I型組蛋白去乙?；敢种苿┰谧钄嘬浌峭嘶械淖饔?/h1>
2018-12-20 12:23:16顧霄鵬巢海潮顧岳全
溫州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報 2018年12期
顧霄鵬，巢海潮，顧岳全
（1.浙江大學(xué)舟山醫(yī)院 骨科，浙江 舟山 316101；2.江西省人民醫(yī)院 分子生物實驗室，江西 南昌330006；3.舟山顧鶴傳骨傷醫(yī)院 正骨科，浙江 舟山 316101）
關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是骨科最常見的疾病之一，也是多種骨關(guān)節(jié)疾病常見的共同病理表現(xiàn)，其發(fā)病機制復(fù)雜，治療缺乏特異并行之有效的辦法，治療效果難以把控?，F(xiàn)有研究證實OA的病因主要是軟骨細胞被破壞。軟骨破壞是基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）和聚集蛋白聚糖酶（aggrecanase，ADAMTS）家族中蛋白酶共同介導(dǎo)的結(jié)果[1]。軟骨細胞是OA關(guān)節(jié)內(nèi)MMP表達的主要來源，MMP的增多是通過組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶和組蛋白脫乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）家族中的酶催化蛋白乙酰化反應(yīng)產(chǎn)生的[2]。這些酶不僅可以調(diào)節(jié)DNA和組蛋白核小體的相互作用，同時也能使細胞核和胞質(zhì)蛋白都逆乙?；?，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能發(fā)生改變[3]。提示組蛋白乙?；揎椩贠A關(guān)節(jié)軟骨退化過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，但其具體機制不明。
本研究通過內(nèi)側(cè)半月板不穩(wěn)術(shù)（destabilization of the medial meniscus，DMM）構(gòu)建SD大鼠OA模型，選取廣譜性HDAC抑制劑曲古抑菌素A（trichostatin A，TSA）進行體內(nèi)干預(yù)，觀察TSA對軟骨退化的影響。選取TSA及選擇性HDAC抑制劑丙戊酸（valproic acid，VPA）和MS-275，并驗證各抑制劑的活性；體外培養(yǎng)人源性關(guān)節(jié)軟骨細胞（human articular chondrocyte，HACs）及軟骨肉瘤細胞SW-1353，采用以上HDAC抑制劑及I型HDAC各亞型特異性siRNA，并結(jié)合MMP誘導(dǎo)劑白細胞介素-1α（IL-1α）干預(yù)，觀察各HDAC亞型抑制對細胞MMP表達的影響。進一步利用外植體軟骨退化（PNC外植體）試驗，驗證各HDAC亞型抑制劑對軟骨退化的影響。探討I型HDAC抑制劑在阻斷軟骨退化中的作用，并初步揭示其可能作用機制，為OA關(guān)節(jié)軟骨退化的治療及相關(guān)研究提供理論基礎(chǔ)和思路。
1 材料和方法
1.1 材料 SD大鼠購自長沙天勤生物技術(shù)有限公司，動物許可證號：SCXK（湘）2014-0011。HDAC抑制劑（TSA、VPA、MS-275）均購自美國圣克魯斯生物技術(shù)公司。重組IL-1α和制瘤素M（oncostatin M，OSM）購自上海拜力生物科技有限公司?？箍偨M蛋白H3、抗乙?；M蛋白H3、抗總組蛋白H4和抗乙?；M蛋白H4均購自上海研生實業(yè)有限公司。抗總α-微管蛋白和抗乙?；摩?微管蛋白購自美國Abcam公司。人軟骨肉瘤細胞系SW-1353購自美國模式培養(yǎng)物集存庫。GlutaMAX和鏈霉素購自美國Gibco Invitrogen公司。莫洛尼鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶購自美國Invitrogen公司。核糖核酸酶抑制劑購自美國Promega公司。
1.2 方法
1.2.1 OA模型制備及TSA干預(yù)：10只9周齡大小的SD大鼠在正常飲食標(biāo)準(zhǔn)籠中飼養(yǎng)，隨機分為2組，手術(shù)組和假手術(shù)組，每組5只。手術(shù)組大鼠行DMM，構(gòu)建OA模型[4]；假手術(shù)組大鼠亦行手術(shù)干預(yù)，但不破壞內(nèi)側(cè)半月板穩(wěn)定性，其他均同手術(shù)組。術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)大鼠，并以1 mg·kg-1·d-1的TSA劑量全身給藥，給藥途徑為皮下植入滲透泵注入。8周后處死大鼠，對其膝關(guān)節(jié)行組織學(xué)檢查和評估。
