陶 波，喬禹欣，陳國(guó)峰,2，馬誠(chéng)義，馬 紅

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所，哈爾濱 150086）

綠豆[Vigna radiata（Linn.）Wilczek.]是我國(guó)主要食用豆類作物之一[1]，主產(chǎn)區(qū)集中在黃河、淮河流域及東北地區(qū)[2]，其產(chǎn)量和出口量均居世界首位[3]。綠豆?fàn)I養(yǎng)價(jià)值較高，蛋白質(zhì)含量高于谷類物質(zhì)，約占24%，脂肪含量較低，約占1%，含豐富淀粉、維生素、礦物質(zhì)、脂類及賴氨酸、蛋氨酸、色氨酸、酪氨酸等多種人體必需氨基酸[4]，且藥食同源，具有解毒、抗菌抑菌、降三高、抗腫瘤、預(yù)防癌癥等功能[5]。赤小豆[Vigna angularis（Willd.）Ohwi et Ohashi]又名紅小豆、赤豆，屬一年生草本植物[6]，起源于中國(guó)，種植于全國(guó)各地，主栽地區(qū)為華北、黃河中下游地區(qū)。赤小豆籽粒富含必需氨基酸、鈣、磷等礦質(zhì)元素[7]，含有單寧、黃酮、多酚、生物堿、植酸、皂苷等生物活性物質(zhì)[8]。近年來，隨人們生活水平提高、膳食結(jié)構(gòu)改變和保健理念增強(qiáng)，綠豆、赤小豆及其加工食品需求量逐年增加，綠豆、赤小豆種植面積擴(kuò)大。由于防草除害需要，農(nóng)藥使用增加、殘留嚴(yán)重。因此，建立適用于豆類作物中多類別、多品種藥物快速高通量測(cè)定方法尤為重要，對(duì)保障作物安全生產(chǎn)及人類健康具有重要意義。

在多農(nóng)藥殘留檢測(cè)中，結(jié)構(gòu)相似、極性化合物出現(xiàn)質(zhì)譜圖互相交錯(cuò)、干擾，甚至部分重疊，分離重疊農(nóng)藥峰成為殘留分析方法建立的難點(diǎn)。農(nóng)殘分析方法主要有氣相色譜法（Gas chromatography）、氣相色譜-質(zhì)譜法（Gas chromatographymass spectrometry）、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（Gas chromatography tandam mass spectrometry）和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（Liquid chromatography tandam mass spectrometry）。氣相色譜法靈敏度高，但抗干擾能力差，對(duì)樣品前處理凈化要求較高。王建華等利用QuEChERS法-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蔬菜中7種農(nóng)藥及其代謝物殘留量[9]；李嬋君等利用QuEChERS前處理聯(lián)合UPLC-MS/MS法檢測(cè)花生中22種農(nóng)藥殘留[10]；阮華等采用QuEChERS-在線凝膠色譜-氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定大米、黍子和小麥中34種農(nóng)藥殘留[11]。國(guó)內(nèi)谷物中多農(nóng)藥殘留檢測(cè)建立方法多見農(nóng)藥母體，代謝物檢測(cè)關(guān)注較少。

試驗(yàn)選取10種用于綠豆和赤小豆生產(chǎn)的除草劑氟磺胺草醚、烯草酮、撲草凈、滅草松、精喹禾靈、異丙甲草胺、噻吩磺隆、二甲戊樂靈、惡草酮、嗪草酮，GB 2763-2016及歐盟等對(duì)其代謝物均有限量要求[12]。

QuEChERS法具有快速簡(jiǎn)單、成本低、環(huán)境友好等特點(diǎn)[13-15]，目前已廣泛用于水果蔬菜糧食農(nóng)藥多殘留檢測(cè)[16-17]。本文以綠豆和赤小豆為研究對(duì)象，采用QuEChERS法提取和凈化方法、MS/MS參數(shù)等作優(yōu)化處理，選擇PSA吸附劑對(duì)樣品作分散固相萃取凈化，建立綠豆和赤小豆中10種農(nóng)藥及其代謝物（氟磺胺草醚、烯草酮、烯草酮砜、烯草酮亞砜、精喹禾靈、滅草松、異丙甲草胺、二甲戊靈、噻吩磺隆、噁草酮、嗪草酮和撲草凈）液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠豆和赤小豆空白樣品2017年10月購(gòu)于哈爾濱市哈達(dá)批發(fā)市場(chǎng)，編號(hào)分別為L(zhǎng)D1-10和HD1-10的綠豆和赤小豆樣本，2017年10月采集自黑龍江省哈爾濱市、牡丹江市、齊齊哈爾市、吉林省長(zhǎng)春市、遼寧省沈陽市、大連市、江蘇省南京市、河北省石家莊市、貴州省貴陽市和安徽省合肥市；所有樣本經(jīng)高速中藥萬能粉碎機(jī)粉碎后，-20℃冰柜儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

