孫德陽(yáng) 朱永志 楊 洋 梁 群△

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江哈爾濱 150040）

腦出血具體是指非外傷性腦實(shí)質(zhì)內(nèi)血管破裂引起的出血［1］，病情急重，早期死亡率高，幸存者中多數(shù)留有不同程度的認(rèn)知、運(yùn)動(dòng)和言語(yǔ)吞咽障礙等后遺癥［2-3］。腦出血后在腦實(shí)質(zhì)內(nèi)形成血腫，血腫壓迫進(jìn)而對(duì)大腦神經(jīng)功能造成損傷。西醫(yī)治療主要體現(xiàn)在脫水降顱壓、調(diào)整血壓、防止繼續(xù)出血、加強(qiáng)護(hù)理維持生命功能等對(duì)癥治療上，效果不甚理想［4］。近年來(lái)中醫(yī)辨證論治原則在腦出血治療上的應(yīng)用，又為其治療提供了新的突破口［5］。前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)中風(fēng)1號(hào)能夠明顯降低急性腦出血大鼠血清NSE水平［6］。本研究旨在前期研究的基礎(chǔ)上利用透射電子顯微鏡在亞顯微結(jié)構(gòu)上觀察中風(fēng)1號(hào)對(duì)急性腦出血大鼠出血灶周?chē)窠?jīng)細(xì)胞凋亡的影響，同時(shí)通過(guò)神經(jīng)功能評(píng)分及腦組織含水量評(píng)估中風(fēng)1號(hào)對(duì)大鼠神經(jīng)功能的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠，雄性，體質(zhì)量（250±20）g由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，按SPF級(jí)別標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006。

1.2 試藥與儀器 中風(fēng)1號(hào)湯劑主要由水蛭10 g，生大黃5 g，澤瀉10 g，三七粉10 g，生地黃5 g配伍而成（由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬一院制劑室通過(guò)水提醇沉法提取藥物有效物質(zhì)）；20%甘露醇 （石家莊四藥有限公司，規(guī)格：250 mL/瓶，國(guó)藥準(zhǔn)字 H1302303）；注射用青霉素鈉 （石藥集團(tuán)中藥藥業(yè)有限公司，規(guī)格：2.4 g/瓶，批號(hào)：024170286）。透射電子顯微鏡（H-7650型，HITACHI公司）；超薄切片機(jī)（EMUC7 型，Leica公司）；無(wú)水乙醇 （A500737，生工生物工程股份有限公司）；50%戊二醛（A500484，生工生物工程股份有限公司）；丙酮（179973，Sigma）；鋨酸（RBS0085，榕柏生物）；包埋液（上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司）。

1.3 分組與造模 將50只雄性SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，即中風(fēng)1號(hào)組、甘露醇組、模型組、假手術(shù)組、空白組。假手術(shù)組為對(duì)照組，每組10只。分別觀察各組動(dòng)物用藥前后神經(jīng)功能評(píng)分、腦組織水含量、腦出血灶周?chē)窠?jīng)細(xì)胞情況。制備大鼠急性腦出血模型，用水合氯醛按0.4 μL/1 g腹腔注射的方式進(jìn)行麻醉大鼠。大鼠麻醉后將大鼠按照俯臥位的姿勢(shì)固定在立體定位儀上，儀器雙側(cè)耳棒固定大鼠耳部，同時(shí)將大鼠的口齒固定于立體定位儀的口齒溝上 （耳尖平面相對(duì)于口齒溝平面高約2 mm）［7］。固定好大鼠之后用手術(shù)刀暴露大鼠前囟點(diǎn)，在前囟點(diǎn)右3.5 mm，后0.2 mm用牙科鉆直徑約1.0 mm圓孔，切勿過(guò)深傷及硬腦膜。鼠尾醫(yī)用酒精消毒后，用5 mL注射器抽取尾部動(dòng)脈血約70 μL，然后用微量注射器抽取60 μL。后通過(guò)定位圓孔將血液緩慢注入大鼠腦內(nèi)（20 μL/min），留針靜置觀察10 min。留針觀察的同時(shí)包扎鼠尾取血處的傷口。無(wú)異樣后拔針并用牙科用水泥封閉創(chuàng)口，同時(shí)在操作區(qū)域涂抹青霉素鈉，縫合手術(shù)傷口，以防止感染影響指標(biāo)變化［8］。假手術(shù)組：造模方法與上述相同，但是不向大鼠腦內(nèi)注射血液。給藥按成人劑量與人體質(zhì)量換算系數(shù)的比例公式計(jì)算大鼠給藥劑量。中風(fēng)1號(hào)組：中風(fēng)1號(hào)湯劑1.5 mL灌胃，每日2次；0.9%氯化鈉注射液1 g/kg，每日2次尾靜脈注射，術(shù)后持續(xù)給藥5 d。甘露醇組：0.9%氯化鈉注射液1.5 mL灌胃，每日2次；甘露醇1 g/kg，每日2次尾靜脈注射，術(shù)后持續(xù)給藥5 d。模型組：0.9%氯化鈉注射液1.5 mL灌胃，每日2次；0.9%氯化鈉注射液1 g/kg，每日2次尾靜脈注射。假手術(shù)組：0.9%氯化鈉注射液1.5 mL灌胃，每日2次；0.9%氯化鈉注射液1 g/kg，每日2次尾靜脈注射，術(shù)后持續(xù)給藥5 d?？瞻捉M：0.9%氯化鈉注射液1.5 mL灌胃，每日2次；0.9%氯化鈉注射液1 g/kg，每日2次尾靜脈注射，術(shù)后持續(xù)給藥5 d。