1.2.2 細胞培養(yǎng)：從舟山顧鶴傳骨傷醫(yī)院骨科收治的并接受膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)的OA患者中提取HACs，這一試驗獲舟山顧鶴傳骨傷醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，并經(jīng)患者簽署知情同意書。HACs及人軟骨肉瘤細胞系SW-1353分別在含有10%胎牛血清的GlutaMAX培養(yǎng)基及DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基中常規(guī)加100 IU/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2、恒濕培養(yǎng)箱。
1.2.3 Western blot檢測核心組蛋白（H3、H4）和α-微管蛋白乙酰化水平：SW-1353細胞鋪于6孔板（1.5×105細胞/孔）并黏附過夜，隨后去血清饑餓12 h，再分別行不同濃度的TSA、VPA、MS-275處理6 h。其后，冰上用PBS洗滌2次，收集各組細胞，加入裂解液冰上充分裂解0.5 h，制備細胞總蛋白。采用BCA法測定各樣本蛋白濃度。按照說明書及目的蛋白分子量配置相應(yīng)濃度的SDS-PAGE電泳凝膠，其后依次進行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗（抗總組蛋白H3、抗乙?；M蛋白H3、抗總組蛋白H4和抗乙?；M蛋白H4、抗總α-微管蛋白和抗乙?；摩?微管蛋白）孵育，4 ℃搖床過夜；次日回收一抗后進行二抗孵育1 h；再用TBST洗膜5次，每次5 min；洗膜后采用ECL法顯影定影。根據(jù)各條帶灰度值，分別計算目的蛋白的相對表達量，設(shè)置3次重復(fù)實驗。
1.2.4 HDAC抑制劑干預(yù)試驗：體外培養(yǎng)SW-1353細胞系和HACs，細胞鋪于6孔板（1.5×105細胞/孔）并黏附過夜，去血清饑餓24 h。根據(jù)伴或不伴IL-1α（5 ng/mL）處理，分別加不同濃度的HDAC抑制劑（TSA、VPA及MS-275）干預(yù)進行分組，均干預(yù)處理6 h。其后，細胞在冰上用PBS洗滌2次，并用TRIzol試劑提取出各組細胞總RNA，備用。
1.2.5 siRNA特異性干擾I型HDAC各亞型的表達：體外培養(yǎng)SW-1353細胞系，細胞鋪于6孔板（1.5×105細胞/孔）并黏附過夜，去血清饑餓24 h。根據(jù)伴或不伴IL-1α（5 ng/mL）處理設(shè)置實驗組和對照組；根據(jù)I型HDAC各亞型（HDAC-1、HDAC-2、HDAC-3、HDAC-8）特異性siRNA（siH1、siH2、siH3、siH8）再進行亞分組。根據(jù)siRNA說明書進行細胞轉(zhuǎn)染，以非靶向控制的siRNA為陰性對照，所采用的引物序列見表1。細胞轉(zhuǎn)染后，通過RT-PCR驗證I型HDAC
表1 I型HDAC各亞型siRNA引物序列
表2 RT-PCR實驗中I型HDAC各亞型引物序列
1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用GraphPad Prism4.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以±s表示，2組比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析、Bonferroni校正多重比較等。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2 結(jié)果
2.1 TSA對OA關(guān)節(jié)軟骨退化的影響 通過DMM構(gòu)建SD大鼠OA模型，術(shù)后8周處死大鼠，通過組織學(xué)評分進行OA評估，結(jié)果顯示手術(shù)組OA大鼠較假手術(shù)組大鼠軟骨病變主要集中在脛骨內(nèi)側(cè)平臺的中央承重區(qū)域，較小部分在股骨內(nèi)側(cè)髁[14]，提示造模成功，符合實驗要求。以1 mg·kg-1·d-1劑量的TSA全身給藥，關(guān)節(jié)軟骨番紅O染色結(jié)果顯示：給藥干預(yù)后的OA大鼠較干預(yù)前其脛骨內(nèi)側(cè)平臺及股骨內(nèi)側(cè)髁的軟骨損傷有所減輕（見圖1A）；組織學(xué)評分結(jié)果顯示脛骨內(nèi)側(cè)平臺的軟骨損傷較干預(yù)前有所減輕，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.015），見圖1B。
