陳宇　鄭新　陳立波

[摘要] 目的 建立快速測定母乳中拉貝洛爾含量的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）。 方法 母乳樣品經(jīng)甲醇-乙腈混合溶液沉淀蛋白，稀釋后離心取上清液進(jìn)樣。色譜柱為Thermo Scientific Syncronis C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），初始流動相為0.2%甲酸溶液-乙腈（80∶20，V/V），流速為0.2 mL/min，梯度洗脫，AJS ESI正離子模式電離，多反應(yīng)離子監(jiān)測模式（MRM）檢測，外標(biāo)法定量。 結(jié)果 母乳中拉貝洛爾在1.042～104.2 ng/mL范圍內(nèi)線性良好（r = 0.9988），定量下限為1.042 ng/mL，準(zhǔn)確度為92.0%～104.8%，批內(nèi)、批間RSD均小于15%，提取回收率為82.2%～92.4%。 結(jié)論 本方法前處理簡單、準(zhǔn)確，專屬性強(qiáng)、靈敏度高，可用于拉貝洛爾的乳藥濃度監(jiān)測。

[關(guān)鍵詞] 拉貝洛爾；超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法；乳藥濃度；藥物監(jiān)測

[中圖分類號] RTS218；O657.63 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）11（c）-0085-04

[Abstract] Objective To establish an ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS） method for rapid determination of labetalol in breast milk. Methods The breast milk sample was precipitated by a methanol-acetonitrile mixed solution， and after centrifugation， the supernatant was centrifuged for injection. The column was Thermo Scientific Syncronis C18 （100 mm × 2.1 mm， 1.7 μm）， the initial mobile phase was 0.2% formic acid solution-acetonitrile （80∶20， V/V）， the flow rate was 0.2 mL/min， utilizing a gradient elution program. The MS/MS detection was performed under AJS ESI+ in MRM mode， quantitatived by external standard method. Results The linear range of Labetalol was 1.042-104.2 ng/mL （r = 0.9988），with the low limit of quantitation of 1.042 ng/mL. Accuracy was 92.0%-104.8%， intra-batch and inter-batch relative standard deviations were both below 15%. The absolute recovery in breast milk was 82.2%-92.4%. Conclusion The method is simple， accurate， specific， and with high sensitivity， which can be used for concentration in breast milk monitoring of labetalol.

[Key words] labetalol； Ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry； Concentration in breast milk； Drug monitoring

拉貝洛爾為α、β腎上腺素能受體阻滯劑，劑型多樣，是孕婦妊娠高血壓常用的降壓藥物[1-7]。臨床應(yīng)用其解除妊娠因素后不能立即停藥或存在血壓未下降至正常的情況，產(chǎn)婦往往仍需要降壓治療數(shù)天甚至更長，且需要權(quán)衡服藥和母乳喂養(yǎng)之間的利弊。雖然文獻(xiàn)報(bào)道拉貝洛爾對母親及乳兒影響較小[8-10]，但是鹽酸拉貝洛爾片說明書[11]中哺乳期用藥信息寫到“乳汁中的濃度為母體血液的22%～45%，乳母慎用”。另有報(bào)道稱新生兒誤服拉貝洛爾可致心力衰竭[12]。為在保證產(chǎn)婦得到有效治療的前提下，最大限度降低拉貝洛爾對新生兒的不利影響，有必要對拉貝洛爾乳藥濃度進(jìn)行監(jiān)測。目前，國內(nèi)外未見對母乳中拉貝洛爾含量測定的報(bào)道。鹽酸拉貝洛爾[13]和鹽酸拉貝洛爾注射液[14]采用高效液相色譜法HPLC測定含量，其紫外檢測器在生物樣本中的檢測靈敏度不符合定量要求。報(bào)道的血漿中拉貝洛爾的含量測定方法主要有LC-MS/MS[15]和HPLC-FLU[16]，其需液-液萃取后濃縮富集，操作繁瑣耗時(shí)。本研究擬建立用于快速測定母乳中拉貝洛爾的含量超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS），簡化操作，為臨床拉貝洛爾乳藥濃度的監(jiān)測及母嬰安全用藥提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1290-6460超高效液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國安捷倫科技有限公司）；XS-205DU電子分析天平（梅特勒-托利多）；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；ST16R高速冷凍離心機(jī)（美國賽默飛世爾科技有限公司）；M37610-33CN渦旋混合器（美國賽默飛世爾科技有限公司）；Synergy超純水機(jī)（默克密理博）。

1.2 試藥

鹽酸拉貝洛爾對照品（中國食品藥品檢定研究院，生產(chǎn)批號：100484-201001，純度≥99.8%）；甲醇（色譜純，默克股份兩合公司）；乙腈（色譜純，默克股份兩合公司）；甲酸（優(yōu)級純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；超純水（電阻率18.2 MΩ·cm，密理博超純水機(jī)制備）。

