招樹濤　徐永健　陳浩云

[摘要] 目的 克隆與人血腦屏障通透性相關(guān)基因Caveolin-1，并在大腸埃希菌中表達，最后進行蛋白純化、鑒定。方法 根據(jù)基因庫中收錄的Caveolin-1基因序列，設(shè)計其上下游引物，經(jīng)過PCR反應(yīng)合成Caveolin-1雙鏈，然后與pET28a（+）載體重組，篩選陽性克隆并對DNA序列分析鑒定。將已構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pET28a-Caveolin-1轉(zhuǎn)入化大腸埃希菌BL21（DE3），異丙基硫代半乳糖苷誘導(dǎo)融合蛋白表達，表達產(chǎn)物經(jīng)鎳離子親和層析（Ni2+-NTA）純化，SDS-PAGE檢測和Western blot鑒定。 結(jié)果 PCR擴增的Caveolin-1 DNA片段經(jīng)鑒定確認(rèn)為人Caveolin-1基因。經(jīng)異丙基硫代半乳糖苷誘導(dǎo)的含有pET28a-Caveolin-1重組質(zhì)粒的DE3菌表達出重組人Caveolin-1融合蛋白。重組蛋白經(jīng)Ni2+-NTA親和層析純化，獲得了較高純度的融合蛋白。 結(jié)論 本研究成功克隆了人血腦屏障通透性相關(guān)基因Caveolin-1，并對其進行蛋白表達、純化，獲得了較高純度融合蛋白，為進一步的相關(guān)臨床研究奠定了基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞] 血腦屏障；通透性相關(guān)基因；Caveolin-1；克隆；表達；純化

[中圖分類號] R543.5 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）11（b）-0013-04

[Abstract] Objective To clone Caveolin-1， a gene related to human blood-brain barrier permeability， and express it in Escherichia coli. and to purify and identify the protein finally. Methods According to the sequence of Caveolin-1 gene contained in the gene bank， the upstream and downstream primers were designed. The Caveolin-1 double strand was synthesized by PCR and then recombined with pET28a （+） vector. Positive clones were screened and identified by DNA sequence analysis. The constructed recombinant plasmid pET28a-Caveolin-1 was transfected into E. coli BL21 （DE3）， and the expression of the fusion protein was induced by IPTG. The expressed product was purified by Ni2+-NTA affinity chromatography， identified by SDS-PAGE and Western blot. Results The Caveolin-1 DNA fragment amplified by PCR was identified as human Caveolin-1 gene. The recombinant human Caveolin-1 fusion protein was expressed by IPTG-induced DE3 strain containing the recombinant plasmid pET28a-Caveolin-1. The recombinant protein was purified by Ni2+-NTA affinity chromatography to obtain a fusion protein of higher purity. Conclusion This study successfully cloned the blood-brain barrier permeability-related gene Caveolin-1， and expressed and purified the protein to obtain a higher purity fusion protein， which laid a foundation for further relevant clinical research.

[Key words] Blood-brain barrier； Permeability related gene； Caveolin-1； Cloning； Expressing； Purifying

