李德山，張 旭，劉云野，田貴游，孫 田，安 瑩，陳 睿

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

肺癌在惡性腫瘤中發(fā)病率和致死率較高，治療途徑一般為手術(shù)切除、放化療等，費用昂貴且副作用大、易復(fù)發(fā)[1]。目前應(yīng)用于臨床治療的病毒主要有腺病毒、單純皰疹病毒、麻疹病毒、牛痘病毒、呼腸孤病毒和新城疫病毒等[2-3]，其中新城疫病毒為禽類病毒，其他病毒均可感染人類，具有潛在風(fēng)險，如少數(shù)人感染呼腸孤病毒后造成呼吸道和胃腸道疾病[4]。Vigil等研究表明新城疫病毒在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞內(nèi)增殖能力是正常細(xì)胞一萬倍以上[5]。Schirrmacher等將NDV-Ulster感染腫瘤細(xì)胞后制成腫瘤疫苗注射人體，結(jié)果表明新城疫不感染正常細(xì)胞，僅在腫瘤細(xì)胞中繁殖[6]。因此，新城疫病毒治療肺癌靶向性和安全性良好。隨著反向遺傳操作技術(shù)不斷成熟，可將RNA病毒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，在cDNA上改造病毒基因組，組合成活力病毒[7]。Peeters等利用該技術(shù)成功拯救出兩種新城疫病毒毒株[8]。Vigil等通過重組新城疫病毒分別表達(dá)外源因子IL2、TNF-α、GM-CSF和IFN-γ，結(jié)果表明重組新城疫病毒表達(dá)外源基因GM-CSF、TNF-α和IFN-γ組與空白對照組無顯著差異，而重組新城疫病毒表達(dá)外源基因IL2與其他組相比，腫瘤體積明顯減小，同時小鼠存活率顯著改善[9]。為篩選一株先導(dǎo)病毒治療肺癌，本文通過反向遺傳操作技術(shù)重組新城疫病毒rClone30-IL2、rClone30-P53和rClone30-P53-IL2，比較體內(nèi)和體外抑瘤試驗，為重組新城疫病毒用于肺癌臨床治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和質(zhì)粒

雞胚成纖維細(xì)胞DF-1、幼倉鼠腎傳代細(xì)胞株BHK-21和Lewis肺癌細(xì)胞購自ATCC。Clone30基因組pBrClone30-IL2、pBrClone30-P53、pBrClone30-P53-IL2，輔助質(zhì)粒pTM-N，pTM-P，pTM-L均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生物制藥教研室保存。

1.2 培養(yǎng)基及主要生化試劑

逆轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV），RNaseA，RNA提取試劑Trizol均購自Promega公司。限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、rTaqDNA酶、dNTP、Oligo（dT）18購自NEB公司。

新生牛血清（NCS）、胎牛血清（FBS）購自Hyclone公司。氨芐青霉素、硫酸鏈霉素購自Amersham Pharmacia Biotech公司。F12培養(yǎng)基、高糖DMEM培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基購自GIBCO公司。轉(zhuǎn)染試劑Lipofectmine 2000購自Invitrogen公司。

1.3 試驗動物

SPF雞胚、雞血購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所。C57BL/6小鼠，6周齡，購自北京維通利華實驗動物中心。

1.4 引物

鑒定重組病毒引物由TaKaRa公司合成。

Prime1：CCGCAGACCCAAGGTCCAACTCTCC

Prime2：GTCCTAGATGAGTCCATCTTGGCAC

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)

1.5.1 細(xì)胞復(fù)蘇

將保存于液氮罐中BHK-21細(xì)胞取出并迅速放置于37℃恒溫水浴鍋中，水浴過程不斷震蕩使之受熱均勻，直至凍存管內(nèi)液體融化。75%酒精棉擦拭凍存管表面，放置于無菌操作臺，移液器將細(xì)胞移入15 mL無菌離心管中，加入5 mL提前預(yù)熱的完全培養(yǎng)基混勻細(xì)胞，放置于離心機中，1 000 r·min-1離心5 min。離心后，再用75%酒精消毒，置于無菌操作臺中。吸出上清液，加入少量細(xì)胞培養(yǎng)液混合均勻，以5～10倍稀釋比例稀釋細(xì)胞，隨后將稀釋后的細(xì)胞移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，BHK-21細(xì)胞放置于5%CO2的CO2培養(yǎng)箱中，37℃飽和濕度條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)基成分為10%新生牛血清，高糖DMEM培養(yǎng)基，青霉素100 U·mL-1，鏈霉素100 μg · mL-1。