60份口服鹽酸拉貝洛爾片的妊娠高血壓產(chǎn)婦乳汁樣本由玉林市婦幼保健院采集，空白乳汁樣本由健康產(chǎn)婦提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

色譜條件 色譜柱：Thermo Scientific Syncronis C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：A為0.2%甲酸溶液，B為乙腈，梯度程序程序：0～3 min，20%～60%B；3～5 min，60%～90%B；5～8 min，90%B；8～8.1 min，90%～20%B；8.1～12 min，20%B。流速：0.2 mL/min；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：5 μL。

質(zhì)譜條件 AJS ESI源正離子模式；多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）掃描；干燥氣溫度300℃，干燥氣流量5 L/min，霧化器壓力45 psi，鞘氣溫度250℃，鞘氣流量11 L/min，毛細(xì)管電壓4000 V，噴嘴電壓500 V；拉貝洛爾定量離子m/z 329 →310.8（裂解電壓100 V，碰撞能量5 eV），定性離子為m/z 329 →161.8（裂解電壓100 V，碰撞能量25 eV）。

2.2 甲醇-乙腈混合液

分別量取甲醇、乙腈適量，并按照1∶1（V/V）混合均勻，用10%甲酸溶液調(diào)節(jié)pH至4.0，即得。

2.3 對照品溶液的制備

精密稱取鹽酸拉貝洛爾對照品11.60 mg（相當(dāng)于拉貝洛爾10.42 mg），置于50 mL容量瓶中，加甲醇-乙腈混合液溶解并稀釋至刻度，得濃度為0.2084 mg/mL的儲備液，置于4℃冰箱中保存。精密量取儲備液0.1 mL置20 mL量瓶中，用甲醇-乙腈混合液稀釋至刻度，搖勻即得含拉貝洛爾濃度為1.042 μg/mL的對照品溶液。

2.4 樣品前處理

取待測母乳置于渦旋混合器中均質(zhì)2 min，精密量取1 mL置于10 mL離心管中，加甲醇-乙腈混合液5 mL，渦旋1 min，超聲提取 5 min，放置室溫后，用甲醇-乙腈混合液稀釋至10 mL，5000 r/min（RCF=4612×g）離心10 min，取上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液測定。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 方法專屬性 分別取空白母乳、添加了拉貝洛爾對照品溶液的空白母乳以及服藥產(chǎn)婦的母乳，按“2.4”項(xiàng)的方法處理，在“2.1”項(xiàng)的色譜及質(zhì)譜條件下測定。拉貝洛爾主要生成[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰m/z 329，定量離子為m/z 310.8，定性離子為m/z 161.8，保留時(shí)間為3.075 min，母乳中無內(nèi)源性物質(zhì)干擾，方法具有良好的專屬性。見圖1。

2.5.2 殘留效應(yīng) 精密量取1.042 μg/mL拉貝洛爾標(biāo)準(zhǔn)使用液1.0 mL置于含1 mL空白母乳的10 mL離心管中，按“2.4”項(xiàng)處理后以洗針進(jìn)樣的方式進(jìn)樣檢測后，立即將空白母乳進(jìn)樣。結(jié)果在拉貝洛爾峰保留時(shí)間處未檢出峰，表明樣品檢測不受高濃度樣品殘留影響。

2.5.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量下限 精密量取1.042 μg/mL拉貝洛爾對照品溶液0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、0.8、1.0 mL分別置于各含1 mL空白母乳的10 mL離心管中，按“2.4”項(xiàng)處理，分別制成1.042、5.21、10.42、26.05、52.1、83.36、104.2 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線系列工作液。按“2.1”項(xiàng)的色譜及質(zhì)譜條件測定，以峰面積為縱坐標(biāo)，母乳中藥物濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程Y=143.531824X+92.914980（r = 0.9988）。表明母乳中拉貝洛爾在1.042 ng/mL～104.2 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其定量下限為1.042 ng/mL，信噪比大于100。

2.5.4 精密度與準(zhǔn)確度 精密量取空白母乳1 mL至10 mL離心管中，加入0.1、0.25、0.9 mL的1.042 μg/mL對照品溶液，按“2.4”項(xiàng)處理，制備成低、中、高3個(gè)濃度的質(zhì)控樣品，每個(gè)濃度制備6份，連續(xù)測定3批，根據(jù)當(dāng)批標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣品的測得濃度，考察方法的精密度與準(zhǔn)確度。見表1。批內(nèi)、批間RSD均小于15%，精密度與準(zhǔn)確度均符合“生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”（《中國藥典》2015年版四部通則9012）。

2.5.5 提取回收率 將“2.5.4”項(xiàng)的質(zhì)控樣品進(jìn)樣得到峰面積A1；另取空白母乳按“2.4”項(xiàng)處理后取上清液，配制成對應(yīng)濃度的樣品進(jìn)樣得峰面積A2，提取回收率（%）=A1/A2×100%。結(jié)果顯示，拉貝洛爾的提取回收率分別為82.2%、83.3%、92.4%。