撲草凈標(biāo)準(zhǔn)品（分子式為C10H19N5S，CAS No.7287-19-6）、氟磺胺草醚（C15H10ClF3N2O6S，CAS No.72178-02-0）、烯草酮（C17H26ClNO3S，CAS No.99129-21-2）、 烯草酮砜（C17H26ClNO5S，CAS No.111031-17-5）、烯草酮亞砜（C17H26ClNO4S，CAS No.111031-14-2）、滅草松（C10H12N2O3S，CAS No.250 57-89-0）、精喹禾靈（C17H13ClN2O4，CAS No.1006 46-51-3）、異丙甲草胺（C15H22ClNO2，CAS No.51 218-45-2）、噻吩磺隆（C12H13N5O6S2，CAS NO.792 77-27-）、二甲戊樂靈（C13H19N3O4，CAS No.40487-42-1）、惡草酮（C15H18Cl2N2O3，CAS No.19666-30-9）、嗪草酮（C8H14N4OS，CAS No.21087-64-9），純度大于95%，購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfe公司；乙腈、甲醇，色譜純，購(gòu)自迪馬科技公司；乙腈，分析純，購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉，分析純，購(gòu)自北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司；甲酸，色譜純，購(gòu)自北京Dikma公司；乙二胺-N-丙基硅烷（PSA 40～60 μm），購(gòu)自天津博納艾杰爾科技有限公司；試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

WATERS Xevo TQ-S超高效液相色譜儀-串聯(lián)質(zhì)譜儀（配電噴霧離子源）、BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）美國(guó)Waters公司；LXJ-ⅡB高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器設(shè)備廠；IKA MS3 basic型渦流混合器，德國(guó)IKA公司；BT 2202 S電子天平，德國(guó)Sartorius公司；IKA T25均質(zhì)器，德國(guó)IKA公司；HERMLE Z323K高速離心機(jī)，德國(guó)HERMLE公司；奧特賽恩斯AP-01P手提式隔膜真空泵，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；FB-10T溶劑過濾瓶，杭州瑞析科技有限公司；KQ600B超聲波清洗機(jī)，廣州市予華儀器有限公司；HZQ-F160振蕩器，北京佳源興科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

稱取綠豆、赤小豆樣品各200 g，均勻粉碎后裝袋保存于-20℃冰柜備用。

稱取綠豆和赤小豆粉末各20 g（精確到0.01 g）樣品于250mL燒杯，加入20mL水分散，加入40mL乙腈均質(zhì)提取2 min，轉(zhuǎn)入離心管，加入5 g NaCl，渦旋2 min后，以5 000 r·min-1離心5 min。取1 mL上層乙腈提取液于裝有25 mg NH2凈化劑2 mL離心管中，渦旋1 min，8 000 r·min-1離心3 min，過0.22μm有機(jī)系濾膜，待測(cè)。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

農(nóng)藥單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液配置：準(zhǔn)確稱取氟磺胺草醚、撲草凈、滅草松、精喹禾靈、異丙甲草胺、噻吩磺隆、二甲戊樂靈、惡草酮、嗪草酮、烯草酮、烯草酮砜、烯草酮亞砜，乙腈配制成質(zhì)量濃度均為1.0 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，各取1.0 mL上述單品農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于50 mL容量瓶，乙腈定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為20 mg·L-1混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，儲(chǔ)存于-40℃冰箱中備用。使用時(shí)用初始流動(dòng)相逐級(jí)稀釋成所需濃度工作溶液。準(zhǔn)確稱取20.00 g空白綠豆和赤小豆樣品各5份，按1.3.1方法處理樣品，經(jīng)有機(jī)濾膜過濾后，加入混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，配制成所需質(zhì)量濃度基質(zhì)校準(zhǔn)系列工作溶液。