1.5.2 細(xì)胞傳代

顯微鏡觀察細(xì)胞生長狀況，當(dāng)細(xì)胞間緊密接觸時，作細(xì)胞傳代。在無菌操作臺中吸取培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液，用高溫高壓滅菌PBS鹽溶液沖洗剩余培養(yǎng)液，加入0.25%胰蛋白酶溶液1 mL，置于37℃，CO2培養(yǎng)箱中胰蛋白酶消化3 min，顯微鏡下觀察。當(dāng)細(xì)胞間分離呈圓形時，將培養(yǎng)瓶置于無菌操作臺，吸取胰蛋白酶溶液，加入新鮮培養(yǎng)液。吸管吸取培養(yǎng)液，將細(xì)胞吹打成細(xì)胞懸液。再次加入新鮮細(xì)胞培養(yǎng)，按照3～5倍比例稀釋細(xì)胞，接種于新培養(yǎng)瓶，置于5%CO2培養(yǎng)箱，37℃飽和濕度條件下培養(yǎng)，至細(xì)胞生長對數(shù)期用于試驗。

1.6 重組新城疫病毒拯救

按照Fastfilter Endo-Free Plasmid Maxi Kit說明書提取質(zhì)粒pBrClone30-IL2、pBrClone30-P53、pBrClone-30-P53-IL2和3種輔助質(zhì)粒pTM1-NP、pTM1-P、pTM1-L。

用G418隔代篩選BHK-21細(xì)胞，將培養(yǎng)至對數(shù)生長期細(xì)胞用含EDTA胰蛋白酶消化并收集，接種于六孔板內(nèi)，待細(xì)胞生長至六孔板面積的70%～80%時，Lipofectmine 2000轉(zhuǎn)染試劑，共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞。按照Invitrogen轉(zhuǎn)染試劑盒說明書，首先用Opti-MEM（無血清培養(yǎng)基）洗滌2次，將提出質(zhì)粒pTM-NP、pTM-P、pTM-L和 pBrClone30-IL2、pBrClone30-P53、pBrClone30-P53-IL2 分別取0.5、0.25、0.1 和 1 μg與 250 μL Opti-MEM 混勻，置于室溫靜置5 min，記作甲液。取10 μL Lipofectamin 2000與240 μL Opti-MEM混勻，置于室溫靜置5 min，記作乙液。甲乙混合，置于室溫20 min。轉(zhuǎn)染前，PBS清洗細(xì)胞單層1次，加入1mLOpi-MEM培養(yǎng)基。將轉(zhuǎn)染液緩慢滴入細(xì)胞單層。轉(zhuǎn)染6 h后棄去培養(yǎng)液，用含有10%DMSO的PBS液休克細(xì)胞2.5 min，加入完全DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，取出6孔板細(xì)胞凍存于-80℃冰箱，反復(fù)凍融3次，4℃低速（1 500 r·min-1）離心10 min，收集上清，取200 μL接種于8～9日齡SPF雞胚中，72 h后，收獲雞胚中尿囊液，作常規(guī)血凝（HA）試驗和血凝抑制（HI）試驗。收獲陽性尿囊液并于-80℃冰箱凍存。拯救成功的病毒分別命名為rClone30-IL2、rClone30-P53和rClone30-P53-IL2。

1.7 重組新城疫病毒鑒定與檢測

1.7.1 拯救后重組新城疫病毒RT-PCR鑒定

將成功拯救獲得的重組新城疫病毒rClone30-IL2、rClone30-P53和rClone30-P53-IL2，用TRIzol法提取重組新城疫病毒總RNA，反轉(zhuǎn)錄引物獲得重組新城疫病毒cDNA樣品。

