林增，潘天龍，吳登穎，康曉雕，蔡寧宇，潘駿

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 創(chuàng)傷骨科，浙江 溫州 325027）

骨肉瘤是一種以高度惡性和轉(zhuǎn)移為特點(diǎn)的疾病，是青少年和青年人最常見(jiàn)的骨腫瘤之一[1]。盡管化療和外科手術(shù)治療已有一定的進(jìn)展，但其5年生存率僅為60%～70%[2]。大多數(shù)腫瘤患者的死亡原因?yàn)槟[瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[3]。通過(guò)藥物或手術(shù)的方式抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲，可以顯著地提高腫瘤患者的長(zhǎng)期生存率[4]。

目前常用的化療藥物為阿霉素、順鉑、甲氨蝶呤等，但長(zhǎng)期使用有較大的不良反應(yīng)甚至導(dǎo)致諸多并發(fā)癥[5]。紫鉚因是一種化學(xué)名為2’，3，4，4’-四羥基查爾酮（2’，3，4，4’-Tetrahydroxychalcone）的多酚類化合物，具有抗腫瘤、抗氧化及抗血管生成等多種生物活性。紫鉚因的抗腫瘤作用在多種腫瘤細(xì)胞中通過(guò)了驗(yàn)證[6-8]，但是在骨肉瘤細(xì)胞方面的作用報(bào)道較少，因此本研究觀察紫鉚因?qū)侨饬黾?xì)胞凋亡和轉(zhuǎn)移的影響及其機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 U2OS骨肉瘤細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)。紫鉚因購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；CCK-8檢測(cè)試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司；Tunel試劑盒購(gòu)自瑞士Roche公司；Bax、Bcl-2、基質(zhì)金屬蛋白水解酶（matrix metallo proteinases，MMP）-2、MMP-9抗體均購(gòu)自美國(guó)CST公司；p-PI3K、p-Akt、GAPDH抗體、山羊抗兔抗體、山羊抗鼠抗體均購(gòu)自美國(guó)Bioworld公司。

1.2 方法

1.2.1 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)： U2OS骨肉瘤細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清，1%青霉素、鏈霉素雙抗的DMEM完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件為37 ℃，CO2含量為5%的恒溫培養(yǎng)箱。

1.2.2 細(xì)胞活性檢測(cè)：以0、5、10、25、50和100 μmol/L紫鉚因作用于骨肉瘤細(xì)胞24 h。使用CCK-8細(xì)胞活性試劑盒檢測(cè)U2OS骨肉瘤細(xì)胞活性變化。

1.2.3 Western blot法檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)：使用0、25、50、100 μmol/L濃度的紫鉚因試劑處理U2OS骨肉瘤細(xì)胞24 h后提取細(xì)胞總蛋白，使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定總蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，5% BSA封閉2 h，隨后加入相應(yīng)的一抗稀釋液在4 ℃搖床冰箱孵育過(guò)夜。次日使用相應(yīng)的二抗室溫?fù)u床孵育2 h，加入ECL顯影液，化學(xué)發(fā)光顯像儀上曝光分析。

1.2.4 Tunel染色檢測(cè)凋亡：以0、25、50、100 μmol/L紫鉚因處理骨肉瘤細(xì)24 h，4%多聚甲醛固定，3% H2O2封閉，1.5% TritonX-100通透。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色，37 ℃避光孵育30 min后DAPI染色60 s，PBS洗滌后使用濾紙吸干，滴加熒光防淬滅劑，透明指甲油封片，顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 使用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。數(shù)據(jù)以±s表示，每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)進(jìn)行3次，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紫鉚因?qū)2OS骨肉瘤細(xì)胞活性的影響 經(jīng)0、5、10、25、50和100 μmol/L紫鉚因處理24 h，U2OS骨肉瘤細(xì)胞活性呈劑量依賴性地下降，25、50、100 μmol/L紫鉚因處理組與0 μmol/L紫鉚因組比，細(xì)胞活性差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度紫鉚因?qū)2OS骨肉瘤細(xì)胞活性的影響