1.3.3 儀器條件

1.3.3.1 色譜條件

柱溫：35℃；進(jìn)樣量：2 μL；流動(dòng)相：A相為0.1%（V/V）甲酸溶液，B相為乙腈；二元梯度洗脫分離，洗脫程序：0～3 min，95%A；3～9 min，95%A～10%A；9～12 min，90%A；12～12.5 min，10%A～95%A；12.5～15 min，95%A。

1.3.3.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（Electrospray ion source，ESI）；掃描方式：氟磺胺草醚為負(fù)離子掃描，其余化合物均采用正離子掃描；碰撞氣壓力：3.0 kV；離子源溫度：150℃；氣化溫度：450℃；脫溶劑氣流量：1 000 L·h-1；錐孔氣流量：150 L·h-1；檢測(cè)方式：多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)，見表1。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

將10種農(nóng)藥及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用初始流動(dòng)相稀釋配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5、10、20、50、100 μg·L-1系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，在上述色譜、質(zhì)譜條件下利用UPLC-MS/MS開展試驗(yàn)，設(shè)置3次重復(fù)。繪制10種農(nóng)藥及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性回歸方程。

1.5 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

樣品回收率測(cè)定采用標(biāo)樣添加方法，向綠豆、赤小豆樣品中添加10種農(nóng)藥及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)溶液，使綠豆和赤小豆樣品中藥劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為10、100、200 μg·kg-1，經(jīng)樣品前處理，提取凈化后，加標(biāo)樣品利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定其含量，試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，計(jì)算加標(biāo)回收率。

表1 10種農(nóng)藥及其代謝物保留時(shí)間及質(zhì)譜分析參數(shù)Table 1 Retention time and mass spectral parameters for ten kinds of pesticides and their metabolites

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

根據(jù)12種物質(zhì)不同理化性質(zhì)，氟磺胺草醚采用負(fù)離子掃描模式，其余物質(zhì)采用正離子掃描模式，氟磺胺草醚分子式中對(duì)氧苯基含3個(gè)氟原子，氟相對(duì)電負(fù)性被指定為4，所有原子中電負(fù)性最大，氟磺胺草醚易丟失1個(gè)質(zhì)子而電離，因而采用負(fù)離子模式掃描。從質(zhì)譜調(diào)諧可看出，負(fù)離子模式下，當(dāng)氟磺胺草醚進(jìn)入一級(jí)質(zhì)譜后產(chǎn)生穩(wěn)定[M-H]-峰，氟磺胺草醚母離子為436.8，[M-H]-離子進(jìn)入二級(jí)質(zhì)譜經(jīng)碰撞后產(chǎn)生m/z分別為194.7、285.8、222、316、72等碎片離子，其中m/z 194.7特征離子響應(yīng)值高且穩(wěn)定，因此將m/z 436.8/194.7作為定量離子對(duì)，選擇響應(yīng)值次高m/z 285.5作為定性離子。正離子模式下，其余11種物質(zhì)均能產(chǎn)生穩(wěn)定[M+H]+峰，滅草松母離子為241.1，[M+H]+離子進(jìn)入二級(jí)質(zhì)譜后，產(chǎn)生m/z分別為199.1、135.1、107、120等碎片離子，其中m/z 199.1特征離子是母離子脫去異丙基—CH（CH3）2后產(chǎn)生，m/z 199.1特征離子響應(yīng)值高且穩(wěn)定，因此將m/z 241.1/199.1作為定量離子對(duì)，選擇響應(yīng)值次高m/z 135.1作為定性離子。撲草凈母離子242.0，撲草凈[M+H]+離子進(jìn)入二級(jí)質(zhì)譜后，產(chǎn)生m/z分別為200.1、158、115.8、109、84等碎片離子，其中m/z 200.1特征離子是母離子脫去異丙基—CH（CH3）2后產(chǎn)生，m/z 158特征離子是m/z 200.1離子進(jìn)一步脫去異丙基—CH（CH3）2后產(chǎn)生，m/z 200.1特征離子響應(yīng)值高且穩(wěn)定，因此將m/z 242.0/200.1作為定量離子對(duì)，選擇響應(yīng)值次高m/z 158作為定性離子。同理，對(duì)其余9種物質(zhì)均采用穩(wěn)定且響應(yīng)值最高特質(zhì)離子峰為定量離子，次高峰為定性離子。氟磺胺草醚和滅草松質(zhì)譜圖如圖1所示。

