李玉梅　盛紅彬　徐恒仕

[摘要] 目的 探討血清miR-21和miR-423-5p對心臟瓣膜?。╒HD）引起心力衰竭的潛在診斷價值。 方法 選擇2014年8月～2016年4月上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院心內科收治的伴心力衰竭的VHD患者60例為VHD組，選擇同期正常人60名為對照組。通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測VHD伴有心力衰竭患者和正常人的血清miR-21和miR-423-5p表達，并利用ROC曲線分析miR-21和miR-423-5p作為VHD伴有心力衰竭診斷和預后生物標志物的臨床價值。 結果 VHD組患者血清miR-21和miR-423-5p表達明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。伴有肺動脈高壓（PH）的VHD患者血清miR-423-5p水平高于PH的VHD患者，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。ROC曲線結果顯示，血清miR-21和miR-423-5p可以作為VHD伴心力衰竭的診斷標志物。 結論 血清miR-21和miR-423-5p具備診斷VHD伴有心力衰竭的臨床價值。血清miR-423-5p可作為VHD伴有心力衰竭的診斷標志物。

[關鍵詞] miRNA；miR-423-5p；心瓣膜?。恍牧λソ?；肺動脈高壓；ROC曲線

[中圖分類號] R541.6 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）11（c）-0151-05

Diagnostic values of miR-21 and miR-423-5p in patients with valvular heart disease and heart failure

LI Yumei1 SHENG Hongbin2 XU Hengshi1

1.Department of Blood Transfusion， Shanghai Ninth People′s Hospital， Shanghai Jiao Tong University School of Medicine， Shanghai 201999， China； 2.Department of Clinical Pharmacy， Shanghai Ninth People′s Hospital， Shanghai Jiao Tong University School of Medicine， Shanghai 201999， China

[Abstract] Objective To investigate the potential diagnostic value of serum miR-21 and miR-423-5p for heart failure （HF） due to heart valve disease （VHD）. Methods From August 2014 to April 2016， in Shanghai Ninth People′s Hospital， Shanghai Jiao Tong University School of Medicine， 60 VHD patients with HF were selected as VHD group， at the same period， 60 healthy persons were selected as control group. The levels of serum miR-21 and miR-423-5p were measured by qRT-PCR. The ROC curve was used analyse the clinical Value of miR-21 and miR-423-5p as VHD with biomarkers for diagnosis and prognosis of heart failure. Results The levels of miR-21 and miR-423-5p in sera of patients in VHD group were higher than control group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. The levels of miR-423-5p in sera of VHD patients with pulmonary hypertension （PH） were higher than VHD patients without PH， the differences were statistically significant （P < 0.05）. ROC curve result showed that serum miR-21 and miR-423-5p had potential diagnostic values on HF due to VHD. Conclusion Serum miR-21 and miR-423-5p show potential diagnostic values on HF due to VHD. Moreover， serum miR-423-5p can be an effective biomarker for diagnosing VHD patients with PH.

[Key words] MiRNA； MiR-423-5p； Valvular heart disease； Heart failure； Pulmonary hypertension； ROC curve

心力衰竭已成為全球重大健康問題，發(fā)病率正逐年增加[1]。為了診斷心力衰竭，臨床上發(fā)現諸多生物標志物。其中B型腦鈉肽（BNP）和氨基末端腦鈉肽前體（NT-ProBNP）曾被認為是診斷心力衰竭的良好生物標志物[2]。但亦有報道，在嚴重的心臟收縮降低情況下，BNP并不足以衡量心臟阻塞程度[3]。因此急需更有效的非損傷性心力衰竭診斷標志物。

miRNA是一類長度為21～23個核苷酸的非編碼RNA分子，其在心肌梗死、心力衰竭等心臟疾病中有重要作用[4]。報道顯示miRNA的異常表達可能與心臟類疾病相關，可能成為診斷心力衰竭的有效標志物[5]。miRNA曾被當作是診斷心力衰竭的循環(huán)生物標志物[6]。研究表明，miR-21在患有由心臟瓣膜病（VHD）導致的心力衰竭的犬中呈現減量調節(jié)趨勢[7]。此外，心力衰竭患者中miR-423-5p的表達有所增加，意味著miR-423-5p有可能是一種診斷心力衰竭的有效標志物[8]。本研究旨在通過臨床驗證，預測miR-423-5p表達與患有心力衰竭的VHD相關性，進而證實miR-423-5p和miR-21在由VHD導致的心力衰竭中的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2014年8月～2016年4月上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院心內科收治的VHD伴心力衰竭的患者60例為VHD組，對年齡超過50歲且可能患有冠狀動脈疾病的患者進了血管造影術。納入標準：①年齡超過18周歲；②通過體檢確?；加蠽HD；③具備紐約心臟協(xié)會心力衰竭診斷標準癥狀[9]。排除標準：①有心肌衰弱或者正患有心力衰竭的患者，通過血管造影術發(fā)現動脈血管阻塞區(qū)域超過75%的患者，接受過支架移植術的患者；②有肺部疾病的患者；③有甲狀腺功能亢進和慢性貧血的患者；④有高血壓的患者。根據世界衛(wèi)生組織最新分類，被診斷出患有肺動脈高壓（PH）的患者[10]，入選標準為平均肺動脈壓（mPAP）≥25 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），肺部輸入壓≤15 mmHg。選擇同期正常人60名為對照組。本次研究對象已經排除腫瘤等混雜因素的影響。每位參與者抽取5 mL血液樣本，立即離心提取血清，并將其保存于-80℃冰箱。本研究經我院醫(yī)學倫理委員會批準，所有患者或家屬均知情同意。