2.2 紫鉚因?qū)2OS骨肉瘤細(xì)胞凋亡的影響 經(jīng)25、50、100 μmol/L紫鉚因處理U2OS骨肉瘤細(xì)胞24 h后，Bcl-2相對(duì)表達(dá)量下降，Bax相對(duì)表達(dá)量升高，并呈濃度依賴性，50、100 μmol/L紫鉚因處理組與0 μmol/L紫鉚因組比，Bcl-2、Bax表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖2；U2OS骨肉瘤細(xì)胞的凋亡率隨著紫鉚因濃度的增加而增強(qiáng)，50、100 μmol/L紫鉚因處理組與0 μmol/L紫鉚因組比，細(xì)胞凋亡百分比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖3-4。

2.3 紫鉚因?qū)2OS骨肉瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移作用的影響 0、25、50、100 μmol/L紫鉚因處理U2OS骨肉

圖2 不同濃度紫鉚因?qū)2OS骨肉瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖3 不同濃度紫鉚因?qū)2OS骨肉瘤細(xì)胞凋亡的影響（Tunel法）

圖4 不同濃度紫鉚因?qū)2OS骨肉瘤細(xì)胞凋亡百分比的影響

瘤細(xì)胞24 h后，U2OS骨肉瘤細(xì)胞中MMP-2、MMP-9的相對(duì)表達(dá)量下降，50、100 μmol/L紫鉚因處理組與0 μmol/L紫鉚因組比，MMP-2、MMP-9表達(dá)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖5。

2.4 紫鉚因?qū)2OS骨肉瘤中PI3K-Akt信號(hào)通路的影響 通過(guò)使用0、25、50、100 μmol/L紫鉚因處理U2OS骨肉瘤細(xì)胞24 h后，U2OS骨肉瘤細(xì)胞中磷酸化PI3K、Akt的相對(duì)表達(dá)量下降，50、100 μmol/L紫鉚因處理組與0 μmol/L紫鉚因組比，p-PI3K、p-Akt表達(dá)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖6。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中，紫鉚因在濃度達(dá)到50 μmol/L以上時(shí)，可呈劑量依賴性地抑制Bcl-2蛋白的表達(dá)，并提高Bax蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的凋亡反應(yīng)，Tunel實(shí)驗(yàn)中陽(yáng)性細(xì)胞百分比明顯升高，起到抗腫瘤的作用。MMPs是一種通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)并降低細(xì)胞之間黏附性的蛋白水解酶。研究表明，MMP-2、MMP-9與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)系最為密切[9-10]，降低腫瘤細(xì)胞中MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)水平，可以減弱腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[11-12]。在本實(shí)驗(yàn)中，紫鉚因在濃度達(dá)到50 μmol/L以上時(shí)，可呈劑量依賴性地抑制MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)，進(jìn)而起到一定的抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的作用。

圖5 不同濃度紫鉚因?qū)2OS骨肉瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響

圖6 不同濃度紫鉚因?qū)2OS骨肉瘤細(xì)胞中PI3K-Akt信號(hào)通路磷酸化的影響

有研究表明，骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展涉及多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的激活或抑制，其中PI3K-Akt信號(hào)通路最具代表性[13]。在骨肉瘤患者的大多數(shù)癌細(xì)胞中，均可以發(fā)現(xiàn)PI3K-Akt信號(hào)通路的相關(guān)蛋白被大量激活[14-15]。抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)PI3K-Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的激活，可以達(dá)到促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞內(nèi)MMPs表達(dá)的作用[16]。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了骨肉瘤細(xì)胞中PI3K-Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，在濃度達(dá)到50 μmol/L以上時(shí)，紫鉚因呈劑量依賴性地抑制PI3K-Akt信號(hào)通路的磷酸化，表明紫鉚因可能是通過(guò)抑制PI3K-Akt信號(hào)通路的激活來(lái)發(fā)揮抗腫瘤的作用。但是否有其他的信號(hào)通路參與其中，且各種通路之間是否具有一定的交互作用，仍需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。