1.4 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1）神經(jīng)功能評(píng)分：采用雙盲法，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)利用longa對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，無(wú)神經(jīng)功能障礙獲得0分；對(duì)側(cè)前肢彎曲，不能完全伸展獲得1分；大鼠爬行時(shí)向?qū)?cè)劃圈，不能直線行走獲得2分；大鼠爬行時(shí)向?qū)?cè)傾倒獲得3分；意識(shí)水平降低，不能自發(fā)爬行獲得4分。所得分?jǐn)?shù)越高其運(yùn)動(dòng)障礙越明顯。2）腦組織含水量測(cè)定：采用干濕重法，取大鼠進(jìn)行過(guò)量麻醉，直接斷頭后取腦，去除嗅球部分，立即使用分析天平稱(chēng)濕重，然后于90℃干燥24 h，再稱(chēng)腦組織干重。計(jì)算腦含水量（%）=（濕重-干重）/濕重×100%。3）腦組織病理切片制作：取大鼠腦部出血部位1 mm3處。立刻進(jìn)行固定：2.5%戊二醛固定；用0.1 mol/L磷酸漂洗液漂洗15 min，漂洗3次；1%鋨酸固定液固定2～3 h；用0.1 mol/L磷酸漂洗液漂洗15 min，漂洗 3次［9-10］。然后進(jìn)行乙醇梯度脫水（在 4℃冰箱內(nèi)進(jìn)行）：50%乙醇，15～20 min；70%乙醇，15～20 min；90%乙醇，15～20 min；90%乙醇與 90%丙酮（1∶1），15～20 min；90% 丙 酮 ，15～20 min。 后 于 室 溫 下100%丙酮，15～20 min，進(jìn)行 3 次［11］。 包埋：純丙酮與包埋液（2∶1）混合液，室溫進(jìn)行 3～4 h處理；純丙酮與包埋液（1∶2）混合液，室溫過(guò)夜；純包埋液37℃，處理2～3 h。固化：37℃烘箱內(nèi)過(guò)夜；45℃烘箱內(nèi)處理12 h；60℃烘箱內(nèi)處理24 h。超薄切片機(jī)切片50～60 nm后用3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，置于透射電鏡下觀察，拍片［12-13］。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，組間數(shù)據(jù)比較用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠術(shù)后0 d、5 d神經(jīng)功能評(píng)分比較 見(jiàn)表1。模型組、中風(fēng)1號(hào)組、甘露醇組大鼠術(shù)后0 d神經(jīng)功能評(píng)分與空白組和假手術(shù)組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01），其中模型組、中風(fēng)1號(hào)組、甘露醇組各組間數(shù)據(jù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），證明造模成功。模型組、中風(fēng)1號(hào)組、甘露醇組大鼠術(shù)后5 d神經(jīng)功能評(píng)分與空白組和假手術(shù)組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），中風(fēng)1號(hào)組、甘露醇組與模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），中風(fēng)1號(hào)組和甘露醇組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