1.2 RNA的抽取和逆轉錄聚合酶鏈式反應

按照程序，RNA通過使用mir VanaTM PARIS miRNA isolation kit（美國，Ambion）進行分離?？俁NA通過TaqMan MicroRNA逆轉錄試劑盒（美國，Applied Biosystems）進行逆轉錄。qRT-PCR反應使用了SYBR Premix Ex Taq試劑盒（中國，TaKaRa）在ABI PRISM 7900HT測序系統(tǒng)上進行的。qRT-PCR反應體系詳見表1，擴增條件設置為95℃ 15 min；95℃ 10 s；60℃ 30 s；循環(huán)40次。2-△△Ct循環(huán)閾值法來計算目標miRNA的相對表述水平[11]。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計學軟件SPSS 21.0對數據進行分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗。繪制ROC曲線，利用AUC面積來評價血清miRNA水平的診斷價值。Pearson相關分析檢驗相關性。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組臨床資料比較

兩組年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。但VHD組的NT-proBNP和HsCRP水平明顯高于對照組，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01），兩組LVEDd和LVEF比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見表2。

2.2 血清miR-21和miR-423在VHD患者中的過表達

VHD組患者的血清miR-21表達水平（1.69±0.72）明顯高于對照組（1.04±0.59），差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）；同時VHD組患者的血清miR-423-5p的表達水平（0.93±0.41）也明顯高于對照組（0.16±0.07），差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見圖1。

2.3 VHD組患者HsCRP水平與血清miR-21和miR-423-5p表達水平的相關性

Pearson相關分析顯示，VHD組患者的血清miR-21和miR-423-5p的表達水平與超敏C反應蛋白呈正相關（r = 0.619、0.646，P = 0.004、0.002）。此外VHD組患者中血清miR-21的水平與miR-423-5p呈正相關（r = 0.569，P = 0.009）。見圖2。

2.4 血清miR-21與血清miR-423-5p在 VHD伴有心力衰竭中的診斷價值

血清miR-21、miR-423-5p和NT-proBNP的ROC曲線詳圖3。其中血清miR-21的AUC值為0.772，提示其對VHD伴有心力衰竭有一定的診斷作用。另外，血清miR-423-5p的AUC值為0.965，比NT-proBNP高（AUC值為0.900），提示血清miR-423-5p也可作為VHD伴有心力衰竭的診斷標志物。

2.5 血清miR-423-5p對伴有PH的VHD患者的診斷價值

本研究將VHD患者分不伴有PH和伴有PH兩組，發(fā)現伴有PH患者的血清miR-423-5p水平較高于不伴有PH患者，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），而兩組血清miR-21和NT-proBNP水平差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），見表3。ROC曲線結果提示，伴有PH的VHD患者的血清miR-423-5p AUC值為0.805（圖4），說明血清miR-423-5p可能用于診斷VHD患者是否伴有PH。

3 討論

研究證實miRNA可通過與其他媒介反應來避免被RNA酶降解，并穩(wěn)定存在于血漿、尿液、眼淚等細胞外液中[12]。相比從組織樣本中提取，循環(huán)miRNA更易獲取，可反復測量[13]。有報道稱循環(huán)miRNA是診療多種心臟疾病的重要生物標志物[14]。而循環(huán)miRNA在伴有VHD的心力衰竭中的診斷價值卻少有研究。

miR-21可以通過調節(jié)Bcl-2來促進心臟纖維變性，這會導致心力衰竭的惡化[15]。有研究顯示，為了加強心臟血管生成過程中的細胞遷移，miR-21會抑制PDCD4的表達，這意味著miR-21和VHD存在一定聯系[16]。在本研究中，VHD組血清miR-21的表達水平明顯高于對照組（P < 0.05）。這就表明血清miR-21可能對VHD患者中的心力衰竭有潛在診斷價值，聯合血清miR-423-5p有更高診斷意義。

由于miR-423-5p主要存在于心包積液中，與其它的循環(huán)miRNA如miR-133a相比，miR-423-5p的表達模式有明顯不同，說明miR-423-5p可能作為VHD伴有心力衰竭的生物標志物[17]。本研究顯示，血清miR-423-5p在VHD組中的表達明顯高于對照組，且血清miR-423-5p水平與VHD患者的PH相關。由于本研究已排除原發(fā)性的肺部疾病，表明PH是由VHD引起。嚴重的慢性心力衰竭是導致PH的常見原因，并且伴有PH的舒張期心力衰竭發(fā)病率要高于收縮期心力衰竭[18-19]。該研究中，在對伴有PH的VHD的診斷中，血清miR-423-5p的敏感性要高于NT-proBNP。因此，在評估伴有心力衰竭的VHD時，血清miR-423-5p可以作為一種有效的預測生物標志物。

近年研究已證明，miR-21能刺激NF-kB（核內轉錄因子）或PDCD4，并調控心肌細胞的凋亡[20]。而miR-423-5p在誘發(fā)心臟病方面的作用與miR-21和miR-423-5p在循環(huán)水平的聯系還需要進一步研究。最后，本研究發(fā)現血清miR-21和miR-423-5p可作為潛在并有獨立性的生物標志物來對VHD伴有心力衰竭患者進行診斷。血清miR-423-5p在評估伴有心力衰竭的VHD患者的嚴重程度上有較高的敏感性，并且對伴有PH的VHD患者也有較好的診斷價值。

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（收稿日期：2017-11-21 本文編輯：蘇 暢）