2.2 Western blot檢測核心組蛋白（H3、H4）和α-微管蛋白乙酰化水平 TSA、VPA及MS-275可顯著提高核心組蛋白（H3、H4）和α-微管蛋白乙?；剑≒＜0.05），并呈濃度依賴性，即TSA、VPA及MS-275干預(yù)各亞型表達干擾情況，引物序列見表2。
1.2.6 外植體軟骨退化試驗：將軟骨盤孵育于37 ℃，5% CO2的濕潤空氣中24 h，之后將培養(yǎng)基更換為含有細胞因子和（或）HDAC抑制劑無血清DMEM，實驗重復(fù)4次。在第7天收集上清液，并且將外植體培養(yǎng)直到第14天，收集剩余的軟骨和培養(yǎng)基。剩余的軟骨外植體在65 ℃木瓜蛋白酶中消化過夜，檢測羥脯氨酸的釋放量作為膠原降解[5]的測度量，檢測糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）的釋放量作為蛋白多糖降解[6]的測度量。于當(dāng)天、第1天、第3天、第8天和第10天收集上清液和軟骨樣本，提取軟骨RNA，儲存于RNAlater置于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>
1.2.7 RNA提取及cDNA合成：使用TRIzol純化收集細胞或組織的總RNA，測定RNA濃度及純度。使用RNeasy Mini試劑盒進行cDNA合成，根據(jù)試劑盒說明合成cDNA。將合成物存儲于-20 ℃?zhèn)溆?。以cDNA為模板，PCR試劑盒說明步驟進行PCR擴增，反應(yīng)程序設(shè)定如下：預(yù)變性95 ℃ 30 s，循環(huán)參數(shù)：95 ℃30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 min，40個循環(huán)，72 ℃延伸8 min。采用相對定量2-ΔCt法計算各基因的相對表達量。濃度越高，組蛋白乙酰化水平越高，HDAC抑制劑的活性越高。見圖2。
圖1 關(guān)節(jié)軟骨番紅O染色（A）及組織學(xué)評分（B）觀察TSA對OA關(guān)節(jié)軟骨退化的影響
2.3 RT-PCR檢測MMP1及MMP13 mRNA的表達 TSA、VPA及MS-275可顯著抑制HACs細胞中IL-1α誘導(dǎo)的MMP1及MMP13 mRNA的表達（P＜0.05），并亦呈一定程度的濃度依賴性，即TSA、VPA及MS-275干預(yù)濃度越高，MMP1及MMP13 mRNA的表達越被抑制。見圖3。
2.4 采用siRNA特異性干擾I型HDAC各亞型的表達siRNA特異性干擾處理后，I型HDAC各亞型mRNA表達水平表達下調(diào)率為HDAC-1 83%，HDAC-2 89%，HDAC-3 63%，HDAC-8 77%。HDAC-1、HDAC-2基因表達被干擾后，SW-1353細胞中基礎(chǔ)的MMP13表達水平較未干擾組細胞明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖4A；HDAC-1、HDAC-2、HDAC-3及HDAC-8基因表達被干擾后，SW-1353細胞中IL-1α誘導(dǎo)的MMP13的表達水平較未干擾組細胞明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖4B。
2.5 HDAC抑制劑對OSM誘導(dǎo)的GAG和膠原蛋白產(chǎn)生的影響 以不同濃度HDAC抑制劑處理細胞，檢測GAG和膠原蛋白。結(jié)果顯示：TSA、VPA及MS-275可顯著抑制軟骨細胞中GAG和膠原蛋白的產(chǎn)生（P＜0.05），并亦呈一定程度的濃度依賴性，即TSA、VPA及MS-275干預(yù)濃度越高，其抑制作用越強。見圖5。
圖2 Western blot檢測核心組蛋白（H3、H4）和α-微管蛋白乙?；?/p>
圖3 RT-PCR檢測MMP1及MMP13 mRNA的表達
圖4 siRNA特異性干擾SW-1353細胞中I型HDAC各亞型表達對MMP13 mRNA表達的影響
圖5 HDAC抑制劑對軟骨細胞中OSM誘導(dǎo)的GAG和膠原蛋白生成的影響
3 討論
