閔晶晶，顧群，陳琪，王小同

（1.湖州市第一人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，浙江 湖州 313000； 2.湖州市第一人民醫(yī)院 腎內(nèi)科，浙江 湖州313000；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 康復(fù)科，浙江 溫州 325027）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種常見的呼吸系統(tǒng)疾病。研究顯示COPD患者在表現(xiàn)肺功能障礙的同時，還存在著不同程度的認(rèn)知功能障礙[1-2]。慢性低O2高CO2是COPD發(fā)生發(fā)展的重要病理機(jī)制之一，我們在前期的研究中也發(fā)現(xiàn)慢性低O2高CO2模型大鼠存在著不同程度的學(xué)習(xí)記憶障礙，且與氧化應(yīng)激、炎癥、凋亡和線粒體損傷等密切相關(guān)[3-6]。線粒體生物合成是指在核DNA和線粒體DNA兩大基因組的協(xié)同作用下，細(xì)胞內(nèi)新的線粒體的合成過程。其過程非常復(fù)雜：除了合成mtDNA編碼的蛋白外，還包括合成新的細(xì)胞器結(jié)構(gòu)（包括合成和輸入核編碼的蛋白），組裝雙基因來源的衍生蛋白和mtDNA的復(fù)制[7]。過氧化物酶增殖激活受體輔助激活物1α（peroxisome proliferator-acti-vated re-ceptor γ coactivator-1α，PGC-1α）在線粒體生物合成中起著主導(dǎo)作用，它可以輔助激活核呼吸因子1/2（nuclear respiratory factors 1/2，NRF1/2）的轉(zhuǎn)錄，并作為線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（mitochondrial transcription factor A，TFAM）的啟動子，啟動線粒體生物合成，調(diào)控mtDNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元退行性疾病的發(fā)生與線粒體合成障礙密切相關(guān)，在阿爾茨海默病患者的神經(jīng)元細(xì)胞中存在著mtDNA的缺陷，并可導(dǎo)致線粒體電子傳遞鏈復(fù)合體COX的功能障礙[10]。本研究通過建立急慢性低O2高CO2大鼠模型，觀察大鼠學(xué)習(xí)記憶能力變化及海馬區(qū)線粒體形態(tài)改變，檢測PGC-1α、NRF-1、TFAM線粒體生物合成蛋白表達(dá)情況及mtDNA的含量，進(jìn)一步探討急慢性暴露方式對大鼠學(xué)習(xí)記憶及線粒體生物合成水平的影響及可能相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑和儀器：低O2高CO2氧艙（長沙華曦電子科技有限公司），Morris水迷宮（北京碩林苑科技有限公司），壓縮性高純度N2、壓縮性高純度CO2（溫州申鹿公司），透射電鏡（日本Hitachi公司），PGC-1α抗體、NRF-1抗體、TFAM（美國Santa Cruz Biotechnology公司），PVDF膜（德國Millipore公司），實時熒光定量PCR儀、SYBR Green染料（德國Roche公司）。ECL發(fā)光液、HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠二抗（杭州自弗德生物科技有限公司）。BCA蛋白濃度試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。Solution I配置：取0.5 mol/L EDTA 2 mL，1 mol/L Tris-HCl 2.5 mL，20%葡萄糖4.5 mL，用DDW定容為100 mL，高溫高壓滅菌后，4 ℃保存；每次使用前每50 mL的Solution I中加入2 mL的RNase A（20 mg/mL）。

1.1.2 實驗動物：48只SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量200～230 g，購自上海斯萊克公司，動物許可證號：SCXX（滬）2007-0005。按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為3組：對照組、急性組、慢性組，每組各16只。

1.2 方法

1.2.1 動物造模：急性組、慢性組大鼠置于常壓低O2高CO2氧艙內(nèi)進(jìn)行造模（O2濃度為9.0%～11.0%，CO2濃度為5.0%～6.0%），每天8 h，急性組造模3 d，慢性組造模4周，每周6 d；其余時間同對照組，于正常環(huán)境中（室溫20～23 ℃，相對濕度50%～70%）飼養(yǎng)，自然光照，大鼠可自由獲得食物和飲水。