在病毒P和M位點之間插入目的基因位點上游和下游設(shè)計引物，命名為Primer1和Premier2，將獲得重組新城疫病毒反轉(zhuǎn)錄得到cDNA分別以Primer1和Premier2為引物擴增，然后連入pMD18-T載體并送公司測序。

1.7.2 新城疫病毒在DF-1細(xì)胞增殖能力檢測

DF-1細(xì)胞復(fù)蘇與傳代方法同1.5.1與1.5.2。DF-1細(xì)胞生長條件為高糖DMEM培養(yǎng)基，10%胎牛血清，青霉素100 U ·mL-1，鏈霉素100 μg· mL-1，37℃、5%CO2，飽和濕度條件下培養(yǎng)。

將處于對數(shù)生長期雞成纖維細(xì)胞DF-1接于96孔板，每個培養(yǎng)孔加入100 μL細(xì)胞懸液，使細(xì)胞量達(dá)到2～3×105個·mL-1。將重組新城疫病毒分別用基本培養(yǎng)基10倍倍比稀釋，接入孔內(nèi)與細(xì)胞孵育，每個稀釋度接12個孔，每孔接種100 μL病毒懸液。感染細(xì)胞1h后，吸去液體并加入200 μL完全DMEM培養(yǎng)基，設(shè)不加病毒的正常細(xì)胞對照組，作兩排對照（100 μL生長液+100 μL細(xì)胞懸液）。72 h觀察并記錄每一稀釋度發(fā)生細(xì)胞病變孔數(shù)量，按Reed-Muench兩氏法計算半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物感染量（TCID50）。

Reed-Muench兩氏法計算公式：

距離比例=（高于50%病變率的百分?jǐn)?shù)-50%）/（高于50%病變率的百分?jǐn)?shù)-低于50%病變率的百分?jǐn)?shù)）；

LgTCID50=距離比例×稀釋度對數(shù)差+高于50%病變率稀釋度對數(shù)。

1.7.3 新城疫病毒雞胚穩(wěn)定性檢測

拯救后的重組新城疫病毒接種于SPF雞胚尿囊液，連續(xù)傳代10次。取1、3、5、7、9代病毒尿囊液測定病毒TCID50。

1.7.4 傳代后重組新城疫病毒RT-PCR鑒定

將成功拯救獲得rClone30-IL2、rClone30-P53和rClone30-P53-IL2經(jīng)SPF雞胚傳代10次后，用TRIzol法提取重組新城疫病毒總RNA，反轉(zhuǎn)錄引物獲得重組新城疫病毒cDNA樣品。將獲得重組新城疫病毒反轉(zhuǎn)錄得到cDNA分別以Primer1和Premier2為引物擴增，連入pMD18-T載體并送公司測序。

1.8 MTT法測定重組新城疫病毒對LLC肺癌細(xì)胞抑制作用

LLC肺癌細(xì)胞（Lewis鼠源性肺癌細(xì)胞）復(fù)蘇與傳代方法同1.5.1與1.5.2。LLC細(xì)胞生長條件為高糖DMEM培養(yǎng)基，10%胎牛血清，青霉素100 U·mL-1，鏈霉素100 μg·mL-1，37 ℃、5%CO2，飽和濕度條件下培養(yǎng)。

培養(yǎng)LLC（Lewis鼠源性肺癌細(xì)胞）腫瘤細(xì)胞至對數(shù)生長期，胰蛋白酶消化后收集，制備1×104個·mL-1細(xì)胞懸液，混合均勻后加入96孔板，每孔加200 μL癌細(xì)胞懸液，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)過夜，吸去培養(yǎng)基，PBS磷酸緩沖液洗滌1次，分為4組（rClone30-IL2、rClone30-P53、rClone30-P53-IL2和rClone30），每組實驗孔分別加入0.1MOI、1MOI、10MOI重組新城疫病毒，對照孔加入等體積DMEM。48 h后每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg·mL-1），孵育4 h后，移液器吸去培養(yǎng)液，每孔加入200 μL DMSO，輕微震蕩10 min后，酶聯(lián)免疫儀檢測OD值，波長設(shè)定為490 nm。

