方高劑量組 2 0 0.3 0 1 4±0.0 0 7 8*△▲＃ 4.4 3 3 1±0.1 7 7 6*△▲＃

圖2 各組大鼠心肌細胞凋亡情況（TUNEL染色，400倍）

2.3 各組大鼠 Bcl-2、Bax、Survivin、Caspase-3 蛋白表達水平的比較 見表4，圖3～6。與空白組比較，模型組及加味溫膽方組各劑量BCL-2、Survivin降低，Bax、Caspase-3升高（P<0.05）；與模型組比較，加味溫膽方組各劑量組 Bcl-2、Survivin 升高，Bax、Caspase-3 降低，且隨著加味溫膽方組給藥劑量的增加，Bcl-2、Survivin逐漸升高，Bax、Caspase-3逐漸降低，劑量-效應關系明顯 （P<0.05）。 免疫組化法下，Bcl-2、Bax、Survivin、Caspase-3 陽性表達為棕褐色，各組 Bcl-2、Bax、Survivin、Caspase-3陽性表達情況與個蛋白表達水平符合。

表4 各組大鼠Bcl-2、Bax、Survivin、Caspase-3蛋白表達水平比較（ng/g，±s）

表4 各組大鼠Bcl-2、Bax、Survivin、Caspase-3蛋白表達水平比較（ng/g，±s）

組 別 n空白組 2 0模型組 2 0加味溫膽方低劑量組 2 0 B c l-2 B a x S u r v i v i n C a s p a s e-3 1 8 3.6 7±1 5.6 3 1 3 9.4 6±5.5 7 1 4 5.7 7±6.4 6 4 7.1 3±1 5.9 5 7 1.1 4±1 6.7 8* 1 7 9.7 5±7.3 7* 6 7.8 6±6.9 8* 1 8 7.6 6±9.4 7*1 0 3.7 3±1 3.6 5*△ 1 6 9.3 5±8.8 8*△ 8 9.4 5±6.9 8*△ 1 3 4.1 4±1 2.7 4*△加味溫膽方中劑量組 2 0 1 2 3.1 7±9 9.6 9*△▲ 1 4 6.3 1±1 2.7 6*△▲ 1 2 0.1 5±1 0.6 9*△▲ 6 3.2 3±1 0.7 3*△▲加味溫膽方高劑量組 2 0 1 5 2.5 8±1 3.7 4*△▲＃ 1 4 2.8 1±9.6 0*△▲＃ 1 3 7.6 3±1 2.7 3*△▲＃ 5 7.4 5±8.7 6*△▲＃

圖3 各組大鼠心臟Bcl-2表達情況（免疫組化染色，400倍）

圖4 各組大鼠心臟Bax表達情況（免疫組化染色，400倍）

2.4 各組大鼠 Bcl-2、Bax、Survivin、Caspase-3 mRNA表達水平的比較 見表5。與空白組比較，模型組及加味溫膽方組各劑量Bcl-2、Survivin mRNA降低，Bax、Caspase-3 mRNA升高（P<0.05）；與模型組比較，加味溫膽方組各劑量組Bcl-2、Survivin mRNA升高，Bax、Caspase-3 mRNA降低，且隨著加味溫膽方組給藥劑量的 增 加 ，Bcl-2、Survivin mRNA 逐 漸 升 高 ，Bax、Caspase-3 mRNA逐漸降低，劑量-效應關系明顯（P<0.05）。

圖5 各組大鼠心臟Survivin表達情況（免疫組化染色，400倍）

圖6 各組大鼠心臟Caspase-3表達情況（免疫組化染色，400倍）

表5 各組大鼠 Bcl-2、Bax、Survivin、Caspase-3 mRNA 表達水平比較（ng/g，±s）

組 別 n空白組 2 0模型組 2 0加味溫膽方低劑量組 2 0 B c l-2 B a x S u r v i v i n C a s p a s e-3 m R N A 1.9 4±0.1 1 1.4 5±0.1 3 1.7 6±0.1 7 1.1 3±0.2 1 0.5 6±0.1 3* 2.1 3±0.1 9* 0.9 8±0.1 2* 2.1 8±0.1 9*0.9 1±0.1 8*△ 1.8 7±0.1 4*△ 1.0 9±0.1 7*△ 1.8 7±0.1 8*△加味溫膽方中劑量組 2 0 1.4 9±0.2 0*△▲ 1.6 9±0.2 1*△▲ 1.1 2±0.1 6*△▲ 1.5 2±0.0 9*△▲加味溫膽方高劑量組 2 0 1.7 2±0.1 1*△▲＃1.5 9±0.1 0*△▲＃1.4 2±0.2 0*△▲＃ 1.3 2±0.1 0*△▲＃

3 討 論

研究報道，2013年我國心肌缺血（痰濁血瘀證）患病率為414/10萬，患者總人數(shù)高達120萬人，而絕大部分患者（約72%～79%）出現(xiàn)不同心肌收縮、舒張功能障礙，繼發(fā)引起輸出量不足，患者3年內(nèi)的生存率極低，則患者生存期中位數(shù)約為4.8年，因此對心肌缺血（痰濁血瘀證）發(fā)病機制及藥物干預的研究尤為重要［9-10］。