1.2.2 Morris水迷宮實驗：連續(xù)進(jìn)行5 d，每天3次。水迷宮由一個直徑1.7 m、深40 cm的圓形水池組成，分為4個象限，水池里面有約36 cm深的黑色墨汁水，水溫維持在26 ℃左右。將大鼠頭朝池壁，分別從4個象限任選一個放入水中，若60 s后仍不能找到平臺，則系統(tǒng)自動默認(rèn)潛伏期為60 s，在第1、第2天若未找到則將其引導(dǎo)至平臺停留10 s，第3天開始不再引導(dǎo)。第6天進(jìn)行平臺搜索實驗，將平臺撤去，任選一個象限將大鼠放入水，其后2組大鼠均從該象限入水，觀察并記錄60 s內(nèi)大鼠穿越平臺的次數(shù)。

1.2.3 動物取材：將大鼠經(jīng)6%水合氯醛腹腔麻醉，0.9%氯化鈉溶液快速心臟灌注將血液沖凈后，置于冰盤上取腦，快速分離海馬-80 ℃冰箱保存。電鏡標(biāo)本經(jīng)0.9%氯化鈉溶液快速灌注后需4 ℃的4%多聚甲醛灌注固定再取海馬。

1.2.4 透射電鏡觀察線粒體：取大鼠海馬切成1 mm3的小塊，戊二醛磷酸緩沖液固定，常規(guī)脫水、浸透、包埋、染色，制成超薄的切片，在透射電鏡下觀察。

1.2.5 Western blot檢測蛋白含量：從-80 ℃冰箱取出大鼠海馬組織稱重，加入含1 mmol/L PMSF和1 mmol/L組織裂解液（RIPA）300～500 μL，RIPA:PMSF=99:1，放入研磨管充分研磨，置冰上裂解20 min，使充分裂解。轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，4 ℃，3 000 r/mim離心5 min。超聲裂解3次，每次5 s。低溫高速離心機(jī)4 ℃，12 000 r/mim 離心20 min，取上清，分裝，-80 ℃保存。留1管用BCA蛋白濃度試劑盒測濃度。加雙蒸水及Loading buffer配置成上樣體系。通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離等量的大鼠海馬蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，在室溫下用5%無脂奶粉將PVDF膜封閉2 h。然后將膜與各自的一抗在4 ℃溫育過夜，PGC-1α一抗（1:100），NRF-1、TFAM一抗（1:500），TBST洗膜5 min×6次，加HRP標(biāo)記的山羊抗兔或山羊抗鼠二抗（1:5 000），室溫孵育2 h，TBST洗膜5 min×6次，用ECL發(fā)光液覆蓋膜（每張約60 μL），曝光后進(jìn)行分析計算。

1.2.6 RT-PCR檢測mtDNA：將海馬標(biāo)本從-80 ℃冰箱取出，再加入4 mL 4 ℃預(yù)冷的Solution I，研磨管勻漿；勻漿液轉(zhuǎn)移至EP管，4 ℃，500 r/mim離心5 min；取上清液，4 ℃ 800 r/mim離心10 min。然后根據(jù)QIAGEN DNA（德國QIAGEN公司）提取試劑盒說明書進(jìn)行線粒體DNA提取。檢測線粒體DNA濃度后嚴(yán)格按照試劑盒要求進(jìn)行qPCR反應(yīng)液的配制，線粒體DNA拷貝數(shù)以線粒體編碼基因細(xì)胞色素b的拷貝數(shù)為代表。引物序列：上游5’-AAAGCCA CCTTGACCCGATT-3’，下游3’-GATTCGTAGGGCCGCGAT A-5’，以β-actin作為內(nèi)參，引物序列：上游5’-AGTG TGACGTTGACATCCGTA-3’，下游3’-CCAGAGCAGTAATCT CCTTCT-5’。反應(yīng)條件：預(yù)變性：95 ℃，120 s，1個循環(huán)；擴(kuò)增：95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)；溶解：95 ℃ 1 s，65 ℃ 15 s，共1個循環(huán)；冷卻：40 ℃ 30 s，共1個循環(huán)，采用△CT法計算mtDNA的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件，所有數(shù)據(jù)以±s表示。水迷宮潛伏期采用水迷宮重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析，其他數(shù)據(jù)組間比較均采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Morris水迷宮檢測低O2高CO2對大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響 圖1顯示了各組搜索平臺的路線。與對照組比，急性組大鼠每天訓(xùn)練的逃避潛伏期和游泳距離差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；慢性組的逃避潛伏期（P＜0.01）和游泳距離明顯長于對照組（P＜0.05）。在水迷宮實驗第6天的空間探索實驗中，與對照組比，急性組穿越平臺次數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），慢性組穿越平臺次數(shù)較急性組顯著減少（P＜0.05）。見表1。