癌細(xì)胞生長抑制率由下式計算：

抑制率%=（對照組OD均值-給藥組OD值）/對照組OD均值×100%

1.9 LLC肺癌荷瘤小鼠模型建立

培養(yǎng)LLC肺癌細(xì)胞，顯微鏡觀察細(xì)胞生長狀況，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞與細(xì)胞間緊密接觸時，吸取培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液，PBS磷酸緩沖溶液沖洗培養(yǎng)瓶，向培養(yǎng)瓶中加入0.25%胰蛋白酶溶液1 mL，置于37℃，CO2培養(yǎng)箱中消化約3 min，顯微鏡下觀察。當(dāng)細(xì)胞間分離呈圓形時，吸取胰蛋白酶溶液，加入新鮮培養(yǎng)液。吸管吸取培養(yǎng)液，反復(fù)吸打培養(yǎng)瓶壁上細(xì)胞成細(xì)胞懸液，計數(shù)后，培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為107個·mL-1備用。每只小鼠右側(cè)腋下皮下注入劑量0.2 mL，約含2×106個腫瘤細(xì)胞，7～10 d后，挑選腫瘤直徑5～6 mm小鼠用于分組治療。

1.1 0 重組新城疫病毒對肺癌動物模型瘤體積抑制

將造模成功C57BL/6荷瘤小鼠除去形態(tài)、體重差異較大個體，剩余荷瘤小鼠按體重、瘤體積平均分配原則，每組8只。隨機分為5組，分別為尿囊液對照組、rClone30組、rClone30-IL2組、rClone30-P53組和rClone30-P53-IL2組。試驗組每2 d瘤內(nèi)注射0.2 mL約107pfu的重組病毒，連續(xù)4次。尿囊液對照組每2 d瘤內(nèi)注射與重組病毒等體積囊液，連續(xù)4次。

腫瘤體積計算公式如下：

1.1 1 生存率統(tǒng)計

經(jīng)4次重組病毒治療后，開展為期120 d存活觀察，每隔5 d記錄小鼠存活率情況，同時測量腫瘤體積，若腫瘤直徑大于18mm，將小鼠安樂死。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組新城疫病毒基因組結(jié)構(gòu)

重組新城疫病毒rClone30-IL2、rClone30-P53和pBrClone30-P53-IL2基因組結(jié)構(gòu)如圖1所示。

2.2 重組新城疫病毒拯救

pBrClone30-IL2、pBrClone30-P53、pBrClone30-P53-IL2重組質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒pTM1-N、pTM1-P、pTM1-L共同轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞。轉(zhuǎn)染72 h后，收獲轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清，在-80℃冰箱中反復(fù)凍融3次，然后接種于8～9日齡SPF級別雞胚中，置于37℃孵化器內(nèi)培養(yǎng)。72 h后，無菌條件下收獲雞胚尿囊液，通過血凝（HA）試驗，血凝抑制（HI）試驗檢測后，取陽性結(jié)果尿囊液用雞胚連續(xù)傳代3次，經(jīng)雞血紅細(xì)胞凝集檢測。

結(jié)果顯示rClone30-IL2血凝效價為211，血凝抑制效價為29；rClone30-P53血凝效價為29，血凝抑制效價為28；rClone30-P53-IL2血凝效價為210，血凝抑制效價為28。如圖2所示。

2.3 拯救后的重組新城疫病毒RT-PCR鑒定

拯救感染性重組病毒rClone30-IL2、rClone30-P53和rClone30-P53-IL2經(jīng)SPF雞胚傳代后，用TRIzol法提取重組新城疫病毒總RNA，反轉(zhuǎn)錄引物獲得重組新城疫病毒cDNA樣品，用病毒P和M位點基因上下游引物擴增目的基因，連入pMD18-T載體并送公司測序。測序結(jié)果經(jīng)DNAMAN軟件比對，證明拯救后重組新城疫病毒外源基因IL-2、P53、P53-IL2成功插入NDV基因組P和M基因之間，插入基因無突變。

