胡瑞鴻，叢秋實(shí)，李艷飛

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司，哈爾濱 150069）

卵黃免疫球蛋白（Immunoglobulin of yolk，IgY）是母雞受免疫刺激后將血清中相應(yīng)特異性IgG選擇性轉(zhuǎn)移至卵黃蓄積而成[1]。雞卵黃中含48%水、17.6%蛋白質(zhì)和30%脂肪[2]，脂肪易與蛋白質(zhì)結(jié)合形成脂蛋白[3]。傳統(tǒng)粗制卵黃含有大量外源非水溶性蛋白及磷脂等大分子，提取卵黃抗體必須脫脂處理[4]，抗體純度、效價(jià)是影響小鵝瘟抗體使用效果的關(guān)鍵因素[5]。

國(guó)內(nèi)研究除脂方法主要有水稀釋法、聚乙二醇沉淀法、硫酸葡聚糖沉淀法、天然樹膠沉淀法、氯仿、苯酚、辛酸等有機(jī)溶劑抽提沉淀法以及超濾、超臨界萃取法與凍融等物理化學(xué)方法[6]。Kim與Hatta等利用非離子型表面活性劑原理，采用聚乙二醇6000和泊洛沙姆使卵黃液脫脂，破壞卵黃脂類水化膜，打破卵黃乳化狀態(tài)，卵黃脂類互相凝結(jié)形成沉淀，實(shí)現(xiàn)脂水分離[7-8]。若兩種活性劑濃度過(guò)高，破壞抗體蛋白水化膜，形成沉淀，影響抗體效價(jià)[9-10]。但上述方法除脂工藝流程長(zhǎng)、步驟多、試劑消耗量大，須去除殘留化學(xué)物質(zhì)[11]。因此，研究無(wú)毒、無(wú)害、除脂效率高且除脂后對(duì)卵黃抗體影響最小的方法具有重要意義。

本試驗(yàn)研究酸化水不同稀釋度、pH、存放時(shí)間及離心力對(duì)除脂率及卵黃免疫球蛋白提取的影響，篩選同條件下，脫脂率、瓊擴(kuò)效價(jià)及蛋白濃度最高的參數(shù)組合，旨在確定適用于小鵝瘟卵黃抗體脫脂工藝優(yōu)化條件，為小鵝瘟卵黃抗體規(guī)模化生產(chǎn)提供理論依據(jù)及試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

小鵝瘟卵黃抗體高免雞蛋：按照既定免疫程序，免疫合格產(chǎn)蛋雞，收集雞蛋[12]。

0.12 mol·L-1（pH 5.0）醋酸鹽緩沖液、0.1 mol·L-1（pH 7.2）PBS、辛酸（CP）、硫酸銨（AR）。

小鵝瘟陽(yáng)性血清：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

小鵝瘟瓊擴(kuò)抗原：哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司制備。

1.2 方法

1.2.1 IgY抗體測(cè)定

1.2.1.1 操作方法

將制備瓊脂板按模板用打孔器打孔，挑出孔中瓊脂。中心1孔，周圍6孔，孔徑3 mm，孔距4 mm（見圖1）。中央孔加入標(biāo)準(zhǔn)瓊擴(kuò)抗原，1孔加入標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，3、5孔加入倍比稀釋產(chǎn)品。各孔均加滿（25 μL）。將加樣后瓊脂板放入填有紗布濕盒內(nèi)，置于37℃，24 h首次判定，72 h最終判定。

圖1 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)Fig.1 Agar diffusion test

1.2.1.2 判定標(biāo)準(zhǔn)

當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清孔與抗原孔之間形成清晰沉淀線時(shí)，被檢產(chǎn)品與抗原孔之間出現(xiàn)沉淀線，被檢血清判為陽(yáng)性；當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清孔與抗原孔之間形成清晰沉淀線，被檢產(chǎn)品孔與抗原孔之間無(wú)沉淀線出現(xiàn)時(shí)，被檢血清判為陰性；當(dāng)被檢產(chǎn)品最高稀釋度孔與抗原孔之間形成清晰沉淀線時(shí)，即判為被檢產(chǎn)品的瓊擴(kuò)效價(jià)，小鵝瘟瓊擴(kuò)效價(jià)應(yīng)不低于1：16。