TSA為一種廣譜HDAC抑制劑，在炎癥性O(shè)A模型中具有抗關(guān)節(jié)退化作用。使用TSA干預(yù)后可觀察到動物模型關(guān)節(jié)損傷減少與細胞因子表達降低，細胞周期調(diào)節(jié)子p16INK4a和p21WAF/Cip1表達增加，這與IL-1和（或）腫瘤壞死因子α的表達減少相關(guān)[2，7]。此外，在膠原誘導(dǎo)的OA軟骨中，TSA通過差動調(diào)節(jié)Th1和Th2細胞[8]并減少關(guān)鍵MMP的表達，如MMP-3和MMP-13，阻遏疾病進展并改善疾病狀況[9]。在關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射TSA，可減少前交叉韌帶切斷的兔OA模型的關(guān)節(jié)損傷，同時伴有MMP1、MMP3、和MMP13表達降低[2]。說明HDAC抑制劑在OA關(guān)節(jié)中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。本研究通過DMM構(gòu)建SD大鼠OA模型，選取TSA進行體內(nèi)干預(yù)，觀察TSA對軟骨退化的影響；結(jié)果顯示TSA可明顯減輕OA模型SD大鼠脛骨內(nèi)側(cè)平臺及股骨內(nèi)側(cè)髁的軟骨退化程度，驗證了HDAC抑制劑在OA中具有抗軟骨退化的作用。
軟骨細胞是OA關(guān)節(jié)內(nèi)MMP表達的主要來源， MMP的增多是通過組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶和HDAC家族中的酶催化蛋白乙?；磻?yīng)產(chǎn)生的[2]。為了進一步探究HDAC抑制劑抗軟骨退化的作用機制，本研究選取廣譜HDAC抑制劑TSA及選擇性HDAC抑制劑VPA和MS-275進行干預(yù)軟骨肉瘤細胞SW-1353，采用Western blot檢測核心組蛋白（H3、H4）和α-微管蛋白乙?；?，驗證各HDAC抑制劑的活性。有研究表明，在哺乳動物膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型中，MS-275能阻止疾病進展和關(guān)節(jié)破壞[10]。然而，這個HDAC抑制劑尚未在OA的模型中進行測試。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)TSA、VPA及MS-275可顯著提高核心組蛋白（H3、H4）和α-微管蛋白乙?；剑⒊室欢ǔ潭鹊臐舛纫蕾囆?，即TSA、VPA及MS-275干預(yù)濃度越高，組蛋白乙?；皆礁?，HDAC抑制劑的活性越高。TSA可以劑量依賴性地誘導(dǎo)α-微管蛋白的乙酰化，而丙戊酸和MS-275不會，這表明只有前者能抑制軟骨細胞中HDAC-5和（或）HDAC-6的活性[11-12]，說明各HDAC抑制劑可能是通過抑制不同的HDAC亞型發(fā)揮藥理作用的。
MMP1及MMP13是人關(guān)節(jié)軟骨細胞中參與軟骨破壞的關(guān)鍵膠原酶。本研究進一步采用外源性IL-1α誘導(dǎo)HACs細胞MMP1及MMP13表達，結(jié)合不同濃度的TSA、VPA及MS-275處理，發(fā)現(xiàn)各HDAC抑制劑可顯著抑制HACs細胞中MMP1及MMP13的表達，并亦呈濃度依賴性；即TSA、VPA及MS-275干預(yù)濃度越高，MMP1及MMP13的表達越被抑制。提示各HDAC抑制劑可能是通過抑制HDAC乙?；?，減少MMP1及MMP13的表達，進而發(fā)揮保護軟骨退化的藥理作用的。
HDAC抑制劑也能調(diào)節(jié)很多軟骨基質(zhì)分子的表達，但調(diào)節(jié)機制比較復(fù)雜，因為軟骨細胞的HDAC抑制劑短期治療（＜24 h）會誘導(dǎo)基因表達的合成代謝[13]，而延長治療會抑制許多轉(zhuǎn)錄樣本[14]。早期的影響可能是HDAC抑制作用的直接后果，因為HDAC-1、HDAC-2的過表達能抑制ACAN和COL2A1的表達[13]。表明這種抑制是由HDAC的C-末端結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的。本研究采用siRNA特異性干擾I型HDAC各亞型的表達，發(fā)現(xiàn)HDAC-1、HDAC-2基因表達被干擾后，軟骨肉瘤細胞SW-1353中基礎(chǔ)的MMP13表達明顯下降；HDAC-1、HDAC-2、HDAC-3及HDAC-8基因表達被干擾后，SW-1353細胞中IL-1誘導(dǎo)的MMP13的表達水平明顯下降。提示HDAC各亞型中發(fā)揮關(guān)節(jié)炎調(diào)控作用的主要是I型。
HDAC抑制劑的軟骨保護特性，可通過在OA體內(nèi)模型中觀察到的關(guān)節(jié)損傷減少來支持，并且可作為HDAC抑制劑治療的結(jié)果[15]?，F(xiàn)鮮有明確的HDAC抑制劑介導(dǎo)的細胞因子誘導(dǎo)MMP表達的報道。雖有研究表明TSA和丁酸鈉復(fù)合物可抑制HDAC的大部分家族經(jīng)典成員（除丁酸鈉對HDAC-6外），但目前尚不明確哪種HDACs與MMP表達及OA的進展有關(guān)[16]。能有效緩解OA的治療藥物較少，疾病末期患者唯一有效的治療方法是全關(guān)節(jié)置換[17]。廣譜HDAC抑制劑的軟骨保護作用表明，經(jīng)典的HDACs在MMP表達的調(diào)