2.2 透射電鏡觀察低O2高CO2對海馬區(qū)線粒體形態(tài)的影響 透射電鏡觀察顯示對照組線粒體雙層膜結(jié)構(gòu)完整，嵴清晰，內(nèi)容物飽滿。急性組大鼠海馬區(qū)線粒體雙層膜完整，結(jié)構(gòu)尚清晰，而慢性組大鼠海馬區(qū)線粒體膜出現(xiàn)腫脹，膜模糊不清，部分膜破裂，線粒體空泡變，嵴紊亂或疏松溶解，部分消失。見圖2。

圖1 各組大鼠在Morris水迷宮中搜索平臺的路線圖

表1 Morris水迷宮實驗逃避潛伏期、游泳距離、穿越平臺次數(shù)比較（每組16只，±s）

表1 Morris水迷宮實驗逃避潛伏期、游泳距離、穿越平臺次數(shù)比較（每組16只，±s）

與對照組比：aP＜0.05，bP＜0.01

組別 逃避潛伏期（s） 游泳距離（m） 穿越平臺次數(shù)對照組 24 063.39±3 772.68 14.57±2.24 3.91±1.16急性組 25 106.33±4 741.03 14.98±2.31 3.87±1.46慢性組 28 077.12±4 575.77a 17.87±2.70b 2.63±1.06a

2.3 低O2高CO2對海馬區(qū)線粒體生物合成相關(guān)蛋白表達(dá)影響 Western blot結(jié)果顯示急性組大鼠海馬PGC-1α蛋白水平較對照組明顯增加（P＜0.01），其下游級聯(lián)蛋白NRF-1和TFAM蛋白表達(dá)均較對照組表達(dá)增加（P＜0.05）；慢性組PGC-1α、NRF-1、TFAM表達(dá)較對照組減少（P＜0.01）（見圖3、表2）。

2.4 低O2高CO2對海馬區(qū)mtDNA拷貝數(shù)影響 實時定量PCR結(jié)果顯示，急性組mtDNA拷貝數(shù)（1.879±0.234）較對照組（0.998±0.002）增加（P＜0.01），慢性組mtDNA拷貝數(shù)（0.598±0.178）較對照組減少（P＜0.05）。

3 討論

線粒體功能障礙是退行性疾病的一個重要特點。細(xì)胞內(nèi)的線粒體并非靜止，其一直處于融合與分裂的動態(tài)變化之中。線粒體的平均壽命只有10 d左右，所以通過線粒體生物合成補(bǔ)充新的線粒體對于組織正常功能及應(yīng)激條件下細(xì)胞的適應(yīng)性至關(guān)重要。線粒體生物合成過程受到細(xì)胞內(nèi)外多個蛋白及信號通路的調(diào)控。有研究發(fā)現(xiàn)亨廷頓舞蹈病的患者出現(xiàn)了PGC-1α及其下游因子的下調(diào)[7]，而使用了重組人線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（recombinant-human mitochondrial transcription factorA，rhTFAM）的小鼠在旋轉(zhuǎn)棒上跑的距離是對照組的2倍[11]。

圖2 透射電鏡觀察各組海馬區(qū)線粒體結(jié)構(gòu)改變（箭頭所指為線粒體）

圖3 各組海馬組織PGC-1α、NRF-1、TFAM蛋白表達(dá)電泳圖

表2 3組大鼠海馬區(qū)線粒體生物合成相關(guān)蛋白表達(dá)（每組16只，±s）

表2 3組大鼠海馬區(qū)線粒體生物合成相關(guān)蛋白表達(dá)（每組16只，±s）

與對照組比：aP＜0.05，bP＜0.01

組別 PGC-1α NRF-1 TFAM對照組 1.609±0.261 1.076±0.169 1.064±0.142急性組 2.804±0.153b 2.016±0.129a 1.853±0.097a慢性組 0.751±0.186b 0.627±0.133b 0.673±0.094b