表1 各組大鼠術(shù)后0 d、5 d神經(jīng)功能評(píng)分比較（分，±s）

表1 各組大鼠術(shù)后0 d、5 d神經(jīng)功能評(píng)分比較（分，±s）

與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01

組 別 n 0 d 5 d空白組 1 0 0.0 0±0.0 0 0.0 0±0.0 0假手術(shù)組 1 0 0.0 0±0.0 0 0.0 0±0.0 0模型組 9 2.4 2±0.7 5 0** 3.2 5±0.5 2 8**中風(fēng) 1 號(hào)組 9 2.4 0±0.9 8 8** 2.1 1±0.9 9 8**△△甘露醇組 9 2.3 9±0.8 6 5** 2.0 7±0.9 7 7**△△

2.2 各組大鼠術(shù)后腦組織含水量比較 見(jiàn)表2。模型組、中風(fēng)1號(hào)組、甘露醇組大鼠術(shù)后5 d腦組織含水量與空白組和假手術(shù)組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），中風(fēng)1號(hào)組、甘露醇組與模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），中風(fēng)1號(hào)組和甘露醇組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

表2 各組大鼠術(shù)后5 d腦組織含水量比較（±s）

表2 各組大鼠術(shù)后5 d腦組織含水量比較（±s）

與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

組 別 n 腦含水量空白組 1 0 7 7.2 5±0.3 8假手術(shù)組 1 0 7 7.2 8±.0.3 5模型組 9 8 3.3 8±0.6 2*中風(fēng) 1 號(hào)組 9 7 9.8 2±0.8 5*△甘露醇組 9 7 9.2 0±0.7 6*△

2.3 各組大鼠腦組織病理切片 見(jiàn)圖1?？瞻捉M大鼠出血灶周?chē)窠?jīng)元核膜完整，雙層膜結(jié)構(gòu)清楚，線粒體形態(tài)正常，基質(zhì)密度適中，細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器數(shù)量豐富，線粒體數(shù)量也較豐富；模型組大鼠出血灶周?chē)窠?jīng)元細(xì)胞膜破裂、不清楚，核固縮較明顯，細(xì)胞器數(shù)量減少，線粒體腫脹、損傷較嚴(yán)重；假手術(shù)組大鼠出血灶周?chē)窠?jīng)元核膜完整，雙層膜結(jié)構(gòu)清楚，線粒體形態(tài)正常，基質(zhì)密度適中，細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器數(shù)量豐富，線粒體數(shù)量也較豐富；中風(fēng)1號(hào)組大鼠出血灶周?chē)窠?jīng)元核膜完整、較清楚，少量線粒體腫脹，細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器數(shù)量較少；甘露醇組大鼠腦出血灶周?chē)窠?jīng)元核膜雙層結(jié)構(gòu)完整，核有輕微固縮現(xiàn)象，少量線粒體發(fā)生腫脹，細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器數(shù)量較少。

圖1 各組大鼠腦組織病理切片（HV:80 kV，1000倍）

3 討 論

腦出血后血液積聚于大腦表面，壓迫腦組織，引發(fā)腦水腫，致使顱內(nèi)壓增大增高，且刺激腦膜引起無(wú)菌性腦膜炎反應(yīng)。血液阻塞腦脊液循環(huán)通路還可發(fā)生梗阻性腦積水，外溢血液中還有多種活性物質(zhì)，如5-羥色胺、兒茶酚胺、血紅蛋白分解物等刺激血管和腦膜，誘發(fā)腦血管痙攣，使腦組織缺血出現(xiàn)意識(shí)障礙或腦梗死［14-16］。而目前西醫(yī)的治療主要集中在控制繼續(xù)出血、降低顱內(nèi)壓、防止復(fù)發(fā)、去除病因和防止并發(fā)癥等對(duì)癥治療方面，但腦出血起病急，病情發(fā)展迅速，發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，以上治療效果不甚理想，且預(yù)后效果不佳。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為本病多因積損正衰，勞倦內(nèi)傷，肝陽(yáng)暴亢，情志不暢，肝氣不舒，不得疏泄，肝郁化火，心火爆亢導(dǎo)致，最常見(jiàn)的誘因是氣候驟變，勞煩過(guò)度，情志過(guò)激，飲酒飽食等?？傮w病機(jī)因上述因素致腦絡(luò)之血破入腦室，新成“瘀血”阻絡(luò)，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)手段也有與其相對(duì)應(yīng)的診斷證明，如腦出血后凝血功能試驗(yàn)結(jié)果的改變，血液常規(guī)中血小板的改變，都證明急性腦出血后腦內(nèi)血液流動(dòng)性變慢［17-18］，故提出腦出血急性期非手術(shù)中醫(yī)治療的方法應(yīng)該以祛瘀行水為主。