控中發(fā)揮重要作用，在OA中也可能如此。雖然廣譜HDAC抑制劑對人類的毒性作用沒有化療藥物大，但仍不適合用于治療慢性疾病[18-19]。為了表明哪種HDACs是廣譜抑制劑軟骨保護作用的主要目標(biāo)，本研究采用2種已知的選擇性抑制劑：VPA和MS-275，與TSA在細胞單層和豬的鼻軟骨外植體試驗中進行比較。結(jié)果證實I型HDAC（HDAC-1、HDAC-2、HDAC-3、HDAC-8）被抑制劑抑制或I型HDACs特異性消耗均能抑制軟骨細胞MMP1及MMP13的表達，抑制PNC外植體GAG和膠原蛋白水平，說明I型HDAC抑制劑可能是通過抑制MMP、GAG和膠原蛋白的表達而發(fā)揮對軟骨退化的保護作用。
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本研究通過內(nèi)側(cè)半月板不穩(wěn)術(shù)（destabilization of the medial meniscus，DMM）構(gòu)建SD大鼠OA模型，選取廣譜性HDAC抑制劑曲古抑菌素A（trichostatin A，TSA）進行體內(nèi)干預(yù)，觀察TSA對軟骨退化的影響。選取TSA及選擇性HDAC抑制劑丙戊酸（valproic acid，VPA）和MS-275，并驗證各抑制劑的活性；體外培養(yǎng)人源性關(guān)節(jié)軟骨細胞（human articular chondrocyte，HACs）及軟骨肉瘤細胞SW-1353，采用以上HDAC抑制劑及I型HDAC各亞型特異性siRNA，并結(jié)合MMP誘導(dǎo)劑白細胞介素-1α（IL-1α）干預(yù)，觀察各HDAC亞型抑制對細胞MMP表達的影響。進一步利用外植體軟骨退化（PNC外植體）試驗，驗證各HDAC亞型抑制劑對軟骨退化的影響。探討I型HDAC抑制劑在阻斷軟骨退化中的作用，并初步揭示其可能作用機制，為OA關(guān)節(jié)軟骨退化的治療及相關(guān)研究提供理論基礎(chǔ)和思路。
1 材料和方法
1.1 材料 SD大鼠購自長沙天勤生物技術(shù)有限公司，動物許可證號：SCXK（湘）2014-0011。HDAC抑制劑（TSA、VPA、MS-275）均購自美國圣克魯斯生物技術(shù)公司。重組IL-1α和制瘤素M（oncostatin M，OSM）購自上海拜力生物科技有限公司?？箍偨M蛋白H3、抗乙?；M蛋白H3、抗總組蛋白H4和抗乙?；M蛋白H4均購自上海研生實業(yè)有限公司。抗總α-微管蛋白和抗乙?；摩?微管蛋白購自美國Abcam公司。人軟骨肉瘤細胞系SW-1353購自美國模式培養(yǎng)物集存庫。GlutaMAX和鏈霉素購自美國Gibco Invitrogen公司。莫洛尼鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶購自美國Invitrogen公司。核糖核酸酶抑制劑購自美國Promega公司。
1.2 方法
1.2.1 OA模型制備及TSA干預(yù)：10只9周齡大小的SD大鼠在正常飲食標(biāo)準(zhǔn)籠中飼養(yǎng)，隨機分為2組，手術(shù)組和假手術(shù)組，每組5只。手術(shù)組大鼠行DMM，構(gòu)建OA模型[4]；假手術(shù)組大鼠亦行手術(shù)干預(yù)，但不破壞內(nèi)側(cè)半月板穩(wěn)定性，其他均同手術(shù)組。術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)大鼠，并以1 mg·kg-1·d-1的TSA劑量全身給藥，給藥途徑為皮下植入滲透泵注入。8周后處死大鼠，對其膝關(guān)節(jié)行組織學(xué)檢查和評估。
1.2.2 細胞培養(yǎng)：從舟山顧鶴傳骨傷醫(yī)院骨科收治的并接受膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)的OA患者中提取HACs，這一試驗獲舟山顧鶴傳骨傷醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，并經(jīng)患者簽署知情同意書。HACs及人軟骨肉瘤細胞系SW-1353分別在含有10%胎牛血清的GlutaMAX培養(yǎng)基及DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基中常規(guī)加100 IU/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2、恒濕培養(yǎng)箱。
