楊青，于爽，孫晶，徐志龍，謝旭善，張偉

(青島市海慈醫(yī)療集團(tuán)，山東 青島 266033)

酒精性肝損傷是由于長期飲酒所引起的肝臟疾病，發(fā)病率逐年升高，是僅次于病毒性肝炎的第二大肝病[1]。目前，酒精性肝病的發(fā)病機(jī)制尚不明確，而且臨床用藥的治療效果并不理想。五味保肝丸(降酶丸)是青島市海慈醫(yī)療集團(tuán)傳統(tǒng)的中藥自制制劑品種(魯藥制ZBZ1077)，由五味子、丹參、山楂等五味中藥組成，具有斂陰、活血、降酶的功效，用于乙型肝炎、轉(zhuǎn)氨酶升高等病癥的治療，效果顯著。本院對五味保肝丸的前期研究表明，該制劑能夠在一定程度上減輕CCl4所致的大鼠急性肝損傷，改善肝功能[2]。為了進(jìn)一步探討五味保肝丸的降酶保肝作用，本文觀察了五味保肝丸對酒精性肝損傷小鼠的保護(hù)作用以及對肝微粒CYP450以及CYP2E1活性的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗材料

1.1.1 藥品與試劑

五味保肝丸(青島市海慈醫(yī)療集團(tuán)制劑室)；紅星二鍋頭白酒(北京紅星股份有限公司生產(chǎn)，酒精度56%)；ALT、AST試劑盒(南京建成生物研究所)； BCA試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)公司)；兔抗小鼠CYP2E1抗體、β-actin抗體、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(南京巴傲得生物科技有限公司)。

1.1.2 實(shí)驗動物

健康昆明種小鼠，雄性，體重18～20 g，共50只，購自青島市實(shí)驗動物和動物實(shí)驗中心。

1.1.3 實(shí)驗儀器

7020型全自動生化分析儀(日本日立公司)；MK3型酶標(biāo)儀(上海賽默生物科技有限公司)；FSH-Ⅱ型高速電動勻漿機(jī)(江蘇省金壇市金城國勝實(shí)驗儀器廠)；凝膠垂直電泳、蛋白轉(zhuǎn)印裝置、凝膠成像系統(tǒng)(美國伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司)。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 實(shí)驗分組及各組處理

將50只小鼠隨機(jī)分成正常對照組、模型組和五味保肝丸低、中、高3個劑量組，每組10只。正常對照組和模型組給予羧甲基纖維素鈉溶液，五味保肝丸低、中、高3個劑量組分別給予0.125、0.25、0.5 g/(kg·d)的五味保肝丸混懸液。每日灌胃給藥1次。給藥2 h后，正常對照組灌胃給予生理鹽水，其余組灌胃給予白酒(12 mL/kg)，每天一次，連續(xù)10 d。末次給藥后，小鼠自由飲水、禁食24 h后眼眶靜脈叢采血1 mL于離心管，靜置30 min，4 500 r/min離心，分離血清。取血后，將小鼠脫臼處死，迅速開腹，取出肝臟。

1.2.2 血清生化指標(biāo)的測定

按照生化測定試劑盒說明書，對小鼠血清ALT、AST含量進(jìn)行檢測。

1.2.3 小鼠肝微粒體CYP450的含量測定

式中，Y為CYP450含量， nmol/mg；A為450 nm、 490 nm波長測定值；E為CYP450的毫摩爾消光系數(shù)，91 cm2/mmol；C為稀釋后微粒體懸液蛋白質(zhì)量濃度， mg/mL；r為比色杯光徑長度， cm。

1.2.4 Western Blot法檢測小鼠肝組織CYP2E1的表達(dá)

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗數(shù)據(jù)均采用x±s表示，用SPSS 11.0軟件進(jìn)行分析，組間比較采用t檢驗，各組間數(shù)據(jù)比較采用方差分析，P<0.05 表示有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 五味保肝丸對酒精性肝損傷小鼠血清ALT、AST含量的影響

與正常對照組相比，模型組小鼠血清中ALT、AST含量顯著升高，表明酒精性肝損傷模型造模成功。五味保肝丸低、中、高劑量組均能降低肝損傷小鼠血清中ALT、AST含量，與模型組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