中風(fēng)1號(hào)由水蛭 10 g，生大黃5 g，澤瀉 10 g，三七粉10 g，生地黃5 g配伍而成，是朱永志教授在多年臨床工作中總結(jié)的治療急性腦出血有效的經(jīng)驗(yàn)方，具有祛瘀通絡(luò)之功效。水蛭主逐惡血、瘀血，現(xiàn)代藥理研究表明水蛭的主要成分有氨基酸、肽類(lèi)、抗血栓素、肝素等，具有抗凝、抑制血栓形成、抗血小板聚集、腦保護(hù)等作用［19］；生大黃逐瘀通經(jīng)，現(xiàn)代藥理研究表明大黃有明顯的促進(jìn)血凝作用，對(duì)微循環(huán)具有雙向調(diào)節(jié)作用，能降低毛細(xì)血管通透性，能使血小板、纖維蛋白質(zhì)增加，縮短出血和血凝時(shí)間［20］；澤瀉利水滲濕，現(xiàn)代藥理研究表明其含有澤瀉醇A乙酸酯或澤瀉醇B，能有效增加尿素和氯化物的排除，對(duì)降低顱內(nèi)壓起到一定作用［21］；三七粉化瘀止血，現(xiàn)代藥理研究表明三七含有三七氨酸，能夠有效縮短出血和凝血時(shí)間，具有抗血小板聚集及溶栓的作用，且有研究表明三七皂苷能夠在氧糖剝奪模型中促進(jìn)大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）的增殖與分化，起到腦保護(hù)的作用［22］；生地黃清熱涼血，養(yǎng)陰生津，現(xiàn)代藥理研究表明地黃乙醇提取物所得的黃色針狀結(jié)晶能縮短凝血時(shí)間［23］?？v觀全方，諸藥綜合配伍，共奏活血祛瘀之功。

本研究是在建立急性腦出血大鼠模型的基礎(chǔ)上，灌胃給予中風(fēng)1號(hào)，并通過(guò)評(píng)估神經(jīng)功能評(píng)分、計(jì)算腦組織含水量及透射電子顯微鏡下的觀察，通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)中風(fēng)1號(hào)組術(shù)后5 d神經(jīng)功能評(píng)分及腦組織含水量與模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明中風(fēng)1號(hào)能夠降低神經(jīng)功能評(píng)分，并降低大鼠腦組織含水量，起到腦組織保護(hù)的作用。單純的中風(fēng)1號(hào)組和甘露醇組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在西醫(yī)上脫水降低顱內(nèi)壓的常用藥物是甘露醇，但是甘露醇對(duì)腎臟的損傷越來(lái)越引起人們重視，且不宜長(zhǎng)時(shí)間使用。電鏡下發(fā)現(xiàn)中風(fēng)1號(hào)組大鼠組織神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)明顯好轉(zhuǎn)，核膜完整程度、細(xì)胞器數(shù)量也較模型組明顯增多。線粒體是細(xì)胞進(jìn)行有氧呼吸的主要場(chǎng)所，被稱(chēng)作能量工廠，而且它除了為細(xì)胞提供能量以外，還參與細(xì)胞分化、信息傳遞和細(xì)胞凋亡等諸多環(huán)節(jié)，有研究表明線粒體在細(xì)胞凋亡環(huán)節(jié)處于中心地位［24-25］。本實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)中風(fēng)1號(hào)組線粒體形態(tài)、腫脹程度、基質(zhì)密度、數(shù)量較模型組明顯改善。推測(cè)其原因可能是中風(fēng)1號(hào)能促進(jìn)線粒體結(jié)構(gòu)的恢復(fù)，為腦出血造成神經(jīng)元損傷的修復(fù)提供能量，從而保護(hù)起到腦組織神經(jīng)，促進(jìn)預(yù)后的作用。