2.4 重組新城疫病毒在DF-1細(xì)胞中增殖能力檢測

圖1 重組新城疫病毒的基因組結(jié)構(gòu)Fig.1 Genome structure of recombinant Newcastle disease virus

圖2 重組新城疫病毒血凝（HA）試驗（A）和血凝抑制（HI）試驗（B）Fig.2 Hemagglutination（HA）test（A）and Hemagglutination（HI）test（B）for recombinant Newcastle disease virus

將培養(yǎng)到對數(shù)期DF-1細(xì)胞，接入6孔板，待細(xì)胞生長至六孔板面積的70%～80%，將重組新城疫病毒經(jīng)培養(yǎng)液稀釋，每孔加入1 MOI重組新城疫病毒與細(xì)胞孵育，感染后分別在24、48、72和96 h，收獲細(xì)胞上清。將DF-1細(xì)胞接96孔板，各時間點收集含有重組病毒上清，以10倍倍比稀釋方式加入孔內(nèi)與細(xì)胞孵育，每個稀釋度接12個孔。72 h后顯微鏡觀察DF-1細(xì)胞病變情況，按公式計算TCID50，試驗設(shè)置3次重復(fù)，插入外源基因病毒在DF-1細(xì)胞增殖能力良好，未受影響。如圖3所示。

2.5 重組新城疫病毒雞胚增殖穩(wěn)定性檢測

為驗證重組病毒增殖穩(wěn)定性，將重組新城疫病毒在雞胚尿囊腔接種連續(xù)傳代。每次接種72 h后收獲雞胚尿囊液，測定HA效價，結(jié)果顯示HA價分別介于28～211。將各代次雞胚尿囊液分別作連續(xù)10倍倍比稀釋，100 μL體積接種96孔板培養(yǎng)雞胚成纖維細(xì)胞（DF-1），48 h后顯微鏡觀察細(xì)胞病變情況，計算TCID50。

圖3 重組新城疫病毒在DF-1細(xì)胞內(nèi)增殖能力檢測Fig.3 Detection of the proliferation of the recombinant Newcastle disease virus in DF-1 cells

rClone30-IL2的TCID50介于107.3至108.4，如表1所示。rClone30-P53的TCID50介于106.8至107.6，如表2所示。rClone30-P53-IL2的TCID50介于105.5至106.9，如表3所示。

表1 重組新城疫病毒rClone30-IL2在SPF雞胚中穩(wěn)定增殖能力檢測Table 1 Identification of the proliferation of rClone30-IL2 ability in SPF embryo egg

表2 重組新城疫病毒rClone30-P53在SPF雞胚中穩(wěn)定增殖能力檢測Table 2 Identification of the proliferation of rClone30-P53 ability in SPF embryo egg

表3 重組新城疫病毒rClone30-P53-IL2在SPF雞胚中穩(wěn)定增殖能力檢測Table 3 Identification of the proliferation of rClone30-P53-IL2 ability in SPF embryo egg

2.6 傳代后重組新城疫病毒RT-PCR鑒定

重組病毒rClone30-IL2、rClone30-P53和rClone30-P53-IL2經(jīng)SPF雞胚傳10代后，用TRIzol法提取重組新城疫病毒總RNA，反轉(zhuǎn)錄引物獲得重組新城疫病毒cDNA樣品，用病毒P和M位點基因上下游引物擴增目的基因，連入pMD18-T載體并送公司測序。測序結(jié)果經(jīng)DNAMAN軟件比對，證明傳代后的重組新城病毒外源基因IL-2、P53、P53-IL2存在于病毒基因組P和M基因之間，無基因突變。