腦梗死患者多死于腦水腫及出血性轉(zhuǎn)化，這與腦缺血組織中血腦屏障的受損密切相關(guān)[1]。Caveolins蛋白是小窩的主要結(jié)構(gòu)成份，與小窩的形態(tài)構(gòu)成及相關(guān)功能相關(guān)，其家族中包括Caveolin-1、Caveolin-2、Caveolin-3，其中Caveolin-1分布最為廣泛，且在不同的組織中表達水平不同[2]。Caveolins蛋白家族是血管通透性的重要調(diào)控因子[3-4]。Choi等[5]在《Stroke》雜志中發(fā)表的關(guān)于對鼠缺血性腦損傷模型研究表明，Caveolins家族中，尤其是Caveolin-1蛋白對缺血性損傷時血腦屏障通透性的調(diào)控作用更明顯，與血腦屏障的完整程度存在密切關(guān)系，Caveolin-1蛋白是血腦屏障通透性的重要調(diào)控因子，其可通過調(diào)節(jié)缺血損傷腦組織血腦屏障的通透性，降低水腫及出血性轉(zhuǎn)化的發(fā)生，這為臨床腦梗死的治療提供了新思路。理論上，體外操作可實現(xiàn)對腦梗患者受損腦組織中Caveolin-1蛋白的調(diào)控，降低腦水腫及出血性轉(zhuǎn)化的發(fā)生，從而提高腦梗死患者的治愈率并改善其愈后狀況。本研究擬參照葉棋濃[6]在《現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)與實驗技巧》中所述的研究方法，對人Caveolin-1基因進行克隆，并對其進行蛋白表達，以期獲得高純度的Caveolin-1蛋白，為Caveolin-1治療腦梗死的臨床前研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株和質(zhì)粒pET28a載體、DH5α菌株、大腸埃希菌（E.coli）BL21（DE3）、Taq酶、XhoⅠ、EcoRⅠ內(nèi)切酶以及T4連接酶、蛋白Marker均購自TaKaKa公司，質(zhì)粒提取及瓊脂糖凝膠回收試劑盒、鎳離子親和層析（Ni2+-NTA）預(yù)裝柱、化學(xué)發(fā)光顯色試劑均購自O(shè)MEGA公司，鼠抗人Anti-6×His抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG均購自浩天生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 Caveolin-1基因擴增 根據(jù)Caveolin-1基因序列設(shè)計其上下游引物，并進行PCR反應(yīng)，取PCR產(chǎn)物5 μL進行瓊脂糖凝膠電泳。上下游序列如下：上游引入EcoRⅠ酶切位點，下游引入XhoⅠ酶切位點。正向引物（P1）：5′-ACATAAATTTTTTTCTCCAAATTAC-CTGAGTGTCAAGGTGTACGGACCCCTCCGAAGTGT-TAGTACCTCC-3′；反向引物（P2）：5′-TATTTTCGAT-GTCTCACTCTGCATGGGGCACTGGGCAGCCACAGA-AGTGAGGGTGCCATTGCTCTGCTTG-3′。PCR反應(yīng)體系：10×PCR buffer 5 μL，dNTP 4 μL，引物P1 1 μL，引物P2 1 μL，Taq酶0.25 μL，模板2 μL，加水至50 μL。反應(yīng)條件：94℃ 30 s，45℃ 30 s，72℃ 30 s 2個循環(huán)，72℃延伸2 h。

1.2.2 重組質(zhì)粒pET28a-Caveolin-1的構(gòu)建 將Caveolin-1的PCR產(chǎn)物與pET28a載體DNA分別進行雙酶切，回收純化后進行連接，取連接產(chǎn)物10 μL轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于Kan抗性的LB平板上，37℃倒置過夜，次日隨機挑取菌落，接種于Kan抗性的LB液體培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)12 h，提取質(zhì)粒，進一步測序鑒定。

1.2.3 重組人Caveolin-1融合蛋白的誘導(dǎo)表達 用接種環(huán)沾取少量含有重組質(zhì)粒pET28a-Caveolin-1的保存菌，于LB（Kan+）平板上劃線，37℃倒置培養(yǎng)過夜。次日挑取單菌落，接種于5 mL LB （Kan+）液體培養(yǎng)基，37℃振搖培養(yǎng)過夜。次日取培養(yǎng)過夜菌液500 μL 再接種于50 mL選擇性LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至OD600值達0.6。吸取1 mL后加入異丙基硫代半乳糖苷（IPTG），終濃度為1 mmol/L，37℃繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h。取加IPTG前后的菌液各1 mL，12 000 r/min離心5 min，收集菌體沉淀，并于沉淀中加50 μL蒸餾水，混勻后再加2×十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）上樣緩沖液50 μL，混勻，沸水浴5 min，12 000 r/min離心10 min，每個樣品取20 μL上樣于15%的SDS-PAGE膠上電泳鑒定。

1.2.4 重組人Caveolin-1融合蛋白的純化及Western blot檢測 將含有重組質(zhì)粒pET28a-Caveolin-1的LB液體培養(yǎng)基擴大誘導(dǎo)培養(yǎng)，提純包涵體，并裂解復(fù)性。將復(fù)性產(chǎn)物緩慢加于已用磷酸鹽緩沖液（PBS）平衡的Ni2+-NTA親和層析預(yù)裝柱中，加樣所用的流速控制在1 mL/min內(nèi)；PBS洗滌除去未結(jié)合蛋白，沖洗流速應(yīng)控制在5 mL/min內(nèi)；分別用含100、150 mmol/L咪唑PBS緩沖液洗脫融合蛋白，流速5 mL/min。取純化后的融合蛋白20 μL于15%的SDS-PAGE膠上上樣，并電泳；然后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上膜上，進行Western blot印跡分析。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增

通過Caveolin-1基因上下游引物進行PCR，結(jié)果擴增出一個約700 bp的DNA片段。見圖1。

2.2 重組質(zhì)粒pET28a-Caveolin-1序列分析

Caveolin-1基因與pET28a（+）載體連接后轉(zhuǎn)入表達菌株DH5α，隨機挑取單克隆菌落，提取質(zhì)粒測序，結(jié)果與Genebank中Caveolin-1序列一致。