PGC-1α是調(diào)節(jié)線粒體生物合成的重要轉(zhuǎn)錄因子，其通過激活NRF1/2，進(jìn)而成為TFAM的啟動子，從而啟動線粒體基因的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。NRF-1的轉(zhuǎn)錄活性與許多核基因編碼的線粒體呼吸鏈復(fù)合物，亞鐵血紅素生物合成的酶，蛋白相關(guān)的線粒體輸入機(jī)制，線粒體核糖體蛋白及tRNA合酶等的合成有關(guān)[12]。而且NRF1和NRF2還調(diào)節(jié)著TFAM和轉(zhuǎn)錄因子B蛋白的轉(zhuǎn)錄，這兩者都是mtDNA轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的主要調(diào)控者[12]。雌激素相關(guān)受體（ERR-α、ERR-β、ERR-γ）是核受體超家族的成員，在激素信號下促進(jìn)線粒體生物合成。ERR-α控制著核基因編碼的線粒體相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄，這些因子參與了氧化磷酸化、脂肪酸氧化、三羧酸循環(huán)和線粒體的融合與分裂[13]。PGC-1α作為轉(zhuǎn)錄輔助激活因子，控制著線粒體的各類的轉(zhuǎn)錄因子，包括NRFs和ERRs[13]。在線粒體COX缺陷的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)過表達(dá)PGC-1α能緩解線粒體缺陷及誘導(dǎo)線粒體增殖[14]。此外，在線粒體復(fù)合物III和IV缺陷的人類細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)PGC-1α或PGC-1β的表達(dá)能明顯提高線粒體呼吸能力[15]。因此，PGC-1α被認(rèn)為是線粒體生物合成和功能的主要調(diào)控者。

研究證實線粒體功能缺陷是許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理基礎(chǔ)[16]。條件性的或突發(fā)事件導(dǎo)致的線粒體功能障礙，比如缺氧缺血性腦損傷會使得大腦能量代謝產(chǎn)物ROS大量釋放增加，從而加重神經(jīng)元損傷[16-17]，此時增加線粒體的數(shù)量來代償損傷線粒體的功能成為挽救殘存神經(jīng)元的關(guān)鍵。有研究在短暫性全腦缺血的大鼠中觀察到了線粒體的延伸，這是線粒體生物合成一個重要步驟[18]，而持續(xù)30 min的缺血則會引起mtDNA的減少[19]。本研究結(jié)果顯示，急性的低O2高CO2刺激增加了線粒體的生物合成，而長期暴露于低O2高CO2環(huán)境則引起了線粒體生物合成的減少。行為學(xué)實驗發(fā)現(xiàn)急性刺激尚未引起實驗大鼠的認(rèn)知功能，而4周的慢性暴露則引起了大鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙。這可能是在急性應(yīng)激下，細(xì)胞的需氧量增加，氧化磷酸化加速，ROS開始釋放增加。ROS的堆積可以激活線粒體上非特異通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔道開放并促使凋亡因子的釋放[20]。受到攻擊的線粒體啟動了一系列的自我保護(hù)機(jī)制，這其中包括啟動線粒體生物合成來增加線粒體的數(shù)量從而代償受損線粒體的功能，以此挽救受威脅的神經(jīng)元。因此在神經(jīng)元功能尚能維持的情況下，大鼠的學(xué)習(xí)記憶尚未受到影響。而在長期的慢性暴露過程中，機(jī)體需氧量增加，活性氧自由基不斷產(chǎn)生，神經(jīng)元細(xì)胞大量凋亡及壞死，過多線粒體的生成將有更多的能量消耗，進(jìn)一步威脅殘余神經(jīng)元的存活。同時，我們的研究也發(fā)現(xiàn)此時大鼠腦內(nèi)自噬的活性也很高，低氧下的自噬可以促進(jìn)受損線粒體的降解，并且可以抑制線粒體的生物合成來減少能量消耗[21]。所以我們推測以上各因素的共同影響導(dǎo)致了慢性組大鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙及生物合成的減少。

綜上，急性低O2高CO2環(huán)境尚未引起大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙，但卻能增加大鼠海馬區(qū)線粒體生物合成水平；而長期暴露低O2高CO2環(huán)境則導(dǎo)致大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降，且出現(xiàn)大鼠海馬區(qū)線粒體生物合成水平下降；因此線粒體生物合成水平的下降可能是長期低O2高CO2暴露下大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的原因之一。