2.2 色譜條件優(yōu)化

為達(dá)到最佳重疊峰分離和質(zhì)譜響應(yīng)，試驗(yàn)對(duì)比5種流動(dòng)相：甲醇-0.005 mol·L-1乙酸銨，甲醇-0.005 mol·L-1乙酸銨（含0.1%甲酸），甲醇-0.1%乙酸，甲醇（含0.1%甲酸）-水，乙腈-0.1%甲酸色譜分離效果。試驗(yàn)結(jié)果顯示，流動(dòng)相中加入少量甲酸（0.1%）可提高分析物離子化效率并改善色譜峰峰形，加入乙酸銨也可改善峰形，起緩沖鹽作用。最終以乙腈-0.1%甲酸作為本試驗(yàn)流動(dòng)相，優(yōu)化確定最佳洗脫程序（見“1.3.3.1”）。結(jié)果表明，優(yōu)化條件下，10種農(nóng)藥及其代謝物均可得到較好重疊峰分離度和色譜峰形，11種農(nóng)藥（正離子）和1種農(nóng)藥（負(fù)離子）MRM總離子流圖見圖2。

圖1 氟磺胺草醚和滅草松二級(jí)質(zhì)譜Fig.1 Production spectra of fomesafen and bentazone

圖2 綠豆樣品中10種農(nóng)藥及其代謝物（50 μg·kg-1）總離子色譜Fig.2 Total ion chromatogram of ten pesticides and their metabolites(50 μg·kg-1)in mung bean samples

2.3 提取方法優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑選擇

根據(jù)本試驗(yàn)10種農(nóng)藥及其代謝物理化性質(zhì)可知，乙腈、甲醇、丙酮、二氯甲烷、甲苯等有機(jī)溶劑均有較好溶解性。目前農(nóng)藥殘留分析最常用提取溶劑有乙腈、丙酮和乙酸乙酯等。本研究比較乙腈、2：1（V/V）乙腈/水、0.1%甲酸乙腈、2：1（V/V）0.1%甲酸乙腈/水、1：1（V/V）丙酮/二氯甲烷對(duì)綠豆中10種農(nóng)藥及其代謝物提取效果。結(jié)果表明，1：1（V/V）丙酮/二氯甲烷作為提取溶劑時(shí)提取的雜質(zhì)較乙腈多，且丙酮和二氯甲烷無法直接進(jìn)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，必須氮吹干后凈化并轉(zhuǎn)相，二氯甲烷毒性較大，當(dāng)純乙腈作為提取溶劑時(shí)，除精喹禾靈、二甲戊靈和惡草酮外，其他9種物質(zhì)回收率均小于80%，其中噻吩磺隆回收率最低，僅為15.28%；而用0.1%甲酸乙腈作為提取溶劑時(shí)，其回收率較乙腈稍高，最低回收率為20.22%；當(dāng)使用2：1（V/V）0.1%甲酸乙腈/水作為提取溶劑時(shí)，溶劑效應(yīng)明顯高于2：1（V/V）乙腈/水提取溶劑。由于流動(dòng)相為乙腈和0.1%甲酸水，同時(shí)考慮凈化過程溶劑性質(zhì)，因此選取2：1（V/V）乙腈/水作為提取溶劑，此提取溶液中12種物質(zhì)回收率為99.08%～109.63%。