1.2.2 脂肪含量測(cè)定

用香草醛顯色法測(cè)定[13]。

1.2.3 蛋白含量測(cè)定

考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定[14]。

1.2.4 電泳分析

SDS-PAGE電泳檢查[15]、分離膠濃度12%、濃縮膠濃度5%、電壓120 V、考馬斯亮藍(lán)R-250染色。

1.2.5 IgY提取

以酸化水、辛酸-硫酸銨法提取IgY。卵黃經(jīng)酸化水稀釋除脂后，加入1.5%辛酸，攪拌混合，1 900 g離心30 min后，加入33%硫酸銨，攪拌混合，經(jīng)1 900 g離心20 min后，加入pH 7.2 PBS溶解沉淀，置4℃冰箱內(nèi)保存。

1.2.6 除脂主要影響因素

1.2.6.1 酸化水稀釋度對(duì)除脂率的影響

每組取10個(gè)雞蛋卵黃液，分別用0.12 mol·L-1醋酸鹽緩沖液作1：4～1：9共6組稀釋，調(diào)pH至5.0，4℃冰箱過(guò)夜，測(cè)定上清液中脂肪含量，計(jì)算除脂率。

1.2.6.2 酸化水pH對(duì)除脂率的影響

每組取10個(gè)雞蛋卵黃液，分別用0.12 mol·L-1醋酸鹽緩沖液作1：8稀釋，調(diào)pH至4.8、5.0、5.2、5.4共4組，4℃冰箱過(guò)夜，測(cè)定上清液中脂肪含量，計(jì)算除脂率。

1.2.6.3 酸化水作用時(shí)間對(duì)除脂率的影響

每組取10個(gè)雞蛋的卵黃液，分別用0.12 mol·L-1醋酸鹽緩沖液作1：8稀釋，調(diào)pH至5.2，置于4℃冰箱內(nèi)5、8、12、15 h，測(cè)定上清液中脂肪含量，計(jì)算除脂率。

1.2.6.4 離心條件對(duì)除脂率的影響

每組取10個(gè)雞蛋卵黃液，分別用0.12 mol·L-1醋酸鹽緩沖液作1：8稀釋，調(diào)pH至5.2，置于4℃冰箱內(nèi)15 h（過(guò)夜），1 900 g離心20、30 min；7 598 g離心20、30 min；空白作對(duì)照；測(cè)定上清液中脂肪含量，計(jì)算除脂率。

1.2.7 除脂條件對(duì)IgY提取的影響

將上述除脂主要影響因素，在相同條件下經(jīng)辛酸和硫酸銨作用，提取IgY，測(cè)定其效價(jià)、蛋白濃度及蛋白質(zhì)純度等，觀察不同除脂條件對(duì)IgY提取的影響。

1.2.8 脫脂條件優(yōu)化參數(shù)組合試驗(yàn)

取600枚高免雞蛋，分6個(gè)批次，按上述試驗(yàn)確定最優(yōu)參數(shù)組合作脫脂工藝試驗(yàn)，提取上清液，測(cè)定脂肪含量，計(jì)算除脂率、瓊擴(kuò)效價(jià)、蛋白濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)與分析

使用Excel 2007、SPSS 16.0軟件作多重比較，平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。結(jié)果數(shù)據(jù)列表中，同列肩標(biāo)大寫字母不同表示差異極顯著（P＜0.01）；小寫字母不同表示差異顯著（P＜0.05）；字母相同表示差異不顯著（P＞0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 除脂主要影響因素

