林增,潘天龍,吳登穎,康曉雕,蔡寧宇,潘駿
(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 創(chuàng)傷骨科,浙江 溫州 325027)
骨肉瘤是一種以高度惡性和轉(zhuǎn)移為特點(diǎn)的疾病,是青少年和青年人最常見(jiàn)的骨腫瘤之一[1]。盡管化療和外科手術(shù)治療已有一定的進(jìn)展,但其5年生存率僅為60%~70%[2]。大多數(shù)腫瘤患者的死亡原因?yàn)槟[瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[3]。通過(guò)藥物或手術(shù)的方式抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲,可以顯著地提高腫瘤患者的長(zhǎng)期生存率[4]。
目前常用的化療藥物為阿霉素、順鉑、甲氨蝶呤等,但長(zhǎng)期使用有較大的不良反應(yīng)甚至導(dǎo)致諸多并發(fā)癥[5]。紫鉚因是一種化學(xué)名為2’,3,4,4’-四羥基查爾酮(2’,3,4,4’-Tetrahydroxychalcone)的多酚類化合物,具有抗腫瘤、抗氧化及抗血管生成等多種生物活性。紫鉚因的抗腫瘤作用在多種腫瘤細(xì)胞中通過(guò)了驗(yàn)證[6-8],但是在骨肉瘤細(xì)胞方面的作用報(bào)道較少,因此本研究觀察紫鉚因?qū)侨饬黾?xì)胞凋亡和轉(zhuǎn)移的影響及其機(jī)制。
1.1 材料 U2OS骨肉瘤細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)。紫鉚因購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;CCK-8檢測(cè)試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司;Tunel試劑盒購(gòu)自瑞士Roche公司;Bax、Bcl-2、基質(zhì)金屬蛋白水解酶(matrix metallo proteinases,MMP)-2、MMP-9抗體均購(gòu)自美國(guó)CST公司;p-PI3K、p-Akt、GAPDH抗體、山羊抗兔抗體、山羊抗鼠抗體均購(gòu)自美國(guó)Bioworld公司。
1.2 方法
1.2.1 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng): U2OS骨肉瘤細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清,1%青霉素、鏈霉素雙抗的DMEM完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件為37 ℃,CO2含量為5%的恒溫培養(yǎng)箱。
1.2.2 細(xì)胞活性檢測(cè):以0、5、10、25、50和100 μmol/L紫鉚因作用于骨肉瘤細(xì)胞24 h。使用CCK-8細(xì)胞活性試劑盒檢測(cè)U2OS骨肉瘤細(xì)胞活性變化。
1.2.3 Western blot法檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá):使用0、25、50、100 μmol/L濃度的紫鉚因試劑處理U2OS骨肉瘤細(xì)胞24 h后提取細(xì)胞總蛋白,使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定總蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜,5% BSA封閉2 h,隨后加入相應(yīng)的一抗稀釋液在4 ℃搖床冰箱孵育過(guò)夜。次日使用相應(yīng)的二抗室溫?fù)u床孵育2 h,加入ECL顯影液,化學(xué)發(fā)光顯像儀上曝光分析。
1.2.4 Tunel染色檢測(cè)凋亡:以0、25、50、100 μmol/L紫鉚因處理骨肉瘤細(xì)24 h,4%多聚甲醛固定,3% H2O2封閉,1.5% TritonX-100通透。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色,37 ℃避光孵育30 min后DAPI染色60 s,PBS洗滌后使用濾紙吸干,滴加熒光防淬滅劑,透明指甲油封片,顯微鏡下觀察。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 使用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。數(shù)據(jù)以±s表示,每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)進(jìn)行3次,組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 紫鉚因?qū)2OS骨肉瘤細(xì)胞活性的影響 經(jīng)0、5、10、25、50和100 μmol/L紫鉚因處理24 h,U2OS骨肉瘤細(xì)胞活性呈劑量依賴性地下降,25、50、100 μmol/L紫鉚因處理組與0 μmol/L紫鉚因組比,細(xì)胞活性差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。
圖1 不同濃度紫鉚因?qū)2OS骨肉瘤細(xì)胞活性的影響