凋亡的心肌細胞在細胞外降解，被巨噬細胞和鄰近細胞吞噬，因此，凋亡在調(diào)節(jié)細胞和組織構造方面具有重要作用。在動物實驗中已經(jīng)證實，應用抗凋亡藥物、細胞因子或采用基因治療可減輕心肌缺血再灌注損傷。心肌細胞凋亡被認為是心肌缺血痰濁血瘀證發(fā)病過程中的重要環(huán)節(jié)，其與一系列凋亡因子、抗凋亡因子的紊亂表達密切相關［11］。 Bcl-2、Bax是調(diào)節(jié)心肌細胞凋亡的重要調(diào)控因子，Bcl-2是抑制細胞凋亡蛋白，Bax是促進細胞凋亡蛋白。Bcl-2和Bax可通過化學氫鍵彼此形成異二聚體或與同源二聚體，Bcl-2和Bax兩者蛋白基因表達水平比例的多少是決定細胞是否凋亡的重要因素。在細胞中，當Bax表達量較高時，Bcl-2與Bax通過磷酸二酯脫氫鍵形成同源二聚體Bcl-2/Bax，促進細胞凋亡，當Bcl-2表達量較高時，則通過氫鍵形成異源二聚體Bcl-2/Bax，抑制細胞凋亡［12-13］。研究還發(fā)現(xiàn)［14］，Bcl-2、Bax 還可與自身形成二聚體，當Bcl-2通過自身結構域BH3形成Bcl-2/Bcl-2，維持凋亡分子在細胞的恒定，抑制細胞進入凋亡程序，而當Bax/Bax同源二聚體占優(yōu)勢時，可誘導細胞凋亡，Bax/Blc決定了細胞接受凋亡信號后細胞的存活與否，對心肌細胞凋亡的發(fā)生有重要意義。Survivin是Bcl-2、Bax調(diào)控下的重要凋亡抑制基因，Bcl-2/Bax的比例直接決定了Survivin的激活或抑制，Survivin通過內(nèi)源性及外源性途徑抑制細胞凋亡，Survivin直接抑制Caspasc-3和Caspasc-7的活性，來阻斷各種刺激誘導的細胞凋亡過程，Survivin也可通過P21間接抑制Caspase；Survivin與細胞周期調(diào)控因子CDK4結合，導致CDK2/cyclin-E激活和核糖體（Rb）磷酸化，Rb磷酸化后啟動細胞進入周期，加快G1/S期的轉換進而阻斷凋亡信號轉導通路［15-16］。近年來，隨著對心肌缺血（痰濁血瘀證）研究的深入，多項研究表明，心肌細胞過度凋亡以及 IL-3、Fas、Bax、Caspase-3、Caspase-7、Caspase-8、TNF、Survivin等細胞因子的異常表達與心肌缺血（痰濁血瘀證）密切相關。大鼠動物試驗已證實，通過藥物抑制心肌細胞的凋亡能有效治療心肌缺血 （痰濁血瘀證），減輕其損傷［17-18］。

加味溫膽方具有改善血管舒縮功能、抗凝、保護血管內(nèi)皮細胞、抑制血小板凝聚、調(diào)節(jié)血脂、擴張血管、調(diào)節(jié)血壓等藥理學功效，從中醫(yī)學角度上，具有化痰活血、益氣養(yǎng)心的功效，能生新血，散瘀血于脈道［19-20］。本研究結果顯示，空白組心肌纖維排列整齊，間質(zhì)血管無改變，未見心肌細胞變性、壞死。模型組心肌纖維波浪樣改變、斷裂，心肌細胞肥大，空泡變性。加味溫膽方低劑量組見心肌纖維波浪樣改變較強，心肌細胞空泡變性。加味溫膽方中劑量組見心肌纖維中等程度波浪樣改變，心肌細胞中度肥大。加味溫膽方高劑量組心肌纖維排列紊亂輕微，未見心肌斷裂，心肌細胞輕度肥大。結合心肌細胞凋亡結果與空白組比較，模型組及加味溫膽方組各劑量大鼠心肌細胞凋亡光密度及面積均升高；與模型組比較，加味溫膽方組各劑量大鼠心肌細胞凋亡光密度及面積均降低，且隨著加味溫膽方組給藥劑量的增加，凋亡光密度及面積逐漸下降，劑量-效應關系明顯；說明加味溫膽方能減輕冠心病大鼠的病理損傷，有效抑制心肌細胞凋亡，加味溫膽方高劑量效果尤為明顯。而心肌缺血（痰濁血瘀證）大鼠Bcl-2、Bax、Survivin、Caspase-3mRNA及蛋白表達結果，與空白組比較，模型組及加味溫膽方組各劑量Bcl-2、Survivin mRNA、 蛋白表達水平降低，Bax、Caspase-3 mRNA、蛋白表達水平升高；與模型組比較，加味溫膽方組各劑量組Bcl-2、Survivin mRNA、蛋白表達水平降低升高，Bax、Caspase-3 mRNA、蛋白表達水平降低，且隨著加味溫膽方組給藥劑量的增加，Bcl-2、Survivin mRNA、蛋白表達水平逐漸升高，Bax、Caspase-3 mRNA、蛋白表達水平，劑量-效應關系明顯，說明加味溫膽方能促進 Bcl-2、Survivin mRNA、蛋白的表達，抑制 Bax、Caspase-3 mRNA、蛋白的表達，進而抑制心肌細胞凋亡，且具有明顯的劑量-效應關系。

綜上所述，加味溫膽方能減輕冠心病大鼠的病理損傷，抑制心肌缺血（痰濁血瘀證）大鼠細胞凋亡，其機制與加味溫膽方能促進Bcl-2、Survivin mRNA、蛋白的表達，抑制Bax、Caspase-3 mRNA、蛋白的表達有關。