2.1.1 酸化水稀釋度對(duì)除脂率的影響

比較6組不同酸化水稀釋度，根據(jù)顏色、澄清度、沉淀狀態(tài)及除脂率評(píng)價(jià)條件，隨稀釋倍數(shù)增加，上清液澄清，卵黃沉淀逐漸結(jié)實(shí)，稀釋度為1：8時(shí)，除脂率達(dá)96%以上，均一、穩(wěn)定，除脂率最高。結(jié)果如表1、圖2所示。

表1 酸化水稀釋度對(duì)除脂率的影響Table 1 Effect of acidified water dilution on lipids removal rate

2.1.2 酸化水pH對(duì)除脂率的影響

比較4組不同酸化水pH，根據(jù)顏色、澄清度、沉淀狀態(tài)及除脂率評(píng)價(jià)條件，pH為4.8時(shí)，幾乎無(wú)沉淀且渾濁，隨pH增大，上清液澄清，沉淀逐漸結(jié)實(shí)，呈膠質(zhì)狀，當(dāng)pH至5.2時(shí)，除脂率達(dá)96%以上。結(jié)果見表2。

圖2 酸化水稀釋度對(duì)除脂率的影響Fig.2 Effect of acidified water dilution on degreasing rate

表2 酸化水pH對(duì)除脂率的影響Table 2 Effect of acified water pH on degreasing rate

2.1.3 酸化水作用時(shí)間對(duì)除脂率的影響

4℃作用5、8、12、15 h，除脂率無(wú)明顯差異，均達(dá)96%以上，但卵黃沉淀隨著作用時(shí)間增加，沉淀密度增加且無(wú)流動(dòng)性，傾倒未隨上清液流出，結(jié)合規(guī)模化生產(chǎn)15 h為最優(yōu)時(shí)間。結(jié)果如表3所示。

表3 酸化水作用時(shí)間對(duì)除脂率的影響Table 3 Effect of action time of acidified water on degreasing rate

2.1.4 離心條件對(duì)除脂率的影響

比較上清液未離心、離心力1 900 g、7 598 g，在不同離心時(shí)間下除脂率，無(wú)明顯差異，其中以離心力1 900 g，20 min除脂率最高，達(dá)96.91%，結(jié)果如表4所示。

2.2 除脂條件對(duì)IgY提取的影響

2.2.1 酸化水稀釋度對(duì)IgY提取的影響

不同稀釋度水脫脂后，經(jīng)辛酸和硫酸銨作用，提取IgY作瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)，測(cè)定AGP，效價(jià)值為64、128倍。蛋白質(zhì)含量和純度存在差異，稀釋度1：5和1：8組蛋白質(zhì)含量與其他組存在差異，提取IgY含量高，但1：5稀釋度AGP效價(jià)比1：8低，稀釋度1：8時(shí)為最優(yōu)稀釋度。結(jié)果見表5、圖3。

2.2.2 酸化水pH對(duì)IgY提取的影響

卵黃液經(jīng)不同pH脫脂后，測(cè)定提取IgY瓊擴(kuò)效價(jià)，達(dá)到64、128倍。隨pH升高蛋白質(zhì)純度增高，但差異不顯著，pH 5.2時(shí)蛋白濃度略高，為最優(yōu)pH，結(jié)果見表6、圖4。

2.2.3 酸化水作用時(shí)間對(duì)IgY提取的影響

四種時(shí)間作用脫脂后，測(cè)定提取IgY瓊擴(kuò)效價(jià)，達(dá)到64、128倍，蛋白質(zhì)含量5 h為19.79 mg·mL-1、8 h為20.90 mg· mL-1、12 h為20.10 mg· mL-1、15 h為20.16 mg·mL-1，差異不顯著，結(jié)果見表7。

2.2.4 離心條件對(duì)IgY提取的影響

取雞卵黃，用醋酸鹽緩沖液1：8稀釋后，調(diào)pH5.2，置4℃過(guò)夜，取200mL卵黃液經(jīng)不同離心條件脫脂后，提取IgY，結(jié)果顯示離心力為1900g，離心20 min時(shí)，提取數(shù)量最多，且蛋白濃度最高，瓊擴(kuò)效價(jià)無(wú)差異。結(jié)果見表8。