2.3.2 提取方法優(yōu)化

目前國(guó)內(nèi)外農(nóng)藥殘留分析主要提取方式為振蕩、超聲和均質(zhì)3種。本研究分別比較3種提取方式及提取時(shí)間，分別采用振蕩提取10、20、30、60 min，超聲提取10、20、30 min，均質(zhì)提取2、3、5 min，結(jié)果表明，振蕩提取方式隨提取時(shí)間延長(zhǎng)，提取效果逐漸增強(qiáng)，振蕩10 min時(shí)，10種農(nóng)藥及其代謝物回收率8.20%～12.65%，振蕩時(shí)間延長(zhǎng)至60 min時(shí)，平均回收率80.11%～104.64%；超聲提取與振蕩提取規(guī)律相似，隨超聲提取時(shí)間延長(zhǎng)，提取率逐漸增大，超聲10 min時(shí)上述10種農(nóng)藥及其代謝物回收率為65.62%～96.95%，當(dāng)超聲時(shí)間為60 min時(shí)，回收率81.44%～95.13%；分別比較均質(zhì)提取2、3和5 min時(shí)回收率發(fā)現(xiàn)，當(dāng)均質(zhì)提取時(shí)間為2 min時(shí)10種農(nóng)藥及其代謝物回收率92.24%～106.80%，隨提取時(shí)間延長(zhǎng)，提取液雜質(zhì)逐漸增多，具體表現(xiàn)在5 min綠豆和赤小豆基質(zhì)效應(yīng)較2 min高。因此同時(shí)考慮提取效果和提取時(shí)間，選擇均質(zhì)2 min作為本試驗(yàn)10種農(nóng)藥及其代謝物提取方式。

2.4 凈化方法優(yōu)化

本試驗(yàn)分析PSA、GCB、C18、NH24種不同凈化劑及不同添加量對(duì)綠豆、赤小豆樣品乙腈提取溶液凈化效果。取綠豆和赤小豆樣品乙腈提取液1 mL于2 mL離心管，分別在離心管中添加上述4種凈化劑各25 mg，測(cè)定目標(biāo)化合物加標(biāo)回收率。上述結(jié)果表明，當(dāng)使用NH2作為凈化吸附劑時(shí)，凈化后液體中還有微量色素，赤小豆中二甲戊靈回收率為125.09%，高于合理范圍；GCB可有效去除基質(zhì)中色素[18]，也對(duì)某些農(nóng)藥有一定吸附作用[19]，特別是對(duì)具有芳香環(huán)及結(jié)構(gòu)對(duì)稱性農(nóng)藥吸附力最強(qiáng)[20]，使用GCB作為凈化吸附劑時(shí)，精喹禾靈因含有喹喔啉六元環(huán)稠環(huán)易被GCB吸附，導(dǎo)致回收率小于55%；C18凈化劑對(duì)除烯草酮砜和烯草酮亞砜其余10種化合物均有良好凈化效果，平均回收率94.16%～113.56%；采用25 mg PSA凈化劑凈化時(shí)10種農(nóng)藥及其代謝物回收率85.35%～113.29%，均在合理范圍（70%～120%）內(nèi)，可能因PSA凈化劑含有兩個(gè)氨基可與有機(jī)酸、脂肪酸、色素、糖類等極性基質(zhì)成分結(jié)合，且對(duì)目標(biāo)農(nóng)藥和代謝物不具有吸附效果[21]，因此本試驗(yàn)采用25 mg PSA作為吸附劑凈化綠豆和赤小豆乙腈提取液。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

樣品提取液添加法是由Matuszewski等提出的一種定量基質(zhì)效應(yīng)強(qiáng)度測(cè)定方法，可解決樣品基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，回收率由校準(zhǔn)前135.0%、127.0%的異常值，恢復(fù)為97.0%、93.0%。為明確樣品基質(zhì)效應(yīng)是增強(qiáng)或抑制，陰性綠豆和赤小豆樣品經(jīng)上述優(yōu)化后分散固相萃取、凈化和檢測(cè)步驟得到3種基質(zhì)溶液，分別將其與丙酮溶劑配制的50、100 μg·L-110種農(nóng)藥及其代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品基質(zhì)配制標(biāo)液，上機(jī)后，采用基質(zhì)標(biāo)樣峰面積除以溶劑標(biāo)樣峰面積比值r反映基質(zhì)增強(qiáng)。

表2 10種農(nóng)藥及其代謝物定量限、線性方程、相關(guān)系數(shù)Table 2 Limits of quantitation,linear equation,correlation coefficients for ten pesticides and their metabolites