2.2 五味保肝丸對酒精性肝損傷小鼠肝微粒CYP450含量的影響

模型組與正常對照組相比，肝組織中肝微粒CYP450含量顯著下降。與模型組相比，五味保肝丸三個劑量組均能升高小鼠肝組織中肝微粒CYP450，且呈劑量依賴性關(guān)系，其中，五味保肝丸中、高劑量組與模型組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

2.3 五味保肝丸對酒精性肝損傷小鼠肝微粒體CYP2E1含量的影響

采用Western Blot檢測小鼠肝微粒體CYP2E1含量的變化，結(jié)果如圖1所示。小鼠灌胃給予白酒后，肝微粒體CYP2E1表達(dá)顯著增強(qiáng)，而五味保肝丸低、中、高劑量組與模型組相比，均能夠抑制肝微粒體CYP2E1的異常活化，且隨著五味保肝丸劑量增加，效果增強(qiáng)，提示五味保肝丸能夠抑制酒精誘導(dǎo)的CYP2E1表達(dá)升高。

表1 各組小鼠血清ALT、AST含量比較

注：與正常對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01。

表2 各組小鼠肝微粒體CYP450含量比較

注：與正常對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01。

1正常對照組； 2 模型組； 3 五味保肝丸低劑量組； 4 五味保肝丸中劑量組； 5 五味保肝丸高劑量組。圖1 五味保肝丸對酒精性肝損傷小鼠肝微粒體CYP2E1含量的影響Fig.1 Effect of WBW on liver microsomal CYP2E1 content in mice with alcoholic liver injury

3 討論

肝臟是機(jī)體重要的代謝器官，各種因素引起的肝損傷都會導(dǎo)致肝細(xì)胞變性、壞死或凋亡，引發(fā)后續(xù)的炎癥和纖維化病變，表現(xiàn)為脂肪肝、肝硬化、肝癌等疾病。酒精性肝損傷的發(fā)病機(jī)制尚未明確，中醫(yī)認(rèn)為其病理基礎(chǔ)為肝血瘀阻，常以疏肝清熱、活血祛瘀為主要治療原則[5]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，酒精性肝損傷與乙醇及其代謝產(chǎn)物乙醛引起的肝毒性、代謝障礙、氧化應(yīng)激、免疫反應(yīng)等多種因素有關(guān)[6-7]。

細(xì)胞色素P450(CYP450)酶系是由許多同工酶組成的微粒體混合功能氧化酶，參與多種生理性物質(zhì)、毒性致癌物以及約90%常用藥物的代謝和轉(zhuǎn)化。肝臟CYP450的酶活性下降會導(dǎo)致肝臟解毒能力降低，肝臟損害增加。CYP450基因和表型存在高度多態(tài)性，在藥物代謝作用中, 最重要的亞型有CYP3A4、CYP2D6、CYP2C9、CYP2C19、CYP2E1等[8]。

CYP2E1是CYP450的重要亞型，約占CYP450總量的7%[9]，乙醇是CYP2E1誘導(dǎo)劑，可誘導(dǎo)增加乙醛的產(chǎn)生，加速自由基生成，加重氧化損傷，代謝產(chǎn)物如丙二醛能夠誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，加重酒精性肝損傷[10-11]。實(shí)驗結(jié)果表明，不同劑量五味保肝丸能夠抑制ALT、AST水平的升高，抑制肝微粒體CYP2E1的異常活化，但明顯提高肝微粒體CYP450的酶活性，這可能是由于五味保肝丸能夠作用于肝微粒體CYP450酶系中的其他亞型，誘導(dǎo)其酶活性增加，從而引起肝微粒體CYP450總酶活性增加，增強(qiáng)肝臟解毒能力。

綜上所述，五味保肝丸對小鼠酒精性肝損傷具有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，減輕氧化損傷，抑制肝微粒體CYP2E1的異常活化，升高肝微粒體細(xì)胞色素P450水平，增強(qiáng)肝臟的解毒能力，發(fā)揮保肝降酶的作用。該研究為五味保肝丸的臨床合理用藥及藥物聯(lián)合應(yīng)用提供了進(jìn)一步的理論依據(jù)。