表4 離心條件對(duì)除脂率的影響Table 4 Effects of centrifugal conditions on degreasing rate

表5 酸化水稀釋度對(duì)IgY提取的影響Table 5 Effect of acidified water dilution on IgY extraction

圖3 酸化水稀釋度對(duì)提取IgY影響電泳Fig.3 Electrophoresis image of the effect of acidified water dilution on the extraction of IgY

2.3 脫脂條件優(yōu)化參數(shù)組合試驗(yàn)驗(yàn)證

取600枚高免雞蛋，分為6個(gè)批次，按上述試驗(yàn)確定最優(yōu)參數(shù)組合，酸化水1：8稀釋、pH 5.2、4℃存放15 h，1 900 g離心20 min作脫脂試驗(yàn)，結(jié)果顯示瓊擴(kuò)效價(jià)均達(dá)1：64以上，蛋白濃度達(dá)19 mg·mL-1以上，除脂率超過(guò)96%。結(jié)果見表9。

表6 酸化水pH對(duì)IgY提取的影響Table 6 Effect of acified water pH on IgY extraction

圖4 酸化水pH對(duì)IgY提取的影響電泳Fig.4 Electrophoresis image of the effect of pH of acified water on IgY extraction

表7 酸化水作用時(shí)間對(duì)IgY提取的影響Table 7 Effect of storage time of acidified water on IgY extraction

表8 離心條件對(duì)IgY提取的影響Table 8 Effect of centrifugal conditions on IgY extractionn

表9 脫脂條件優(yōu)化參數(shù)組合試驗(yàn)Table 9 Combination test of skim condition optimization parameters

3 討論與結(jié)論

3.1 除脂主要影響因素

卵黃脫脂研究國(guó)外起步較早、相對(duì)成熟，如PEG法及其改進(jìn)方法（1980和1985）、氯仿-PEG法（1984）、硫酸葡聚糖法（1981）和水稀釋法等[16]。國(guó)內(nèi)研究中，柴家前提出甲醛脫脂法，添加0.3%～1.2%甲醛溶液[17]；常維山提出苯酚脫脂法，采用2%～3%純苯酚溶液[18]；王輝龍等研究聚乙二醇一步沉淀提取法[19]；楊嚴(yán)俊等利用高分子膠結(jié)合超濾技術(shù)[20]。以上方法普遍存在成本高、產(chǎn)量低、抗體純度低、效價(jià)低等缺點(diǎn)，小鵝瘟抗體使用效果較差。本試驗(yàn)運(yùn)用相似相溶原理，探討稀釋度、酸堿度、存放時(shí)間和離心條件4個(gè)因素對(duì)卵黃除脂的影響。將卵黃混勻于水中，使脂蛋白聚集沉淀或離心分離，獲得含IgY上清液。醋酸鹽緩沖液作1：4～1：9稀釋卵黃，共6個(gè)稀釋度，調(diào)pH 5.2，置于4℃冰箱內(nèi)15 h。上清液顏色由黃逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槿榘咨蓾嶙兦?，上清液增多，沉淀部分密?shí)。1：7以上的3個(gè)稀釋度除脂率可達(dá)96%以上，本研究增加1：4、1：9兩組試驗(yàn)，差異顯著，說(shuō)明醋酸鹽緩沖液稀釋倍數(shù)對(duì)除脂率影響顯著，其中1：8稀釋度除脂效果最佳，且IgY含量與瓊擴(kuò)效價(jià)最理想，因此作為酸化水除脂的稀釋度。

用水稀釋卵黃后，稀釋液pH顯著影響除脂和IgY提取效果。pH 4.8時(shí)，上清液渾濁，沉淀松散，隨pH升高，上清液逐漸澄清，沉淀密實(shí)，呈膠體狀，除脂率升高。當(dāng)pH升至5.2時(shí)，除脂率達(dá)96%以上。Akita等研究表明，酸度影響卵黃漿液中脂類含量，pH 4.6～5.2時(shí)，水溶液中幾乎無(wú)脂類物質(zhì)，pH繼續(xù)增加，水溶性脂類含量增加，可能是酸度升高影響脂肪去除[21]。為此，將卵黃液pH調(diào)至5.2，除脂率和IgY提取效果較好。