試驗(yàn)農(nóng)藥在3種基質(zhì)中均表現(xiàn)離子增強(qiáng)效應(yīng)。綠豆空白基質(zhì)樣品乙腈提取液中添加10種農(nóng)藥及代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，與同濃度純?nèi)軇┗旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液農(nóng)藥質(zhì)譜比較測(cè)定，研究綠豆和赤小豆基質(zhì)對(duì)10種農(nóng)藥及代謝物基質(zhì)效應(yīng)。綠豆和赤小豆基質(zhì)效應(yīng)強(qiáng)弱由基質(zhì)標(biāo)樣中測(cè)定農(nóng)藥定量離子質(zhì)譜峰面積與溶劑標(biāo)樣質(zhì)譜峰面積相比增加或減少百分比表達(dá)，若定量離子質(zhì)譜峰面積超過15%則認(rèn)定基質(zhì)效應(yīng)明顯。結(jié)果表明，10種農(nóng)藥及2種代謝物存在明顯基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。因此，為降低綠豆和赤小豆基質(zhì)效應(yīng)對(duì)定量結(jié)果準(zhǔn)確性影響，試驗(yàn)過程中配制綠豆和赤小豆基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液校正定量結(jié)果，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液需使用前現(xiàn)用現(xiàn)配。

2.6 方法驗(yàn)證

2.6.1 線性關(guān)系和定量限

將配制好質(zhì)量濃度為5、10、20、50、100 μg·L-110種農(nóng)藥及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)溶液，上機(jī)分析，得到相應(yīng)響應(yīng)值，標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見圖2，以峰面積響應(yīng)值為縱坐標(biāo)（y）、標(biāo)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由表2可知，5～100 μg·L-1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)所有農(nóng)藥均呈較好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r均大于0.995，以10倍信噪比確定各農(nóng)藥化合物定量限（Limit of quantitation，LOQ）[22-23]，所有農(nóng)藥及其代謝物定量限為0.1～1 μg · kg-1[24-25]。

2.6.2 回收率和精密度

向空白綠豆和赤小豆樣品中分別添加不同濃度10種農(nóng)藥及其代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液作回收試驗(yàn)，按上述優(yōu)化方法提取和凈化，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定其含量，外標(biāo)法定量，計(jì)算每個(gè)加標(biāo)樣品中10種農(nóng)藥及其代謝物平均加標(biāo)回收率和標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。由表3可知，10種農(nóng)藥及其代謝物回收率90.2%～110.0%，RSD 0.8%～7.3%（n=5）。

表3 加標(biāo)回收率及精密度試驗(yàn)Table 3 Recoveries rate and precision experiment（RSDs）

2.7 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果

采用均質(zhì)提取，PSA凈化方法，分別對(duì)來自黑龍江、吉林、遼寧、江蘇、河北、貴州、安徽7個(gè)省綠豆和赤小豆各10個(gè)樣品測(cè)定上述10種農(nóng)藥和代謝物殘留，結(jié)果如表4所示。

實(shí)際樣品綠豆和赤小豆各10份樣品中噻吩磺隆、精喹禾靈、烯草酮（含烯草酮砜和烯草酮亞砜）、惡草酮、異丙甲草胺、二甲戊靈和嗪草酮均未檢出，滅草松共檢出6項(xiàng)次，檢出含量0.023～0.114 mg·kg-1；撲草凈共檢出3項(xiàng)次，檢出含量0.010～0.057 mg·kg-1；氟磺胺草醚共檢出10項(xiàng)，殘留量0.043～0.106 mg· kg-1。

表4 綠豆和赤小豆中10種農(nóng)藥及其代謝物檢出情況Table 4 Distribution of ten pesticidese and metabolites detected in mung bean and red bean shoots