2.3 誘導(dǎo)重組人Caveolin-1融合蛋白的表達

Caveolin-1的分子量約20.47 KD，pET28a-Caveolin-1表達的Caveolin-1結(jié)果詳見圖2

2.4 重組融合蛋白的純化、鑒定

分別采用100、150 mmol/L咪唑PBS緩沖液洗脫，并對各洗脫液進行10%的SDS-PAGE電泳鑒定，重組融合蛋白在含150 mmol/L咪唑PBS緩沖液可以被完全洗脫。見圖3。經(jīng)Western blot印跡分析，可見一清晰條帶，即Caveolin-1蛋白得到有效純化。見圖4。

3討論

腦卒中在世界范圍內(nèi)都是引起死亡及致殘的主要原因之一。該領(lǐng)域的研究主要集中于缺血性損傷的細(xì)胞，并認(rèn)為大腦血供不足很容易導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞受損及神經(jīng)功能障礙，多種信號分子參與了這一過程[8-9]。細(xì)胞死亡并不是導(dǎo)致疾病的急性期患者死亡的直接原因，大部分腦梗死患者死于腦水腫及在缺血性腦組織中出現(xiàn)的出血性轉(zhuǎn)化。腦水腫可引起缺血性梗阻面積的擴大，并可通過一系列反應(yīng)引發(fā)臨床癥狀的惡化。出血性轉(zhuǎn)化是公認(rèn)的腦梗死伴發(fā)癥，其生理的特殊性限制了溶栓療法的臨床應(yīng)用，進而導(dǎo)致腦梗死死亡的發(fā)生。腦梗死患者出現(xiàn)腦水腫及出血性轉(zhuǎn)化的嚴(yán)重后果是由血腦屏障的破壞而引起的[10]。維持血管完整性是腦缺血治療的靶標(biāo)。然而，在臨床中維持血腦屏障完整性的治療是有限的。因此，了解血腦屏障破壞的潛在機制對腦卒中的治療及預(yù)后有重要意義。

Caveolins-1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)參與調(diào)控血腦屏障滲出、氧化應(yīng)激反應(yīng)、神經(jīng)炎性反應(yīng)過程，還參與了髓鞘修復(fù)和神經(jīng)元突觸再生等過程[11-12]。在腦缺血急性期，Caveolins-1過表達能夠降低血腦屏障滲透性、減輕腦水腫，進而減小腦梗死體積，發(fā)揮腦保護作用[13-14]。鐘義良等[15]的研究表明，血清Caveolins-1水平可作為急性腦梗死發(fā)生早期神經(jīng)功能惡化的獨立預(yù)測因子。膜蛋白Caveolins是調(diào)控血管通透性的關(guān)鍵因子[4，16]。Caveolin-1是小窩蛋白的一種，這個家族是細(xì)胞膜的重要組成成份，是細(xì)胞膜表面小窩的標(biāo)記蛋白[17]，其作為支架蛋白可結(jié)合信號分子調(diào)控細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、物質(zhì)轉(zhuǎn)運、細(xì)胞增殖等活動[18-20]。Choi等[13]研究表明，Caveolins家族中的Caveolins-1可通過阻止緊密連接蛋白的降解，抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的活性來保護細(xì)胞膜的完整。降低腦缺血損傷時Caveolins-1的表達，對血腦屏障的通透性是有害的；增加腦缺血損傷時Caveolins-1的表達可保護血腦屏障的通透性，減少腦水腫及出血性轉(zhuǎn)化的發(fā)生。Caveolins-1是可維持血腦屏障通透性穩(wěn)定的蛋白，可以作為治療腦梗死的靶標(biāo)。未來有望通過體外調(diào)控缺血腦組織中Caveolins-1基因及其蛋白的表達，降低腦水腫及出血性轉(zhuǎn)化的發(fā)生，進而提高腦梗死患者的治愈率、改善其愈后狀況。

本研究依據(jù)基因庫中公布的Caveolins-1序列，自行設(shè)計了Caveolins-1基因的上游及下游引物片段，并對該基因進行了PCR，得到了Caveolins-1的PCR產(chǎn)物。產(chǎn)物經(jīng)純化后與pET28a（+）載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-Caveolins-1，轉(zhuǎn)化宿主菌DH5α，培養(yǎng)后挑取的單克隆菌落經(jīng)序列分析后確定重組片段為人血腦屏障通透性相關(guān)的Caveolin-1基因全長cDNA。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的含有pET28a-Caveolin-1重組質(zhì)粒的DE3菌，表達出重組人Caveolin-1融合蛋白。重組蛋白經(jīng)Ni2+-NTA親和層析進行純化后，得到了較高純度的融合Caveolins-1蛋白。這為今后Caveolins-1治療腦梗死的研究奠定了基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2017-12-08 本文編輯：任 念）