卵黃液1：8稀釋后，pH 5.2，不同時(shí)間除脂效果基本相同，存放5 h除脂率較大，在工廠化前提下，考慮大量提取的實(shí)際情況，選用存放15 h（過(guò)夜），沉淀較密實(shí)且呈膠體狀，保證除脂效果。

以酸化水除脂時(shí)，卵黃作1：8稀釋，pH 5.2，經(jīng)15 h作用后，上清液較為澄清，脂蛋白沉淀密實(shí)。比較離心力1 900 g、7 598 g與未離心處理，未離心上清液量較少，除脂率略低。為此，在保證除脂效果及IgY提取量、純度情況下，采用1 900 g離心20 min方法，但工業(yè)化生產(chǎn)中對(duì)離心設(shè)備容量、安全性、電力及人工成本要求較高，未來(lái)將進(jìn)一步考慮調(diào)整工藝參數(shù)，達(dá)到工業(yè)化標(biāo)準(zhǔn)。酸化水具有操作簡(jiǎn)便、成本低廉、除脂效果好等優(yōu)點(diǎn)，但提取液中仍有脂類與蛋白結(jié)合，存在微量非目的蛋白，提高提取IgY純度尚待深入研究。

3.2 除脂條件對(duì)IgY提取質(zhì)量的影響因素分析

氯仿、苯酚、辛酸等有機(jī)溶劑抽提沉淀法及Kim與Hatta等利用非離子型表面活性劑原理[7-8]，使卵黃脂類互相凝結(jié)，發(fā)生沉淀，實(shí)現(xiàn)脂水分離。但濃度過(guò)高時(shí)，破壞抗體蛋白水化膜使之發(fā)生沉淀，影響抗體效價(jià)[9-10]。本試驗(yàn)中稀釋度、酸堿度、存放時(shí)間和離心條件4個(gè)因素是制約去除IgY中脂類重要因素。在稀釋度試驗(yàn)中，瓊擴(kuò)效價(jià)及蛋白濃度呈先升后降趨勢(shì)，雖然1：6、1：7、1：8稀釋度蛋白含量較高，結(jié)合除脂率影響故選擇1：8稀釋倍數(shù)，但酸化水稀釋度對(duì)提取IgY影響的電泳圖中可見其他條帶，說(shuō)明存在雜蛋白，應(yīng)考慮進(jìn)一步去除。

在酸化水pH對(duì)IgY提取的影響試驗(yàn)中，pH 5.2可得到較高蛋白含量，但電泳圖上可觀察雞免疫球蛋白分子質(zhì)量67 ku左右重鏈、分子質(zhì)量為22 ku左右輕鏈和分子質(zhì)量為45 ku、35 ku電泳條帶，為雜蛋白條帶。蛋白含量高可由雜蛋白引起，需進(jìn)一步提純分析。酸化水作用時(shí)間對(duì)IgY提取試驗(yàn)中各組瓊脂擴(kuò)散效價(jià)及蛋白濃度并無(wú)顯著差異，結(jié)合除脂率及工業(yè)化生產(chǎn)需要，選擇人力、電力較為經(jīng)濟(jì)的15 h（過(guò)夜）工藝方法，方便生產(chǎn)轉(zhuǎn)化。酸化水離心條件對(duì)IgY提取試驗(yàn)中，未離心試驗(yàn)組獲得目的蛋白含量較低，可能是無(wú)外力作用下目的蛋白較少，但此方法對(duì)設(shè)備、人力要求不高，瓊脂擴(kuò)散效價(jià)無(wú)差異，但獲得IgY純度略低。因此，考慮除脂工藝時(shí)應(yīng)結(jié)合除脂率綜合評(píng)定蛋白含量及瓊脂擴(kuò)散效價(jià)。