3 討論與結(jié)論

安文佳等利用固相萃取-氣相色譜法檢測(cè)綠豆中7種農(nóng)藥殘留[26]。王德飄等建立氣相色譜-電子捕獲檢測(cè)器（GC-ECD）檢測(cè)綠豆和向日葵中福美雙殘留量方法[27]。劉暢研究快速檢測(cè)紅小豆、綠豆、高粱米中8種農(nóng)殘方法[28]。李成等研究高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定紅小豆中6種咪唑啉酮類除草劑殘留檢測(cè)方法[29]。目前，綠豆和赤小豆殘留檢測(cè)方法主要集中在殺蟲劑和殺菌劑，農(nóng)藥及其代謝物同時(shí)檢測(cè)關(guān)注較少。研究發(fā)現(xiàn)，部分農(nóng)藥代謝產(chǎn)物因其比農(nóng)藥母體具有更強(qiáng)環(huán)境穩(wěn)定性和生態(tài)毒性，對(duì)生態(tài)環(huán)境和人體危害遠(yuǎn)高于農(nóng)藥母體。農(nóng)藥及其代謝物檢測(cè)，對(duì)環(huán)境安全和食品安全更為重要，是未來農(nóng)藥殘留檢測(cè)熱點(diǎn)和難點(diǎn)。目前國(guó)內(nèi)外農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)及法規(guī)不僅要求檢測(cè)農(nóng)藥母體，對(duì)農(nóng)藥有毒代謝物殘留檢測(cè)要求也越來越高，因此必須建立農(nóng)藥及其代謝物同時(shí)檢測(cè)方法。本試驗(yàn)研究綠豆和赤小豆生產(chǎn)中常使用的10種農(nóng)藥及2種代謝產(chǎn)物殘留檢測(cè)方法，目前尚無報(bào)道。

本研究建立分散固相萃取結(jié)合超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)綠豆和赤小豆中氟磺胺草醚、烯草酮及其代謝物烯草酮砜和烯草酮亞砜等12種化合物殘留量方法，通過優(yōu)化綠豆和赤小豆樣品前處理方法（提取方法、提取溶劑和凈化方法）、色譜條件、質(zhì)譜條件，最終采用20 mL 2：1（V/V）乙腈/水作為提取溶劑，考慮提取效果和提取時(shí)間，選擇均質(zhì)2 min作為提取方式，選擇25 mg PSA作為分散固相萃取吸附劑。樣品基質(zhì)效應(yīng)是質(zhì)譜檢測(cè)過程正常現(xiàn)象，檢測(cè)樣品基質(zhì)、樣品提取溶劑、提取方法等前處理因素均影響基質(zhì)效應(yīng)，基質(zhì)效應(yīng)通常是妨礙（離子抑制）或增強(qiáng)（離子增強(qiáng)）分析目標(biāo)離子的形成效能，影響定量結(jié)果?；|(zhì)可通過如下方法消除：①樣品前處理時(shí)盡量處理干凈；②儀器分析過程中，標(biāo)準(zhǔn)曲線采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制；③采用內(nèi)標(biāo)法作色譜分析校正。目前最常用方法是樣品提取液添加法。王連珠等以提取液添加法研究青花菜、番茄、枝豆、蘿卜、大蔥等蔬菜基質(zhì)中66種有機(jī)磷農(nóng)藥使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析基質(zhì)效應(yīng)[30]，結(jié)果表明可有效解決各蔬菜基質(zhì)中色素等類復(fù)雜基質(zhì)干擾問題，平均回收率為55.0%～122.0%，RSD為1.6%～18.0%，LOQ為0.1～8.0μg·kg-1。同位素內(nèi)標(biāo)法也是解決基質(zhì)問題有效方法，但本方法涉及10余種農(nóng)藥品種，難以內(nèi)標(biāo)法同時(shí)檢測(cè)，采用與被測(cè)物質(zhì)性質(zhì)相近物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)存在偏差。因此，為明確基質(zhì)效應(yīng)對(duì)定量結(jié)果影響，配制綠豆和赤小豆乙腈提取液基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液校正定量結(jié)果，以上方法操作快速簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性好、準(zhǔn)確可靠，滿足限量檢測(cè)要求。其中10種農(nóng)藥及其代謝物5～100 μg· L-1呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r）0.9978～0.9999。3個(gè)加標(biāo)水平下，10種農(nóng)藥及其代謝物平均回收率90.2%～110.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于7.3%。完全符合綠豆和赤小豆中農(nóng)藥及其代謝物同時(shí)檢測(cè)分析要求，為綠豆和赤小豆中農(nóng)藥及代謝物殘留風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供可靠方法，保障食品安全。本試驗(yàn)每種農(nóng)藥和代謝物均設(shè)定3個(gè)不同添加濃度，每個(gè)濃度添加5次重復(fù)，有效消除試驗(yàn)誤差，結(jié)果有效。