1.2.3 Western blot檢測核心組蛋白（H3、H4）和α-微管蛋白乙酰化水平：SW-1353細胞鋪于6孔板（1.5×105細胞/孔）并黏附過夜，隨后去血清饑餓12 h，再分別行不同濃度的TSA、VPA、MS-275處理6 h。其后，冰上用PBS洗滌2次，收集各組細胞，加入裂解液冰上充分裂解0.5 h，制備細胞總蛋白。采用BCA法測定各樣本蛋白濃度。按照說明書及目的蛋白分子量配置相應(yīng)濃度的SDS-PAGE電泳凝膠，其后依次進行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗（抗總組蛋白H3、抗乙?；M蛋白H3、抗總組蛋白H4和抗乙?；M蛋白H4、抗總α-微管蛋白和抗乙?；摩?微管蛋白）孵育，4 ℃搖床過夜；次日回收一抗后進行二抗孵育1 h；再用TBST洗膜5次，每次5 min；洗膜后采用ECL法顯影定影。根據(jù)各條帶灰度值，分別計算目的蛋白的相對表達量，設(shè)置3次重復(fù)實驗。
1.2.4 HDAC抑制劑干預(yù)試驗：體外培養(yǎng)SW-1353細胞系和HACs，細胞鋪于6孔板（1.5×105細胞/孔）并黏附過夜，去血清饑餓24 h。根據(jù)伴或不伴IL-1α（5 ng/mL）處理，分別加不同濃度的HDAC抑制劑（TSA、VPA及MS-275）干預(yù)進行分組，均干預(yù)處理6 h。其后，細胞在冰上用PBS洗滌2次，并用TRIzol試劑提取出各組細胞總RNA，備用。
1.2.5 siRNA特異性干擾I型HDAC各亞型的表達：體外培養(yǎng)SW-1353細胞系，細胞鋪于6孔板（1.5×105細胞/孔）并黏附過夜，去血清饑餓24 h。根據(jù)伴或不伴IL-1α（5 ng/mL）處理設(shè)置實驗組和對照組；根據(jù)I型HDAC各亞型（HDAC-1、HDAC-2、HDAC-3、HDAC-8）特異性siRNA（siH1、siH2、siH3、siH8）再進行亞分組。根據(jù)siRNA說明書進行細胞轉(zhuǎn)染，以非靶向控制的siRNA為陰性對照，所采用的引物序列見表1。細胞轉(zhuǎn)染后，通過RT-PCR驗證I型HDAC
表1 I型HDAC各亞型siRNA引物序列
表2 RT-PCR實驗中I型HDAC各亞型引物序列
1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用GraphPad Prism4.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以±s表示，2組比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析、Bonferroni校正多重比較等。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2 結(jié)果
2.1 TSA對OA關(guān)節(jié)軟骨退化的影響 通過DMM構(gòu)建SD大鼠OA模型，術(shù)后8周處死大鼠，通過組織學(xué)評分進行OA評估，結(jié)果顯示手術(shù)組OA大鼠較假手術(shù)組大鼠軟骨病變主要集中在脛骨內(nèi)側(cè)平臺的中央承重區(qū)域，較小部分在股骨內(nèi)側(cè)髁[14]，提示造模成功，符合實驗要求。以1 mg·kg-1·d-1劑量的TSA全身給藥，關(guān)節(jié)軟骨番紅O染色結(jié)果顯示：給藥干預(yù)后的OA大鼠較干預(yù)前其脛骨內(nèi)側(cè)平臺及股骨內(nèi)側(cè)髁的軟骨損傷有所減輕（見圖1A）；組織學(xué)評分結(jié)果顯示脛骨內(nèi)側(cè)平臺的軟骨損傷較干預(yù)前有所減輕，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.015），見圖1B。
2.2 Western blot檢測核心組蛋白（H3、H4）和α-微管蛋白乙酰化水平 TSA、VPA及MS-275可顯著提高核心組蛋白（H3、H4）和α-微管蛋白乙?；剑≒＜0.05），并呈濃度依賴性，即TSA、VPA及MS-275干預(yù)各亞型表達干擾情況，引物序列見表2。
1.2.6 外植體軟骨退化試驗：將軟骨盤孵育于37 ℃，5% CO2的濕潤空氣中24 h，之后將培養(yǎng)基更換為含有細胞因子和（或）HDAC抑制劑無血清DMEM，實驗重復(fù)4次。在第7天收集上清液，并且將外植體培養(yǎng)直到第14天，收集剩余的軟骨和培養(yǎng)基。剩余的軟骨外植體在65 ℃木瓜蛋白酶中消化過夜，檢測羥脯氨酸的釋放量作為膠原降解[5]的測度量，檢測糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）的釋放量作為蛋白多糖降解[6]的測度量。于當(dāng)天、第1天、第3天、第8天和第10天收集上清液和軟骨樣本，提取軟骨RNA，儲存于RNAlater置于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>