2.7 MTT法測定重組新城疫病毒對LLC肺癌細(xì)胞抑制作用

將培養(yǎng)到對數(shù)生長期LLC細(xì)胞制備成1×104個·mL-1細(xì)胞懸液，接到96孔板培養(yǎng)過夜，每組試驗孔分別加入0.1 MOI、1 MOI、10 MOI重組新城疫病毒感染，同時設(shè)置rClone30病毒作為對照組。感染48 h后加入MTT，孵育4 h后，移液器吸去培養(yǎng)液，每孔加入DMSO輕微震蕩，酶聯(lián)免疫儀檢測OD值，波長設(shè)定為490 nm。計算重組新城疫病毒不同MOI感染條件下腫瘤細(xì)胞抑制率。

試驗結(jié)果表明，重組新城疫病毒對腫瘤細(xì)胞抑制率成劑量依賴關(guān)系。在0.1 MOI、1 MOI和10 MOI下，rClone30-P53和rClone30-P53-IL2對LLC細(xì)胞的抑制作用與rClone30-IL2和rClone30相比差異極顯著（P＜0.01）。如圖4所示。

圖4 重組新城疫病毒在不同MOI下對LLC腫瘤細(xì)胞抑制能力Fig.4 Cytotoxicity of recombinant Newcastle disease in LLC tumor cells infected with difference MOIs

2.8 重組新城疫病毒對LLC肺癌荷瘤小鼠抑制作用

當(dāng)C57BL/6小鼠腫瘤達(dá)5～6 mm時，挑選腫瘤尺寸均一、形狀規(guī)則荷瘤小鼠分為5組，每組8只。試驗組每組小鼠注射1.0×107pfu·只-1rClone30、rClone30-IL2、rClone30-P53、rClone30-P53-IL2，對照組注射200 μL雞胚尿囊液。每2 d注射1次，共4次，隔天觀察1次，并同時測量腫瘤長徑和短徑，按照以下公式計算腫瘤體積。

比較尿囊液組、rClone30組、rClone30-P53組、rClone30-IL2組和rClone30-P53-IL2組腫瘤體積。結(jié)果顯示rClone30對腫瘤抑制效果優(yōu)于尿囊 液 對 照（P＜0.05）； rClone30-IL2、 rClone30-P53和rClone30-P53-IL2對腫瘤抑制效果顯著優(yōu)于尿囊液對照（P＜0.01）；rClone30-IL2和rClone30-P53對腫瘤抑制效果均優(yōu)于rClone30（P＜0.05）；rClone30-P53-IL2對腫瘤抑制效果優(yōu)于rClone30-IL2和rClone30-P53（P＜0.05），顯著優(yōu)于 rClone30（P＜0.01）。其中rClone30-P53-IL2對腫瘤抑制效果最佳。腫瘤體積測量結(jié)果如圖5所示，實體腫瘤照片如圖6所示。

圖5 尿囊液、rClone30、rClone30-IL2、rClone30-IL12和rClone30-P53-IL2治療腫瘤體積增長曲線Fig.5 Tumors growth cruve in allantoic Fluid,rClone30,rClone30-IL2,rClone30-IL12 and rClone30-P53-IL2 treated group

2.9 小鼠生存率曲線

圖6 尿囊液、rClone30、rClone30-P53、rClone30-IL2和rClone30-P53-IL2治療后腫瘤Fig.6 Tumor picture in allantoic fluid,rClone30,rClone30-P53,rClone30-IL2 and rClone30-P53-IL2 treated group

試驗組小鼠接受為期120d觀察，每隔2d測量一次腫瘤體積，當(dāng)小鼠腫瘤直徑＞18 mm時，將小鼠安樂死，計算各試驗組小鼠存活率。經(jīng)rClone30-P53-IL-2治療小鼠存活率最高，為90%，與其他試驗組比較，差異極顯著（P＜0.01），試驗結(jié)果見圖7。

圖7 重組病毒治療后荷瘤鼠存活率試驗Fig.7 Survival of the HCC tumor-bearing mice were sacrificed when the tumor volume developed to a significant size（diameter＞18 mm）