2.5.6 基質(zhì)效應(yīng) 取拉貝洛爾對照品溶液用甲醇-乙腈混合液配制成與質(zhì)控樣品濃度一致的對照品工作液，進(jìn)樣得到峰面積A3，取“2.5.5”項(xiàng)的A2計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)?；|(zhì)效應(yīng)=A2/A3×100%。結(jié)果顯示拉貝洛爾的基質(zhì)效應(yīng)分別為104.4%、102.4%、101.1%，表明基質(zhì)效應(yīng)不影響拉貝洛爾的測定。

2.5.7 穩(wěn)定性 配制低、中、高3個(gè)濃度的質(zhì)控樣品于-20℃保存，于第2、10、30天取出，在室溫下解凍后，按“2.4”項(xiàng)處理，按“2.1”項(xiàng)條件測定，計(jì)算各樣品的實(shí)測濃度與理論濃度的偏差。結(jié)果顯示，各樣品的偏差為-13.8%～2.7%，符合小于±15%的要求，表明母乳中拉貝洛爾在-20℃保存下，30 d內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.8 含量測定 本方法成功應(yīng)用于60例妊娠高血壓疾病產(chǎn)婦泌乳后首次口服鹽酸拉貝洛爾片（100 mg，q8h）母乳中拉貝洛爾的濃度監(jiān)測。分別取妊娠高血壓產(chǎn)婦泌乳后首次口服鹽酸拉貝洛爾片后0.5、1、2、3、4、6、8 h一次服藥時(shí)段（8 h/次）的乳汁，測定濃度后繪制藥-時(shí)曲線，結(jié)果顯示首次服藥后2～4 h母乳中拉貝洛爾濃度最高。見圖2。

3 討論

本研究首次建立了UPLC-MS/MS法測定母乳中拉貝洛爾的含量。本方法的特異性更好，靈敏度更高，檢出限比HPLC熒光檢測法[16]提高了10倍，比HPLC紫外檢測法[14]提高了200倍。提取液的pH=5.0時(shí)鹽酸拉貝洛爾對照品在有機(jī)溶劑中超聲30 min仍然不能完全溶解，調(diào)節(jié)pH=4.0時(shí)能完全溶解。提取液只用甲醇或者乙腈時(shí)，拉貝洛爾峰在液相色譜儀上峰形不好，改用甲醇-乙腈混合液后峰形得到改善，故選擇甲醇-乙腈混合液作為提取液。對照品溶液在1.243 min處有1個(gè)小峰，母乳樣品則沒有，文獻(xiàn)報(bào)道[17-18]拉貝洛爾有4個(gè)光學(xué)異構(gòu)體，對照品溶液的小峰可能是其同分異構(gòu)體，母乳樣品中的峰是有生物活性的同分異構(gòu)體。經(jīng)峰面積歸一化法計(jì)算，有活性的同分異構(gòu)體的百分含量為80.8%（RSD = 0.64%，n = 6）。

生物樣本在質(zhì)譜分析時(shí)容易產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)[19-23]，嚴(yán)重影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度。本研究對比了消除基質(zhì)效應(yīng)常用的凈化方法沉淀蛋白法（PPT）、液液萃?。↙LE）和固相萃?。⊿PE），最終選定沉淀蛋白質(zhì)后稀釋的策略[22-24]，采用甲醇-乙腈混合液直接沉淀蛋白后稀釋離心，前處理不需要萃取和富集，簡化了處理步驟，節(jié)約了前處理時(shí)間，提高了前處理效率，而且需要樣品量少，樣品采集時(shí)更容易被患者接受?！吧飿悠范糠治龇椒?yàn)證指導(dǎo)原則”（《中國藥典》2015年版四部通則9012）推薦使用質(zhì)譜檢測時(shí)盡可能使用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)物，但因其價(jià)格昂貴，購買困難，故考察基質(zhì)效應(yīng)對測定無明顯影響后，采用外標(biāo)法定量。

乳藥濃度監(jiān)測過程中發(fā)現(xiàn)，大部分妊娠高血壓產(chǎn)婦母乳中拉貝洛爾的達(dá)峰時(shí)間為服藥后2～4 h，但是個(gè)別產(chǎn)婦達(dá)峰時(shí)間為服藥后4～6 h，某些產(chǎn)婦出現(xiàn)兩個(gè)甚至多個(gè)峰濃度。這主要是由藥物在體內(nèi)過程的多重因素所致[25]，說明口服拉貝洛爾在母乳中的濃度存在個(gè)體差異，可利用本方法開展拉貝洛爾在母乳中濃度的臨床監(jiān)測[26-27]。

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（收稿日期：2018-03-12 本文編輯：王 蕾）