1.2.7 RNA提取及cDNA合成：使用TRIzol純化收集細胞或組織的總RNA，測定RNA濃度及純度。使用RNeasy Mini試劑盒進行cDNA合成，根據(jù)試劑盒說明合成cDNA。將合成物存儲于-20 ℃?zhèn)溆?。以cDNA為模板，PCR試劑盒說明步驟進行PCR擴增，反應(yīng)程序設(shè)定如下：預(yù)變性95 ℃ 30 s，循環(huán)參數(shù)：95 ℃30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 min，40個循環(huán)，72 ℃延伸8 min。采用相對定量2-ΔCt法計算各基因的相對表達量。濃度越高，組蛋白乙酰化水平越高，HDAC抑制劑的活性越高。見圖2。
圖1 關(guān)節(jié)軟骨番紅O染色（A）及組織學(xué)評分（B）觀察TSA對OA關(guān)節(jié)軟骨退化的影響
2.3 RT-PCR檢測MMP1及MMP13 mRNA的表達 TSA、VPA及MS-275可顯著抑制HACs細胞中IL-1α誘導(dǎo)的MMP1及MMP13 mRNA的表達（P＜0.05），并亦呈一定程度的濃度依賴性，即TSA、VPA及MS-275干預(yù)濃度越高，MMP1及MMP13 mRNA的表達越被抑制。見圖3。
2.4 采用siRNA特異性干擾I型HDAC各亞型的表達siRNA特異性干擾處理后，I型HDAC各亞型mRNA表達水平表達下調(diào)率為HDAC-1 83%，HDAC-2 89%，HDAC-3 63%，HDAC-8 77%。HDAC-1、HDAC-2基因表達被干擾后，SW-1353細胞中基礎(chǔ)的MMP13表達水平較未干擾組細胞明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖4A；HDAC-1、HDAC-2、HDAC-3及HDAC-8基因表達被干擾后，SW-1353細胞中IL-1α誘導(dǎo)的MMP13的表達水平較未干擾組細胞明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖4B。
2.5 HDAC抑制劑對OSM誘導(dǎo)的GAG和膠原蛋白產(chǎn)生的影響 以不同濃度HDAC抑制劑處理細胞，檢測GAG和膠原蛋白。結(jié)果顯示：TSA、VPA及MS-275可顯著抑制軟骨細胞中GAG和膠原蛋白的產(chǎn)生（P＜0.05），并亦呈一定程度的濃度依賴性，即TSA、VPA及MS-275干預(yù)濃度越高，其抑制作用越強。見圖5。
圖2 Western blot檢測核心組蛋白（H3、H4）和α-微管蛋白乙?；?/p>
圖3 RT-PCR檢測MMP1及MMP13 mRNA的表達
圖4 siRNA特異性干擾SW-1353細胞中I型HDAC各亞型表達對MMP13 mRNA表達的影響
圖5 HDAC抑制劑對軟骨細胞中OSM誘導(dǎo)的GAG和膠原蛋白生成的影響
3 討論
TSA為一種廣譜HDAC抑制劑，在炎癥性O(shè)A模型中具有抗關(guān)節(jié)退化作用。使用TSA干預(yù)后可觀察到動物模型關(guān)節(jié)損傷減少與細胞因子表達降低，細胞周期調(diào)節(jié)子p16INK4a和p21WAF/Cip1表達增加，這與IL-1和（或）腫瘤壞死因子α的表達減少相關(guān)[2，7]。此外，在膠原誘導(dǎo)的OA軟骨中，TSA通過差動調(diào)節(jié)Th1和Th2細胞[8]并減少關(guān)鍵MMP的表達，如MMP-3和MMP-13，阻遏疾病進展并改善疾病狀況[9]。在關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射TSA，可減少前交叉韌帶切斷的兔OA模型的關(guān)節(jié)損傷，同時伴有MMP1、MMP3、和MMP13表達降低[2]。說明HDAC抑制劑在OA關(guān)節(jié)中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。本研究通過DMM構(gòu)建SD大鼠OA模型，選取TSA進行體內(nèi)干預(yù)，觀察TSA對軟骨退化的影響；結(jié)果顯示TSA可明顯減輕OA模型SD大鼠脛骨內(nèi)側(cè)平臺及股骨內(nèi)側(cè)髁的軟骨退化程度，驗證了HDAC抑制劑在OA中具有抗軟骨退化的作用。