3 討論與結(jié)論

近年腫瘤治療新途徑有基因療法、免疫療法、病毒療法等。目前臨床和臨床前期研究的溶瘤病毒，如腺病毒、單純皰疹病毒、麻疹病毒、牛痘病毒、呼腸孤病毒均可感染人類，具有潛在返祖風(fēng)險，若患者存在中和抗體，僅可治療體表腫瘤。其中，新城疫病毒為禽類病毒，可侵染人體腫瘤細(xì)胞而對正常細(xì)胞無毒害作用。Bukreyev等研究表明，少數(shù)人感染新城疫病毒后，其輕微流感癥狀和結(jié)膜炎能夠自愈[10]。Cantin等研究表明，多數(shù)腫瘤細(xì)胞膜表面存在大量唾液酸，新城疫病毒HN蛋白可識別腫瘤細(xì)胞表面唾液酸受體，介導(dǎo)病毒侵染腫瘤細(xì)胞[11]。因此，新城疫病毒用于腫瘤治療靶向性和安全性良好，本研究以新城疫病毒用于腫瘤治療。

通過反向遺傳操作技術(shù)，改造新城疫病毒基因組，以病毒為載體表達(dá)抗腫瘤因子基因，增強病毒溶瘤效果。Vigil等研究表明，新城疫病毒上調(diào)腫瘤表面相關(guān)抗原，以新城疫病毒為載體表達(dá)IL2基因治療荷瘤鼠與空白對照組相比差異顯著[12]，與本研究結(jié)果一致。Fujiwara等研究表明，以腺病毒為載體表達(dá)P53基因治療肺癌，可增加腫瘤細(xì)胞P53基因表達(dá)，有效抑制腫瘤中血管生成，防止腫瘤轉(zhuǎn)移[13]。深圳賽百諾基因技術(shù)有限公司已通過重組腺病毒表達(dá)P53基因治療腫瘤。腺病毒為人類病毒，具有潛在感染風(fēng)險，本研究以禽類病毒為載體表達(dá)P53基因，在腫瘤治療中安全性高。

重組新城疫病毒在DF-1細(xì)胞中增殖能力及雞胚增殖穩(wěn)定性檢測結(jié)果表明，抗腫瘤因子基因插入未影響病毒感染天然宿主細(xì)胞能力，與Janke等研究結(jié)果一致[14]。RT-PCR結(jié)果表明，經(jīng)雞胚傳至10代以內(nèi)病毒基因均未發(fā)生突變，以新城疫病毒為載體表達(dá)抗腫瘤因子基因穩(wěn)定性良好。體外抑瘤試驗結(jié)果顯示，rClone30-P53和rClone30-P53-IL2對LLC細(xì)胞抑制作用與rClone30-IL2和rClone30相比差異極顯著（P＜0.01）。P53可上調(diào)bax表達(dá)，下調(diào)Bcl-2表達(dá)，改變線粒體外膜通透性，細(xì)胞色素C釋放線粒體，細(xì)胞發(fā)生凋亡[15]。體外抑瘤試驗結(jié)果顯示，聯(lián)合表達(dá)兩種抗腫瘤因子rClone30-P53-I L2腫瘤抑制效果優(yōu)于rClone30-IL2和rClone30-P53（P＜0.05），顯著優(yōu)于rClone30（P＜0.01）。體內(nèi)與體外抑瘤試驗差異可能是IL2作為免疫活性因子，依靠刺激、活化大量效應(yīng)細(xì)胞如NK細(xì)胞、B細(xì)胞等，而非直接抑制腫瘤生長或殺傷腫瘤細(xì)胞[16]。癌癥患者經(jīng)放化療后，免疫系統(tǒng)功能下降，聯(lián)合表達(dá)兩種抗腫瘤因子rClone30-P53-IL2治療效果是否優(yōu)于單一抗腫瘤因子rClone30-P53和rClone30-IL2，有待臨床試驗進(jìn)一步探討。

綜上所述，與表達(dá)單基因重組病毒相比，表達(dá)雙基因的重組病毒抗腫瘤效果顯著，同時發(fā)揮免疫治療和細(xì)胞凋亡效果。本研究為開發(fā)有效新城疫溶瘤病毒提供思路，為篩選高效先導(dǎo)病毒用于肺癌治療奠定基礎(chǔ)。