2.2 紫鉚因?qū)2OS骨肉瘤細(xì)胞凋亡的影響 經(jīng)25、50、100 μmol/L紫鉚因處理U2OS骨肉瘤細(xì)胞24 h后,Bcl-2相對(duì)表達(dá)量下降,Bax相對(duì)表達(dá)量升高,并呈濃度依賴性,50、100 μmol/L紫鉚因處理組與0 μmol/L紫鉚因組比,Bcl-2、Bax表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖2;U2OS骨肉瘤細(xì)胞的凋亡率隨著紫鉚因濃度的增加而增強(qiáng),50、100 μmol/L紫鉚因處理組與0 μmol/L紫鉚因組比,細(xì)胞凋亡百分比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖3-4。
2.3 紫鉚因?qū)2OS骨肉瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移作用的影響 0、25、50、100 μmol/L紫鉚因處理U2OS骨肉
圖2 不同濃度紫鉚因?qū)2OS骨肉瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
圖3 不同濃度紫鉚因?qū)2OS骨肉瘤細(xì)胞凋亡的影響(Tunel法)
圖4 不同濃度紫鉚因?qū)2OS骨肉瘤細(xì)胞凋亡百分比的影響
瘤細(xì)胞24 h后,U2OS骨肉瘤細(xì)胞中MMP-2、MMP-9的相對(duì)表達(dá)量下降,50、100 μmol/L紫鉚因處理組與0 μmol/L紫鉚因組比,MMP-2、MMP-9表達(dá)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖5。
2.4 紫鉚因?qū)2OS骨肉瘤中PI3K-Akt信號(hào)通路的影響 通過(guò)使用0、25、50、100 μmol/L紫鉚因處理U2OS骨肉瘤細(xì)胞24 h后,U2OS骨肉瘤細(xì)胞中磷酸化PI3K、Akt的相對(duì)表達(dá)量下降,50、100 μmol/L紫鉚因處理組與0 μmol/L紫鉚因組比,p-PI3K、p-Akt表達(dá)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖6。
本實(shí)驗(yàn)中,紫鉚因在濃度達(dá)到50 μmol/L以上時(shí),可呈劑量依賴性地抑制Bcl-2蛋白的表達(dá),并提高Bax蛋白的表達(dá),從而促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的凋亡反應(yīng),Tunel實(shí)驗(yàn)中陽(yáng)性細(xì)胞百分比明顯升高,起到抗腫瘤的作用。MMPs是一種通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)并降低細(xì)胞之間黏附性的蛋白水解酶。研究表明,MMP-2、MMP-9與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)系最為密切[9-10],降低腫瘤細(xì)胞中MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)水平,可以減弱腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[11-12]。在本實(shí)驗(yàn)中,紫鉚因在濃度達(dá)到50 μmol/L以上時(shí),可呈劑量依賴性地抑制MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá),進(jìn)而起到一定的抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的作用。
圖5 不同濃度紫鉚因?qū)2OS骨肉瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響
圖6 不同濃度紫鉚因?qū)2OS骨肉瘤細(xì)胞中PI3K-Akt信號(hào)通路磷酸化的影響
有研究表明,骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展涉及多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的激活或抑制,其中PI3K-Akt信號(hào)通路最具代表性[13]。在骨肉瘤患者的大多數(shù)癌細(xì)胞中,均可以發(fā)現(xiàn)PI3K-Akt信號(hào)通路的相關(guān)蛋白被大量激活[14-15]。抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)PI3K-Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的激活,可以達(dá)到促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞內(nèi)MMPs表達(dá)的作用[16]。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了骨肉瘤細(xì)胞中PI3K-Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況,結(jié)果顯示,在濃度達(dá)到50 μmol/L以上時(shí),紫鉚因呈劑量依賴性地抑制PI3K-Akt信號(hào)通路的磷酸化,表明紫鉚因可能是通過(guò)抑制PI3K-Akt信號(hào)通路的激活來(lái)發(fā)揮抗腫瘤的作用。但是否有其他的信號(hào)通路參與其中,且各種通路之間是否具有一定的交互作用,仍需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。
溫州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)2018年12期