軟骨細胞是OA關(guān)節(jié)內(nèi)MMP表達的主要來源， MMP的增多是通過組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶和HDAC家族中的酶催化蛋白乙?；磻?yīng)產(chǎn)生的[2]。為了進一步探究HDAC抑制劑抗軟骨退化的作用機制，本研究選取廣譜HDAC抑制劑TSA及選擇性HDAC抑制劑VPA和MS-275進行干預(yù)軟骨肉瘤細胞SW-1353，采用Western blot檢測核心組蛋白（H3、H4）和α-微管蛋白乙?；?，驗證各HDAC抑制劑的活性。有研究表明，在哺乳動物膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型中，MS-275能阻止疾病進展和關(guān)節(jié)破壞[10]。然而，這個HDAC抑制劑尚未在OA的模型中進行測試。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)TSA、VPA及MS-275可顯著提高核心組蛋白（H3、H4）和α-微管蛋白乙?；剑⒊室欢ǔ潭鹊臐舛纫蕾囆?，即TSA、VPA及MS-275干預(yù)濃度越高，組蛋白乙?；皆礁?，HDAC抑制劑的活性越高。TSA可以劑量依賴性地誘導(dǎo)α-微管蛋白的乙酰化，而丙戊酸和MS-275不會，這表明只有前者能抑制軟骨細胞中HDAC-5和（或）HDAC-6的活性[11-12]，說明各HDAC抑制劑可能是通過抑制不同的HDAC亞型發(fā)揮藥理作用的。
MMP1及MMP13是人關(guān)節(jié)軟骨細胞中參與軟骨破壞的關(guān)鍵膠原酶。本研究進一步采用外源性IL-1α誘導(dǎo)HACs細胞MMP1及MMP13表達，結(jié)合不同濃度的TSA、VPA及MS-275處理，發(fā)現(xiàn)各HDAC抑制劑可顯著抑制HACs細胞中MMP1及MMP13的表達，并亦呈濃度依賴性；即TSA、VPA及MS-275干預(yù)濃度越高，MMP1及MMP13的表達越被抑制。提示各HDAC抑制劑可能是通過抑制HDAC乙?；?，減少MMP1及MMP13的表達，進而發(fā)揮保護軟骨退化的藥理作用的。
HDAC抑制劑也能調(diào)節(jié)很多軟骨基質(zhì)分子的表達，但調(diào)節(jié)機制比較復(fù)雜，因為軟骨細胞的HDAC抑制劑短期治療（＜24 h）會誘導(dǎo)基因表達的合成代謝[13]，而延長治療會抑制許多轉(zhuǎn)錄樣本[14]。早期的影響可能是HDAC抑制作用的直接后果，因為HDAC-1、HDAC-2的過表達能抑制ACAN和COL2A1的表達[13]。表明這種抑制是由HDAC的C-末端結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的。本研究采用siRNA特異性干擾I型HDAC各亞型的表達，發(fā)現(xiàn)HDAC-1、HDAC-2基因表達被干擾后，軟骨肉瘤細胞SW-1353中基礎(chǔ)的MMP13表達明顯下降；HDAC-1、HDAC-2、HDAC-3及HDAC-8基因表達被干擾后，SW-1353細胞中IL-1誘導(dǎo)的MMP13的表達水平明顯下降。提示HDAC各亞型中發(fā)揮關(guān)節(jié)炎調(diào)控作用的主要是I型。
HDAC抑制劑的軟骨保護特性，可通過在OA體內(nèi)模型中觀察到的關(guān)節(jié)損傷減少來支持，并且可作為HDAC抑制劑治療的結(jié)果[15]?，F(xiàn)鮮有明確的HDAC抑制劑介導(dǎo)的細胞因子誘導(dǎo)MMP表達的報道。雖有研究表明TSA和丁酸鈉復(fù)合物可抑制HDAC的大部分家族經(jīng)典成員（除丁酸鈉對HDAC-6外），但目前尚不明確哪種HDACs與MMP表達及OA的進展有關(guān)[16]。能有效緩解OA的治療藥物較少，疾病末期患者唯一有效的治療方法是全關(guān)節(jié)置換[17]。廣譜HDAC抑制劑的軟骨保護作用表明，經(jīng)典的HDACs在MMP表達的調(diào)
控中發(fā)揮重要作用，在OA中也可能如此。雖然廣譜HDAC抑制劑對人類的毒性作用沒有化療藥物大，但仍不適合用于治療慢性疾病[18-19]。為了表明哪種HDACs是廣譜抑制劑軟骨保護作用的主要目標(biāo)，本研究采用2種已知的選擇性抑制劑：VPA和MS-275，與TSA在細胞單層和豬的鼻軟骨外植體試驗中進行比較。結(jié)果證實I型HDAC（HDAC-1、HDAC-2、HDAC-3、HDAC-8）被抑制劑抑制或I型HDACs特異性消耗均能抑制軟骨細胞MMP1及MMP13的表達，抑制PNC外植體GAG和膠原蛋白水平，說明I型HDAC抑制劑可能是通過抑制MMP、GAG和膠原蛋白的表達而發(fā)揮對軟骨退化的保護作用。
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